中藥指紋圖譜的測(cè)定04年省藥分學(xué)術(shù)會(huì)課件

中藥指紋圖譜的測(cè)定

晁若冰

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院）整理ppt中藥指紋圖譜的測(cè)定

晁若冰

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院）整理1

一、測(cè)定中藥指紋圖譜的意義

中藥指紋圖譜的定義:

中藥指紋圖譜（Fingerprint）是經(jīng)光譜、色譜或其他方法測(cè)定得到的中藥組分群的特征圖譜，帶有綜合、宏觀、“模糊”的非線性特征，具有完整性和唯一性，是評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的重要手段之一。整理ppt一、測(cè)定中藥指紋圖譜的意義

2

測(cè)定中藥指紋圖譜的意義：

1.對(duì)保證用藥的安全、有效，保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定具有意義。

2.有利于中藥作用機(jī)理的進(jìn)一步深入研究。

3.可以促進(jìn)中藥工業(yè)現(xiàn)代化，中藥農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化。

4.可以促進(jìn)中藥走向世界。

整理ppt

測(cè)定中藥指紋圖譜的意義：

3

二.檢測(cè)方法

（一）色譜法

1.薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法分離效能高，操作簡(jiǎn)便，圖像直觀、形象，有多種顯色劑供選擇使用，可以作多樣品的平行分析，使用薄層掃描法可以得到定量的薄層指紋圖譜。

需使用標(biāo)準(zhǔn)的材料和條件，才能得到高質(zhì)量的、可重復(fù)的結(jié)果。

薄層色譜法多用于無(wú)紫外吸收，不能用HPLC測(cè)定的樣品，也可以作為HPLC的補(bǔ)充和佐證。

整理ppt二.檢測(cè)方法

（一）色譜法

4

二.檢測(cè)方法

2.高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法分離效能高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，適用范圍廣，是指紋圖譜測(cè)定應(yīng)用最多的方法。

使用的檢測(cè)器有：紫外檢測(cè)器，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，示差折光檢測(cè)器，質(zhì)譜（LC-MS）等。

多用反相色譜，也可以使用吸附色譜。如組分保留時(shí)間的差別很大，可以使用梯度洗脫。整理ppt

二.檢測(cè)方法

2.高5二.檢測(cè)方法

3.氣相色譜法(GC)氣相色譜法分離效能高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，有通用型的檢測(cè)器。主要用于揮發(fā)性樣品的測(cè)定。整理ppt二.檢測(cè)方法3.6二.檢測(cè)方法

4.毛細(xì)管電泳(HPCE)毛細(xì)管電泳分離效能高，靈敏度高，對(duì)樣品預(yù)處理的要求不太高。主要用于帶電荷組分的分離，特別是大分子物質(zhì)的分離，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等。也可以用于小分子的或一般有機(jī)組分的分離。整理ppt二.檢測(cè)方法4.毛細(xì)管電泳(HPC7二.檢測(cè)方法（二）光譜法1.紫外分光光度法是分子的電子光譜，反映生色團(tuán)的特征吸收，不能反映組分整體的情況。紫外光譜的形狀簡(jiǎn)單，易重疊，鑒別意義不大。整理ppt二.檢測(cè)方法（二）光譜法整理ppt8二.檢測(cè)方法

2.紅外光譜法（IR）是分子的振動(dòng)?轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，結(jié)構(gòu)的信息量較紫外光譜大，但對(duì)多成分的混合物，難以確定歸屬。整理ppt二.檢測(cè)方法2.紅外光譜法（IR）9二.檢測(cè)方法

3.核磁共振光譜(NMR)核磁共振光譜的專屬性強(qiáng)，信息量大，可以定量，是一種有前途的指紋圖譜的測(cè)定方法。整理ppt二.檢測(cè)方法3.核磁共振光譜(NM10三.色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求

（一）供試品的收集以承認(rèn)傳統(tǒng)的功能主治和長(zhǎng)期臨床驗(yàn)證結(jié)果為前提，使用的標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)為經(jīng)長(zhǎng)期臨床使用證明是安全、有效的樣品。要收集有代表性的供試品，至少10批。整理ppt三.色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求11（一）供試品的收集

1.原料藥材應(yīng)有穩(wěn)定和固定的來源，要進(jìn)行基原鑒定，并經(jīng)檢驗(yàn)符合中國(guó)藥典或國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。藥材的“批”是指相互獨(dú)立的供試品。應(yīng)有完整的采樣原始記錄。整理ppt（一）供試品的收集1.原料藥材整12（一）供試品的收集

2.半成品（提取物）用符合要求的藥材為原材料，用規(guī)范的工藝生產(chǎn)的半成品。應(yīng)有完整的制備和相關(guān)信息的記錄。整理ppt（一）供試品的收集2.半成品（提取物13（一）供試品的收集

3.成品用符合要求的半成品和規(guī)范的工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品。應(yīng)有完整的制備和相關(guān)信息的記錄。整理ppt（一）供試品的收集3.成品用符合14（二）參照物

參照物：是指紋圖譜測(cè)定用的參照物質(zhì)。主要用于色譜峰的辨認(rèn)，考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性。參照物一般選擇容易獲得的主要活性成分或指標(biāo)成分，一個(gè)或一個(gè)以上。如無(wú)參照物也可以用指紋圖譜中穩(wěn)定的色譜峰作為參照峰。

參照物應(yīng)有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)、名稱以及質(zhì)量考察的指標(biāo)。整理ppt（二）參照物整理ppt15（三）測(cè)定方法

1.HPLC色譜條件的選擇：首選反相HPLC。色譜柱：比較不同類型、不同牌號(hào)的色譜柱，選出適合的色譜柱，確定色譜柱的來源與規(guī)格。應(yīng)考慮使用多數(shù)實(shí)驗(yàn)普遍使用的色譜柱。流動(dòng)相：至少用三種不同組成的流動(dòng)相進(jìn)行比較，選出最適合的流動(dòng)相。如需要使用梯度洗脫，應(yīng)盡量采用線性梯度，并報(bào)告滯后時(shí)間。整理ppt（三）測(cè)定方法1.HPLC整16（三）測(cè)定方法

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：既要滿足主要有效成分的檢測(cè)，也要考慮盡可能多地檢出藥物中的組分。通過比較不同波長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果，選出合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。整理ppt（三）測(cè)定方法

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：既要滿足17（三）測(cè)定方法

2.TLC薄層板：多使用硅膠薄層板，聚酰胺膜薄層板或纖維素薄層板。正式測(cè)定時(shí)，應(yīng)使用有質(zhì)量保證的商品預(yù)制板或高效預(yù)制板。展開劑：至少比較三種不同的展開系統(tǒng)，選出最適合的展開系統(tǒng)。注意溫度和相對(duì)濕度對(duì)色譜行為的影響。整理ppt（三）測(cè)定方法

2.TLC整18（三）測(cè)定方法

顯色：可以結(jié)合使用通用型顯色劑和專屬顯色劑，以獲得整體的和不同類別組分的圖譜。圖象攝影：普通相機(jī)或數(shù)碼相機(jī)（200萬(wàn)象素以上），可以用積分軟件生成輪廓掃描圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)，也可用薄層掃描儀進(jìn)行積分和繪制輪廓圖譜。整理ppt（三）測(cè)定方法

顯色：可以結(jié)合使用通19（三）測(cè)定方法3.GC色譜柱：最好使用毛細(xì)柱，填充柱如能滿足要求也可以使用。通過比較不同極性的色譜柱，以確定最適合的色譜柱。柱溫：可使用恒溫或程序升溫，程序升溫宜采用線性程序，盡量避免復(fù)雜的多階程序其他測(cè)定條件：如進(jìn)樣器溫度、檢測(cè)器溫度、氣體流速等也應(yīng)確定。檢測(cè)器：盡量使用FID。整理ppt（三）測(cè)定方法3.GC整理ppt20（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立

指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立包括標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（對(duì)照模式）的建立和樣品指紋圖譜的測(cè)定及相似性的判斷。整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立指紋圖21（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立1.色譜峰的辨認(rèn)以相對(duì)保留時(shí)間為依據(jù)對(duì)色譜峰進(jìn)行辨認(rèn)，從原料藥材出發(fā)，找出具有指紋意義的峰進(jìn)行編號(hào)，缺峰缺號(hào)。整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立1.色22（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立2.相似性的評(píng)價(jià)的方法：相似性：指兩張指紋圖譜之間相似的程度。包括供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜之間的相似性，供試品指紋圖譜之間的相似性

整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立2.相23（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立相似性包括兩個(gè)方面：（1）色譜的整體面貌的相似性峰的數(shù)目、各峰峰面積的比例，即總體面貌是否相似。（2）總積分值的量化比較供試品與對(duì)照樣品或?qū)φ沼弥讣y圖譜總積分面積的差異（量的差異）。整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立相似性包括24（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立3.相似性的判斷方法（1）通過共有峰判斷（2）通過相似度判斷

整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立3.相似性的判斷方法整理ppt25

（1）通過共有峰判斷共有峰：不同樣品的指紋圖譜中所共有的指紋峰稱為共有峰。重疊率：

重疊率=2×共有峰數(shù)/供試品與對(duì)照樣品色譜峰總數(shù)重疊率不得低于一定的限度。供試品中共有峰與參照峰面積的比值與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，不得超過一定的限度。供試品中非共有峰的面積占總峰面積的比值，不得超過一定的限度。整理ppt（1）通過共有峰判斷整理ppt26（2）通過相似度判斷

對(duì)照模式的計(jì)算：選10批標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定指紋圖譜，計(jì)算對(duì)照模式。有兩種算法：①平均矢量平均矢量＝式中X1,X2,…Xn為矢量，代表第1，2…到第n個(gè)樣品的指紋圖譜。X1=（x1,1,x1,2,…x1m）整理ppt（2）通過相似度判斷27

②中位數(shù)矢量中位數(shù)矢量＝median(X1j,X2j….Xnj)中位數(shù)矢量是把對(duì)應(yīng)的矢量按大小排列，取處于當(dāng)中的矢量作為對(duì)照模式。如果樣品數(shù)為奇數(shù)時(shí)，中位數(shù)只有1個(gè)；樣品數(shù)為偶數(shù)時(shí)，中位數(shù)是當(dāng)中兩個(gè)數(shù)的平均值。推薦使用平均矢量。整理ppt②中位數(shù)矢量整理ppt28

相似度的計(jì)算：把供試品和對(duì)照模式的指紋圖譜作為兩個(gè)矢量，矢量(x1,x2,…,xn)代表樣品X的圖譜，其中xi代表樣品X圖譜中第i個(gè)色譜峰的峰面積；矢量(y1,y2,…,yn)代表對(duì)照模式Y(jié)的圖譜，yi代表對(duì)照模式圖譜中第i個(gè)色譜峰的峰面積?？梢杂孟旅鎯煞N方法表示相似度。整理ppt相似度的計(jì)算：整理ppt29①相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)＝相關(guān)系數(shù)越接近于1，兩個(gè)樣品越相似。整理ppt①相關(guān)系數(shù)整理ppt30

②夾角余弦夾角余弦＝夾角余弦是矢量(x1,x2,…,xn)和(y1,y2,…,yn)在矢量空間夾角的余弦。兩張圖譜可用多維空間中的兩個(gè)點(diǎn)來代表，兩個(gè)樣品越相似，則其夾角越小，夾角的余弦值越接近于1；當(dāng)兩個(gè)樣品等同時(shí)，夾角為0，夾角余弦等于1。整理ppt②夾角余弦整理ppt31若2個(gè)樣品中分別只有2個(gè)色譜峰，則每個(gè)樣品可以用二維的向量來表示。2個(gè)樣品可以表示為直角坐標(biāo)系中的兩個(gè)點(diǎn)，其夾角為α。

整理ppt若2個(gè)樣品中分別只有2個(gè)色譜峰，則每個(gè)樣品可32A(x1,x2)B(y1,y2)αβγ0整理pptA(x1,x2)B(y1,y2)αβγ0整理ppt33

α=β–γ

根據(jù)差角余弦定理，

cosα=cos(β–γ)=

cosβcosγ+sinβsinγ

==

=

一般相關(guān)系數(shù)或夾角余玄在0.9－1.0之間，相似度符合要求。

整理pptα=β–γ

34（六）方法的考察

1．色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)一般按參照物計(jì)算。包括：柱效，主要色譜峰的分離度。

2．精密度包括日內(nèi)精密度，日間精密度，重復(fù)性。計(jì)算保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值，也可以計(jì)算一組測(cè)定結(jié)果的相似度。

3．耐用性使用三根不同的色譜柱進(jìn)行比較。

整理ppt（六）方法的考察

1．色譜系統(tǒng)適35（七）應(yīng)用示例

1.丹參注射液指紋圖譜的測(cè)定

色譜條件：Luna5uC18(2)柱，流動(dòng)相A：水-冰醋酸（100∶0.8）；流動(dòng)相B:乙腈-冰醋酸（100∶0.8），用梯度洗脫。280nm檢測(cè)。

整理ppt（七）應(yīng)用示例

1.丹參注射液指紋圖36整理ppt整理ppt37整理ppt整理ppt38整理ppt整理ppt39整理ppt整理ppt40（七）應(yīng)用示例

2.沙棘指紋圖譜的測(cè)定

色譜條件：Shim-packVP-ODS柱，流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.4%磷酸水溶液，用梯度洗脫，360nm檢測(cè)。

整理ppt（七）應(yīng)用示例

2.沙41整理ppt整理ppt42整理ppt整理ppt433.中藥枳殼的化學(xué)模式識(shí)別

枳殼供試液制備精密稱取不同來源的藥材粉末(過4號(hào)篩)各2．0g，精密加入甲醇50ml，稱定重量，冷浸1h，加熱超聲20min，靜置冷卻，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，定容?ml，即得。

整理ppt3.中藥枳殼的化學(xué)模式識(shí)別

枳殼供44精密吸取上述枳殼供試液各4μl，分別用自動(dòng)點(diǎn)樣儀成條帶狀點(diǎn)樣于硅膠G60預(yù)制板上，在相對(duì)濕度65％的調(diào)節(jié)缸中放置1h，取出，放入雙槽展開缸中，以氯仿—甲醇—乙酸(75：25：5)為展開劑，展開，展距約15cm。取出薄層板，晾干，以2％三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，110℃加熱5min，使斑點(diǎn)清晰。

整理ppt精密吸取上述枳殼供試液各4μl，分別用自動(dòng)點(diǎn)45將顯色后的薄層板置于薄層色譜掃描儀中掃描，光束狹縫：6.00×0.45mm；掃描速度：20mm/s；分辨率：50μm/step；掃描波長(zhǎng)：300nm；掃描燈：D2；掃描模式：熒光；濾鏡：K400。經(jīng)過對(duì)11批枳殼樣品薄層掃描圖的分析比較和判斷，確定了能體現(xiàn)枳殼藥材共性、可對(duì)其進(jìn)行有效鑒別的11個(gè)特征峰，這11個(gè)特征峰的Rf值分別為0.05、0.11、0.17、0.21、0.28、0.36、0.41、0．88、0.91、0.94、0.97。

整理ppt將顯色后的薄層板置于薄層色譜掃描儀中掃描，光46整理ppt整理ppt47整理ppt整理ppt484.雙黃連膠囊的X-射線衍射指紋圖譜

實(shí)驗(yàn)儀器：日本理學(xué)RigakuD/max—2400粉末x射線衍射儀。實(shí)驗(yàn)條件為：CuKal輻射，石墨單色器，管壓40kV，管流150mA，2θ掃描范圍3°~60°，掃描速度8°/min，步長(zhǎng)0.02°。

整理ppt4.雙黃連膠囊的X-射線衍射指紋圖譜

49整理ppt整理ppt50整理ppt整理ppt51

參考文獻(xiàn)

1.中藥注射劑色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指南國(guó)家藥典委員

會(huì)，國(guó)藥典發(fā)（2002）第009號(hào)

2.謝培山.中藥制劑色譜指紋圖譜鑒別，中成藥，2000，22

（6）

3.黃黠.丹參藥材和丹參指紋圖譜的研究，四川大學(xué)華西藥學(xué)

院研究生論文

4.陳雛.川西高原產(chǎn)沙棘植物資源及生藥學(xué)研究，四川大學(xué)華

西藥學(xué)院研究生論文

5.蘇薇薇，等.中藥枳殼的化學(xué)模式識(shí)別研究，中藥材，

2002，25（10）

6.商素琴，等.雙黃連膠囊的X-射線衍射指紋圖譜鑒定，中草

藥，2002，33（11）

整理ppt

52中藥指紋圖譜的測(cè)定

晁若冰

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院）整理ppt中藥指紋圖譜的測(cè)定

晁若冰

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院）整理53

一、測(cè)定中藥指紋圖譜的意義

中藥指紋圖譜的定義:

中藥指紋圖譜（Fingerprint）是經(jīng)光譜、色譜或其他方法測(cè)定得到的中藥組分群的特征圖譜，帶有綜合、宏觀、“模糊”的非線性特征，具有完整性和唯一性，是評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的重要手段之一。整理ppt一、測(cè)定中藥指紋圖譜的意義

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測(cè)定中藥指紋圖譜的意義：

1.對(duì)保證用藥的安全、有效，保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定具有意義。

2.有利于中藥作用機(jī)理的進(jìn)一步深入研究。

3.可以促進(jìn)中藥工業(yè)現(xiàn)代化，中藥農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化。

4.可以促進(jìn)中藥走向世界。

整理ppt

測(cè)定中藥指紋圖譜的意義：

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二.檢測(cè)方法

（一）色譜法

1.薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法分離效能高，操作簡(jiǎn)便，圖像直觀、形象，有多種顯色劑供選擇使用，可以作多樣品的平行分析，使用薄層掃描法可以得到定量的薄層指紋圖譜。

需使用標(biāo)準(zhǔn)的材料和條件，才能得到高質(zhì)量的、可重復(fù)的結(jié)果。

薄層色譜法多用于無(wú)紫外吸收，不能用HPLC測(cè)定的樣品，也可以作為HPLC的補(bǔ)充和佐證。

整理ppt二.檢測(cè)方法

（一）色譜法

56

二.檢測(cè)方法

2.高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法分離效能高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，適用范圍廣，是指紋圖譜測(cè)定應(yīng)用最多的方法。

使用的檢測(cè)器有：紫外檢測(cè)器，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，示差折光檢測(cè)器，質(zhì)譜（LC-MS）等。

多用反相色譜，也可以使用吸附色譜。如組分保留時(shí)間的差別很大，可以使用梯度洗脫。整理ppt

二.檢測(cè)方法

2.高57二.檢測(cè)方法

3.氣相色譜法(GC)氣相色譜法分離效能高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，有通用型的檢測(cè)器。主要用于揮發(fā)性樣品的測(cè)定。整理ppt二.檢測(cè)方法3.58二.檢測(cè)方法

4.毛細(xì)管電泳(HPCE)毛細(xì)管電泳分離效能高，靈敏度高，對(duì)樣品預(yù)處理的要求不太高。主要用于帶電荷組分的分離，特別是大分子物質(zhì)的分離，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸等。也可以用于小分子的或一般有機(jī)組分的分離。整理ppt二.檢測(cè)方法4.毛細(xì)管電泳(HPC59二.檢測(cè)方法（二）光譜法1.紫外分光光度法是分子的電子光譜，反映生色團(tuán)的特征吸收，不能反映組分整體的情況。紫外光譜的形狀簡(jiǎn)單，易重疊，鑒別意義不大。整理ppt二.檢測(cè)方法（二）光譜法整理ppt60二.檢測(cè)方法

2.紅外光譜法（IR）是分子的振動(dòng)?轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，結(jié)構(gòu)的信息量較紫外光譜大，但對(duì)多成分的混合物，難以確定歸屬。整理ppt二.檢測(cè)方法2.紅外光譜法（IR）61二.檢測(cè)方法

3.核磁共振光譜(NMR)核磁共振光譜的專屬性強(qiáng)，信息量大，可以定量，是一種有前途的指紋圖譜的測(cè)定方法。整理ppt二.檢測(cè)方法3.核磁共振光譜(NM62三.色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求

（一）供試品的收集以承認(rèn)傳統(tǒng)的功能主治和長(zhǎng)期臨床驗(yàn)證結(jié)果為前提，使用的標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)為經(jīng)長(zhǎng)期臨床使用證明是安全、有效的樣品。要收集有代表性的供試品，至少10批。整理ppt三.色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求63（一）供試品的收集

1.原料藥材應(yīng)有穩(wěn)定和固定的來源，要進(jìn)行基原鑒定，并經(jīng)檢驗(yàn)符合中國(guó)藥典或國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。藥材的“批”是指相互獨(dú)立的供試品。應(yīng)有完整的采樣原始記錄。整理ppt（一）供試品的收集1.原料藥材整64（一）供試品的收集

2.半成品（提取物）用符合要求的藥材為原材料，用規(guī)范的工藝生產(chǎn)的半成品。應(yīng)有完整的制備和相關(guān)信息的記錄。整理ppt（一）供試品的收集2.半成品（提取物65（一）供試品的收集

3.成品用符合要求的半成品和規(guī)范的工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品。應(yīng)有完整的制備和相關(guān)信息的記錄。整理ppt（一）供試品的收集3.成品用符合66（二）參照物

參照物：是指紋圖譜測(cè)定用的參照物質(zhì)。主要用于色譜峰的辨認(rèn)，考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性。參照物一般選擇容易獲得的主要活性成分或指標(biāo)成分，一個(gè)或一個(gè)以上。如無(wú)參照物也可以用指紋圖譜中穩(wěn)定的色譜峰作為參照峰。

參照物應(yīng)有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)、名稱以及質(zhì)量考察的指標(biāo)。整理ppt（二）參照物整理ppt67（三）測(cè)定方法

1.HPLC色譜條件的選擇：首選反相HPLC。色譜柱：比較不同類型、不同牌號(hào)的色譜柱，選出適合的色譜柱，確定色譜柱的來源與規(guī)格。應(yīng)考慮使用多數(shù)實(shí)驗(yàn)普遍使用的色譜柱。流動(dòng)相：至少用三種不同組成的流動(dòng)相進(jìn)行比較，選出最適合的流動(dòng)相。如需要使用梯度洗脫，應(yīng)盡量采用線性梯度，并報(bào)告滯后時(shí)間。整理ppt（三）測(cè)定方法1.HPLC整68（三）測(cè)定方法

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：既要滿足主要有效成分的檢測(cè)，也要考慮盡可能多地檢出藥物中的組分。通過比較不同波長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果，選出合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。整理ppt（三）測(cè)定方法

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：既要滿足69（三）測(cè)定方法

2.TLC薄層板：多使用硅膠薄層板，聚酰胺膜薄層板或纖維素薄層板。正式測(cè)定時(shí)，應(yīng)使用有質(zhì)量保證的商品預(yù)制板或高效預(yù)制板。展開劑：至少比較三種不同的展開系統(tǒng)，選出最適合的展開系統(tǒng)。注意溫度和相對(duì)濕度對(duì)色譜行為的影響。整理ppt（三）測(cè)定方法

2.TLC整70（三）測(cè)定方法

顯色：可以結(jié)合使用通用型顯色劑和專屬顯色劑，以獲得整體的和不同類別組分的圖譜。圖象攝影：普通相機(jī)或數(shù)碼相機(jī)（200萬(wàn)象素以上），可以用積分軟件生成輪廓掃描圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)，也可用薄層掃描儀進(jìn)行積分和繪制輪廓圖譜。整理ppt（三）測(cè)定方法

顯色：可以結(jié)合使用通71（三）測(cè)定方法3.GC色譜柱：最好使用毛細(xì)柱，填充柱如能滿足要求也可以使用。通過比較不同極性的色譜柱，以確定最適合的色譜柱。柱溫：可使用恒溫或程序升溫，程序升溫宜采用線性程序，盡量避免復(fù)雜的多階程序其他測(cè)定條件：如進(jìn)樣器溫度、檢測(cè)器溫度、氣體流速等也應(yīng)確定。檢測(cè)器：盡量使用FID。整理ppt（三）測(cè)定方法3.GC整理ppt72（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立

指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立包括標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（對(duì)照模式）的建立和樣品指紋圖譜的測(cè)定及相似性的判斷。整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立指紋圖73（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立1.色譜峰的辨認(rèn)以相對(duì)保留時(shí)間為依據(jù)對(duì)色譜峰進(jìn)行辨認(rèn)，從原料藥材出發(fā)，找出具有指紋意義的峰進(jìn)行編號(hào)，缺峰缺號(hào)。整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立1.色74（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立2.相似性的評(píng)價(jià)的方法：相似性：指兩張指紋圖譜之間相似的程度。包括供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜之間的相似性，供試品指紋圖譜之間的相似性

整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立2.相75（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立相似性包括兩個(gè)方面：（1）色譜的整體面貌的相似性峰的數(shù)目、各峰峰面積的比例，即總體面貌是否相似。（2）總積分值的量化比較供試品與對(duì)照樣品或?qū)φ沼弥讣y圖譜總積分面積的差異（量的差異）。整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立相似性包括76（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立3.相似性的判斷方法（1）通過共有峰判斷（2）通過相似度判斷

整理ppt（四）色譜指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的建立3.相似性的判斷方法整理ppt77

（1）通過共有峰判斷共有峰：不同樣品的指紋圖譜中所共有的指紋峰稱為共有峰。重疊率：

重疊率=2×共有峰數(shù)/供試品與對(duì)照樣品色譜峰總數(shù)重疊率不得低于一定的限度。供試品中共有峰與參照峰面積的比值與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，不得超過一定的限度。供試品中非共有峰的面積占總峰面積的比值，不得超過一定的限度。整理ppt（1）通過共有峰判斷整理ppt78（2）通過相似度判斷

對(duì)照模式的計(jì)算：選10批標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定指紋圖譜，計(jì)算對(duì)照模式。有兩種算法：①平均矢量平均矢量＝式中X1,X2,…Xn為矢量，代表第1，2…到第n個(gè)樣品的指紋圖譜。X1=（x1,1,x1,2,…x1m）整理ppt（2）通過相似度判斷79

②中位數(shù)矢量中位數(shù)矢量＝median(X1j,X2j….Xnj)中位數(shù)矢量是把對(duì)應(yīng)的矢量按大小排列，取處于當(dāng)中的矢量作為對(duì)照模式。如果樣品數(shù)為奇數(shù)時(shí)，中位數(shù)只有1個(gè)；樣品數(shù)為偶數(shù)時(shí)，中位數(shù)是當(dāng)中兩個(gè)數(shù)的平均值。推薦使用平均矢量。整理ppt②中位數(shù)矢量整理ppt80

相似度的計(jì)算：把供試品和對(duì)照模式的指紋圖譜作為兩個(gè)矢量，矢量(x1,x2,…,xn)代表樣品X的圖譜，其中xi代表樣品X圖譜中第i個(gè)色譜峰的峰面積；矢量(y1,y2,…,yn)代表對(duì)照模式Y(jié)的圖譜，yi代表對(duì)照模式圖譜中第i個(gè)色譜峰的峰面積?？梢杂孟旅鎯煞N方法表示相似度。整理ppt相似度的計(jì)算：整理ppt81①相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)＝相關(guān)系數(shù)越接近于1，兩個(gè)樣品越相似。整理ppt①相關(guān)系數(shù)整理ppt82

②夾角余弦夾角余弦＝夾角余弦是矢量(x1,x2,…,xn)和(y1,y2,…,yn)在矢量空間夾角的余弦。兩張圖譜可用多維空間中的兩個(gè)點(diǎn)來代表，兩個(gè)樣品越相似，則其夾角越小，夾角的余弦值越接近于1；當(dāng)兩個(gè)樣品等同時(shí)，夾角為0，夾角余弦等于1。整理ppt②夾角余弦整理ppt83若2個(gè)樣品中分別只有2個(gè)色譜峰，則每個(gè)樣品可以用二維的向量來表示。2個(gè)樣品可以表示為直角坐標(biāo)系中的兩個(gè)點(diǎn)，其夾角為α。

整理ppt若2個(gè)樣品中分別只有2個(gè)色譜峰，則每個(gè)樣品可84A(x1,x2)B(y1,y2)αβγ0整理pptA(x1,x2)B(y1,y2)αβγ0整理ppt85

α=β–γ

根據(jù)差角余弦定理，

cosα=cos(β–γ)=

cosβcosγ+sinβsinγ

==

=

一般相關(guān)系數(shù)或夾角余玄在0.9－1.0之間，相似度符合要求。

整理pptα=β–γ

86（六）方法的考察

1．色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)一般按參照物計(jì)算。包括：柱效，主要色譜峰的分離度。

2．精密度包括日內(nèi)精密度，日間精密度，重復(fù)性。計(jì)算保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值，也可以計(jì)算一組測(cè)定結(jié)果的相似度。

3．耐用性使用三根不同的色譜柱進(jìn)行比較。

整理ppt（六）方法的考察

1．色譜系統(tǒng)適87（七）應(yīng)用示例

1.丹參注射液指紋圖譜的測(cè)定

色譜條件：Luna5uC18(2)柱，流動(dòng)相A：水-冰醋酸（100∶0.8）；流動(dòng)相B:乙腈-冰醋酸（100∶0.8），用梯度洗脫。280nm檢測(cè)。

整理ppt（七）應(yīng)用示例