Fortebio Octet定量簡(jiǎn)明指南

Octet?SystemsBiomolecularkinetics?Quantitation?ImpuritytestingOctet定量簡(jiǎn)明指南^MfortebioBiologiesbyMoilecularDevices

<Bfortebio*BiologiesbyMgl^cularDewiicesOctet定量簡(jiǎn)明指南（一步法濃度測(cè)定）一步法：用現(xiàn)有的傳感器，比如proA,proG,proL檢測(cè)IgG等物質(zhì)，通過(guò)分析物的結(jié)合速率來(lái)對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定。1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣品板，greinerPN655209,200ul一孔加入緩沖液和樣品等預(yù)濕板，greinierPN655209,200ul一孔加入預(yù)濕緩沖液!IIx../.；oc)ooooooor宓樣品板)0000。"OOOCC%10QQ0<20OQGQOC■k?將預(yù)濕板放到藍(lán)色的底盤中（A1位置卡?。?，然后將傳感器放到預(yù)濕孔相應(yīng)的位置的綠色盤（傳感器盤）上，然后將綠色盤插入到藍(lán)色盤上。!II■k?然后按照下圖將傳感器盤（凹面朝內(nèi)）和樣品板（A1位置右上角）放入儀器中，關(guān)好儀器門。注意：樣品板一定要緊貼在shaker上!！加樣注意點(diǎn)：1）預(yù)濕緩沖液，復(fù)性緩沖液，reference以及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液都應(yīng)該用分析物同樣的緩沖液或者基質(zhì)，所有緩沖液以及樣品的體積不得少于200ulo2）將樣品稀釋到檢測(cè)范圍中，比如1-500ug/m,稀釋液為fortebio公司的samplediluent緩沖液。配方為0.02%tween20,0.1%BSA,PBS,如果自配，不能保證其質(zhì)量。3）標(biāo)準(zhǔn)品不需要每個(gè)實(shí)驗(yàn)都做，如果分析物和實(shí)驗(yàn)條件一致（比如實(shí)驗(yàn)時(shí)間和緩沖液）可以調(diào)用以前的標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是傳感器必須是同一個(gè)批次4）建議每次實(shí)驗(yàn)加入數(shù)個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，比如100ug/ml，設(shè)定可接受范圍為90-110ug/ml。作為實(shí)驗(yàn)有效性的判定依據(jù)。比如某次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為80ug/ml，則說(shuō)明該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可信。5）再生緩沖液一般在pH1.5-2.0的10mM甘氨酸緩沖液2程序設(shè)定打開(kāi)儀器門前必須確定儀器在ready狀態(tài)（請(qǐng)檢查instrumentstatus窗口）。打開(kāi)操作軟件前請(qǐng)確認(rèn)儀器門關(guān)閉，在桌面上點(diǎn)擊，在wizard中點(diǎn)擊basicquantitationwithregenerationNewQjantiktionExperimentBasicQuanttatonaBasicQuantitationwitiRegen已「日ticinAdvancedQuantitatian然后點(diǎn)擊22.1樣品板和程序設(shè)定：在platedefinition中根據(jù)樣品的實(shí)際加樣位置設(shè)置樣品板Stepl:選中需要設(shè)置的孔，選中方式可以為1）拖鼠標(biāo)選擇某個(gè)區(qū)域2）單擊3）按ctrl連擊4）按shift選擇某個(gè)連續(xù)區(qū)段5）右擊cleardata去除點(diǎn)擊以下圖標(biāo)，選擇樣品的種類。St：±TLil；iLrdUriknowFLStandard:標(biāo)準(zhǔn)品Unkown:未知樣品、待測(cè)樣品St：±TLil；iLrdUriknowFLReference:陰性對(duì)照樣品Step2在右邊的表格中必須輸入標(biāo)準(zhǔn)品的濃度信息。以及dilutionfactor（稀釋倍數(shù)），sampleID等信息。可選：在assaysetting中設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)注意，一般不需要改動(dòng)這些參數(shù)。點(diǎn)擊assaysetting出現(xiàn)以下對(duì)話框As:ayParismciersA頌址心gAssa7paaiftetersBaacQuantiationssithRegeneratonAnbHHurrisnFab<HL(FABjwthrEoeneraaonHighsEnsitivitrassov「egt”前onProlehL-5tanda-drang=>l^tandartiAsaayl>4'Sin^Eana^teMulli口也司a/tERepicaleipeltar-fitirlice:RegeneraiioFi：NeiAralEabon:Tnrh.l叩4ShakeTpred

40D刁BLeindicatesabJlt+iassay.BelwBEfl羽waysteps:JPia<tihdlicinieritcitPotKtindlionsen±or±RegBr-fr^oncycles:J±1Quantitation,regeneration,Neutralization的時(shí)間和轉(zhuǎn)速Betweenassaysteps:設(shè)置再生的重復(fù)次數(shù)，如果設(shè)置為3，5秒的regeneration^秒的Neutralization，共3次循環(huán)Pre-conditionsensors:檢測(cè)第一列樣品前再生一次Post-conditionsensors:檢測(cè)最后一列樣品后再生一次2.2傳感器位置設(shè)定Stepl在sensorassignment中選擇傳感器位置。比如傳感器在第四列，則把第1列到第3列選中，按remove（或者右擊remove）即可。此時(shí)如果要選中第二列，則點(diǎn)擊illSensorTrayHReplacesensorsintrayafteruse12345E~3~9~~1112翱孌腹■□□□□□□□口貿(mào)恣恣［!□□□□□□□□翌幽固ECO□□□□□□/芯瑟日□口口口□□口口黝箴旎日□口口口口口口口躊藪固⑴□□□□□□□□faBCDEFGHLegend:口UnassignedsensorsMissingsensorsStep2:在右上角的以下對(duì)話框中選擇傳感器的重復(fù)使用次數(shù)，pre-condition/post-condition的次數(shù)不計(jì)入內(nèi)。RegenerationsTimessensorswillbereused:斗CApply可以在reviewexperiment里面，點(diǎn)擊箭頭，瀏覽整個(gè)實(shí)驗(yàn)。但是在這個(gè)界面里無(wú)法對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行修改。如果發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)誤，回到前面界面進(jìn)行修改。2.3Runexperiment設(shè)置Stepl目錄設(shè)置在下面的位置輸入原始數(shù)據(jù)的根目錄和子目錄Kineticsdatarepository:根目錄E>penrnentrUnname(SUbdireCtOrV)：子目錄(原始數(shù)據(jù)目錄)可選/DelatedewperimentstarlStartafter(s);頸：實(shí)驗(yàn)延遲時(shí)間，傳感器預(yù)濕需要10分鐘左右，從傳感器放入預(yù)濕溶液中開(kāi)始計(jì)算，如果傳感器在緩沖液中已經(jīng)泡了足夠長(zhǎng)時(shí)間，可以不使用這個(gè)步驟。/Shakesampleplatewhilewaiting延遲時(shí)是否樣品板震動(dòng)JSetplatetemperature實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置，一般在30度。Step2:設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始（點(diǎn)擊前必須保證儀器門關(guān)閉）。在點(diǎn)擊GO后，該方法文件以*.fmf的后綴放在原始數(shù)據(jù)文件夾中，可以通過(guò)fileopenmethodfile打開(kāi)。2.4實(shí)時(shí)曲線此時(shí)，會(huì)出現(xiàn)runningtimebindingchart，顯示實(shí)時(shí)的結(jié)合曲線，可以進(jìn)行以下操作。IQ七站實(shí)驗(yàn)停止。3結(jié)果分析打開(kāi)分析軟件打開(kāi)分析軟件Stepl保證loadeddata的quantitation中沒(méi)有其他數(shù)據(jù)，可以右擊quantitation，點(diǎn)擊removeall.E)-ij-LoaiedDatai|EineticsOpenExplorer...Remt>veAllMaskData...Step2在左下角找到需要處理的原始數(shù)據(jù)文件夾，在左上角雙擊打開(kāi)Step3在上面中點(diǎn)擊referencesubtractionaverage中的all/ReferenceSubtractionAverage□AllEorColuniR可選可以在右下的樣品表格中，1）修改濃度信息l'rUte11）修改濃度信息l'rUte1nAProteinAG4Pvi-i+ir.hl-Ti'1hu1寥1MT.-ri'HbU2）修改樣品的類型右擊改樣品，然后改變其類型。ChangetoStanderdChangetoUnknownChangeto-ControlChange危nIRe^fe-rre-nce*EditSc-nsqr/SampleInformartian]—SertCcjlor..rSetColorByGroupSrtColorEySizeColumn'sByTitleSize-Column-5EyDataSize-ColumnsE-yBothSetColumnDrdo-ri.1PrintPageSe*-tup..u.PrintPreview.?CopyToClipboardStep3獨(dú)suits進(jìn)入Results中Data獨(dú)suitsStep4選擇standardcurveequation一般為pointtopoint沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)必須首先導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，LoadEt：ELTLil：±l_沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)必須首先導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，LoadEt：ELTLil：±l_ils...點(diǎn)擊，選擇需要導(dǎo)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線文件（*.fsc）。Step5選擇bindingrateequation一般為initialslope有信號(hào)放大的方法選擇RequilibriumStep6確認(rèn)無(wú)誤后，點(diǎn)擊C=alcul：=LthEindirkgR：±te!每個(gè)孔的濃度會(huì)計(jì)算出來(lái)，列舉在右下的表格中。其中KnownConc.:已知濃度，僅對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品WellConc.：孔中樣品濃度CalculatedConc.：計(jì)算濃度，為孔中樣品濃度X稀釋倍數(shù)Residual：殘差，僅對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，即計(jì)算濃度和實(shí)際濃度的差值一般大于0.98r2：每個(gè)樣品的起始斜率的擬合度，反應(yīng)了該樣品的結(jié)果可信度，一般大于0.98可以選擇tablecolumn的wellconcentration在每個(gè)孔的位置對(duì)其濃度進(jìn)行標(biāo)識(shí)。如果需要保存標(biāo)準(zhǔn)曲線，點(diǎn)擊脆共如果需要保存標(biāo)準(zhǔn)曲線，點(diǎn)擊脆共火曲界?，保存一個(gè)格式為*.fsc的文件。Step7點(diǎn)擊我作RmwN,,,，導(dǎo)出報(bào)告。

補(bǔ)充：capture法定量方法設(shè)定（僅限于8.1以上的版本）Capture法定量介紹：先將抗體固化在傳感器上（一般為roA,proG,AMQ傳感器），然后結(jié)合分析物，通過(guò)分析物的結(jié)合速率對(duì)分析物濃度測(cè)定的方法。比一步法多出抗體固化的步驟。傳感器位置設(shè)置和分析方法是與一步法是相同的，這里只介紹操作軟件中步驟的設(shè)置。選擇AdvancedquantitationNewQuantitationNewQuantitationExperimentEasicQuantitatianEiasicQuantitationwithRegenerationaAdvancedQuantitation在platedefinition中的assaysetting中點(diǎn)擊modify然后在右邊的assayparameters中按照下面設(shè)置steptype,并點(diǎn)擊regenerationAssayParametersStepTypeTime(s)Shake(rpm)StepOptions：StepTypeTime(s)Shake(rpm)StepOptions：?CaptureAntibody120400@Buffer120400叱Reusebuffe0Sample]l20400|-OfflineoSinglearial^teMultipleanalpteReplicatespersensortype:1InsertRemove■/Regenerahon.…,Time閭；Shakespeed(rpm);Fiegeneration;510CONeutralization:5ioco:El已t同已已nsteps:Reqerierdticncycles：:3卻Pre-conditionsensors3/Post-conditionsensorsH一CaptureAntibod