著絲粒的組裝和功能的表觀基因組學

學號：20095072011學年論文（設計）（本科）學院生命科學學院 專業(yè)生物技術 年級 姓名 論文（設計）題目著絲粒組裝和功能的表觀基因組學指導教師 職稱教授 成績 2012年6月1日

學年論文（設計）成績評定表評 語成績：指導教師（簽字）：200年月 日學院意見：學院院長（簽名）：200年月 日著絲粒組裝和功能的表觀基因組學姓名：程滿 學號：20095072011院系：生命科學 專業(yè)：生物技術指導老師：袁紅雨職稱：副教授摘要:著絲粒是一個復雜的染色體位點，在細胞分裂中，這一位點上形成了動粒，并且，微管連接其上。著絲粒本身包含了基因組的和序列非依賴性的(表觀遺傳)的機制。目前關于著絲粒的形成和解離模型已經(jīng)從來自異常的染色體和人工染色體的研究中被提出，例如這些異常的和人工的染色體有新著絲粒、人工染色體、雙著絲粒染色體。最近的研究高度關注以組蛋白H3的變異型CENP-A為標志的獨特的染色質，傳統(tǒng)的染色質(異染色質和常染色質)，和著絲粒在活性和失活期間的轉錄。這些進展加深了我們對于著絲粒的定義和它在各種基因組和染色質背景下的作用的認識。關鍵詞:著絲粒;表觀基因組學；著絲粒形成決定；Abstract:Thecentromereisacomplexchromosomallocuswherethekinetochoreisformedandmicrotubulesattachduringthedivision.Centromereidentityinvolvesbothgenomicandsequence-independence(epigenetic)mechanisms.Currentmodelsforhowcentromeresareformedand,conversely,turnedoffhaveemergedfromstudiesofunusualorengineeredchromosomes,suchastheneocentromeres,artificialchromosome,anddicentricchromosomes.RecentstudieshavehighlightedtheimportantofuniquechromatinmarkedbythehistoneH3varientCENP-A,classicalchromatin(heterochromatinandeuchromatin),andtranscriptionduringcentromereactivityandinactivity.Theseadvancehavedeepenedourviewofwhatdefinesacentromereandhowitbehavesinvariousgenomicandchromatincontests.KeyWords:centromere;epigenomics;centromerespecification;引言著絲粒是每一個染色體中的一個必不可少的區(qū)域，它是有絲分裂和減數(shù)分裂中遺傳物質精確分離必需的元件。它為多蛋白復合體的動粒提供了一個附著的平臺，在減數(shù)分裂中紡錘體微管連接在動粒上來指導染色體在細胞減數(shù)分裂中的移動。這使得著絲粒在細胞分裂染色體分離中扮演著一個重要的保守的角色，在真核細胞著絲粒的結構、序列和功能上有令人吃驚的多樣性。然而，大多數(shù)真核哺乳動物是以著絲粒特異性組蛋白H3的變異體CENP-A為特征的。最近在多種物種中，這種蛋白的性質和它在著絲粒形成原因方面的作用已經(jīng)被重新闡述［2,3］。在芽殖酵母中，僅有的一個著絲粒的顯著特征是有一個?125bp的DNA元件,它組裝成一個簡單的Cse4核小體，捕獲一個單體微管［4］。其他的生物體中，微管缺乏這種序列特異性，即便是在相同生物體的不同染色體中，著絲粒DNA的特性也是不同的。多細胞真核生物的著絲粒常常定位于重復序列或者其附近的區(qū)域，通常稱為衛(wèi)星DNA⑸。在玉米和水稻中，轉座元件或者反轉錄轉座元件經(jīng)常散布在衛(wèi)星DNA中。人類的著絲粒是有富含AT序列的被稱為a-衛(wèi)星DNA的重復序列構成67］。a-衛(wèi)星是以171bp單體為基礎的，縱行排列成一種高度有序的陣列，多達0.2-5Mb。特定數(shù)目的單體產(chǎn)生一個高度有序的重復(HOR),HOR再重復成百上千次。人類體內(nèi)染色體，CENP-A定位在a-衛(wèi)星DNA上。但是，盡管CENP-A被限定在一個給定的幾百萬堿基對陣列的一部分，但它的結合位點并沒有序列特異性。CENP-A并不結合在異常的、單體的a-衛(wèi)星DNA或者是自發(fā)形成的的包含了兩個a-衛(wèi)星DNA區(qū)域的雙著絲粒人類染色體的失活著絲粒［8,9］。新著絲粒或者異常著絲?？梢栽谌旧w的其他位置從頭形成denovo,該位點通常不是重復DNA】10，11］。通過在各種生物體內(nèi)的和變異的著絲粒的研究表明,染色體的環(huán)境一著絲粒DNA和特定表觀遺傳修飾一對著絲粒的形成原因和穩(wěn)定產(chǎn)生重要的影響這一事實已經(jīng)很明白了。但最近本的問題仍然沒有解決。哪種基因組序列和染色質的特征是對著絲粒的建立和維持是必須的？過去幾年，從對酵母到人類的研究已經(jīng)提出了這些問題。在這篇總論中，我們繼續(xù)討論在人類中一系列的發(fā)現(xiàn)，但也提到其他生物的研究，它強調(diào)了著絲粒的形成和失活的基因組的和表觀遺傳的方面。一、著絲粒的建立過去十幾年中包括人類人工染色體進展的染色體工程，在解釋DNA序列和基因組的組成對著絲粒形成原因的作用中，已經(jīng)變成為一種重要的方法。在這種方法中，把a-衛(wèi)星DNA引入到人類和小鼠的細胞。一些a-衛(wèi)星DNA單體包含了一個171bp的被CENP-B識別的典型結構，被稱為CENP-B盒。在denovo著絲粒的組裝中，CENP-B對CENP-A的募集和著絲粒核小體的定位有重要的的作用。然而，在人類Y染色體，上a-衛(wèi)星DNA缺少CENP-B盒，盡管所有其他著絲粒蛋白都被募集到這一點，但是CENP-B并不與之相連。新著絲粒缺少CENP-B盒，非活性雙著絲粒a-衛(wèi)星DNA陣列通常維持CENP-B的結合。人類人工染色體是來自克隆或者人造a-衛(wèi)星DNA放入有序列組裝活性功能的著絲粒而形成的。然而，有效地人工染色體的形成需要至少3Okb的a-衛(wèi)星DNA和CENP-B盒的存在。a-衛(wèi)星DNA缺少CENP-B盒或者突變的CENP-B盒，常染色體DNA或者是Y的白斑樣的DNA都不能形成人造染色體。這些結果表明，CENP-B對著絲粒的形成是非常重要的，并且a-衛(wèi)星DNA對denovoCENP-A的組裝來說是更好地序列。然而，并不是所有的a-衛(wèi)星DNA序列都可以形成denove著絲粒。這在C．a(chǎn)lbicans中可證實。當裸露的a-衛(wèi)星DNA在含有CENP-A存在的情況下，引進著絲粒序列在C.albicans中不能產(chǎn)生denove?？傊?，這些研究表明，單獨的DNA序列對著絲粒的建立或者功能并不是充分的，并且表明，其建立和功能涉及表觀遺傳或基于染色質的機制。二、著絲粒有獨特的染色質組織樣式正常人類著絲粒的染色質環(huán)境的研究是一個復雜的工作，因為它高度的同源性、各區(qū)域重復特性和非同源著絲粒共有的序列家族。CENPS只在a-衛(wèi)星DNA陣列高度有序的部分組裝，使得一些以分子為基礎的方法更困難，比如鑒定著絲粒區(qū)長序列染色體的組成的染色質免疫沉淀(ChIP)實驗。在人類和果蠅中，著絲粒染色質被組織成CENP-A核小體，它中間散布有H3K4me2核小體，盡管H3K4me2的含量很低。玉米著絲粒也富含H3K9me2和H3K9me3核小體，但只有很低水平的H3K9me2。水稻CENH3的結構域散布在H3K27me1。很明顯，著絲粒染色質的排布在各種不同的生物中有差異。在著絲粒染色質區(qū)組蛋白修飾的這些不同可能由于對那些大區(qū)域著絲粒重復特性對技術和解決方法的限制。確實，水稻著絲粒高水平的解決方案的研究表明著絲?；钚曰蛲琀3K4me2和H4ac的豐富程度有關。水稻著絲粒的組織形式是由作為常染色體小塊區(qū)域被H3K9me2區(qū)域包圍形成的。在酵母和哺乳動物的核分裂中，著絲粒染色質和纏繞的異染色質的界限更清晰。這已經(jīng)形成了支持真核生物著絲粒的主域組織模型。三、通過新著絲粒研究著絲粒的形成規(guī)定和組織方式比如新著絲粒這樣的非典型著絲粒也強調(diào)著絲粒形成原因和染色質組織的復雜性。自從1993年新著絲粒報道以來，幾乎有100種已經(jīng)被鑒定，很多來自染色體上相似的區(qū)域，比如，3q,8q,13q,15q。乍一看，這些研究表明denovo著絲粒的形成有很多“熱點”，然而，精確的幾種新著絲粒CENP-A的結合區(qū)域圖譜表明，即便在許多相同的基因組區(qū)段，CENP-A同不同的DNA序列相連。而且在那些新著絲粒CENP-A結合域的大小從~100-464kb不等，這強調(diào)了CENP-A染色質的適應性。更令人困惑的是在新著絲粒中缺乏相同的染色質組織形式。在模型Mardel新著絲粒中，和人類的常染色質的組織形式相似，含有CENP-A的區(qū)域散布有H3組蛋白結合結構域。然而，這個相同的特征在幾個13q的新著絲粒中并沒有發(fā)現(xiàn)。相反，每一個有一個CENP-A的主域結構域，它和CENP-A的次主域結構域是通過?60-150kb來分開的，盡管主域結構域和次主域結構域在相同的13q基因組中間隔是不同的。Mardel新著絲粒有一個小的異染色質的結構域，以HP1稍微豐富而得名，定位于距CENP-A結構域800kb區(qū)。相反，只有1/3的13q新著絲粒有一個小的異染色質區(qū)域。令人吃驚的是，在新著絲粒中缺乏共同的染色質環(huán)境表明在denovo著絲粒組裝周圍更高水平的可變性，這使得另外的關于基因組的和表觀遺傳在新著絲粒形成位點作用的提出。是DNA序列還是染色質的特征使得這個區(qū)域有利于新著絲粒的形成？在人類細胞中，新著絲粒的形成是由基因決定的還是表觀遺傳決定的，也許還是因為在染色體分離期間，CENP-A過度表達還是通過把染色質因子引導到特定的DNA序列上來創(chuàng)造一個特定的染色體環(huán)境來決定。四、著絲粒有一個RNA組分轉錄一直同遺傳因子的結構域相聯(lián)系，但很顯然，非編碼區(qū)參與基因組的穩(wěn)定和染色體的結構。一系列的證據(jù)表明，RNA和轉錄是在著絲粒結構和功能的正常部分。活性著絲粒的基因，包括新著絲粒、植物中的常染色體著絲粒和人工染色體都被轉錄。人類人工染色體包含了了一套a-衛(wèi)星DNA序列它被新著絲粒序列所打斷,CENP-A同a-衛(wèi)星DNA和包含有轉錄選擇標記的新著絲粒所聯(lián)系。Madel新著絲粒的CENP-A域的一個L1反轉錄位點不僅活躍轉錄，而且他的轉錄是CENP結合和染色體穩(wěn)定所必需的。另外，在新著絲粒的染色質邊界，轉錄活性小塊區(qū)域同亞甲基聯(lián)系，在這一區(qū)域的5個基因的轉錄已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，包括一個CENP-A結合域的基因。非編碼區(qū)也是著絲粒的一部分。它首次在酵母S.pombe和分裂中被建立，它的重復纏繞的CENP-A結構域被轉錄，但這對于多種生物的著絲粒伴侶結構域也是適應的。RNAi途徑進行轉錄來建立和維持一個異染色體。而且，在S.pombe易染色體自身需要denovo著絲粒/CENP-A的組裝。CENP-A自身區(qū)域的轉錄已經(jīng)在植物、小白鼠和人類中報道。Robust著絲粒中，CENP-A相聯(lián)系的重復序列的轉錄可能幫助招募蛋白質或著絲粒染色質的重塑。確實，在inVitor序列中，玉米CENP-C結合屬性由小RNA所加強，并且CENP-C經(jīng)常同人類的a-衛(wèi)星DNA重復序列所聯(lián)系。因此，轉錄在CENP-A區(qū)域是如何被授予功能特異性目前還不清楚，特別是，自從關于芽殖酵母的研究已經(jīng)表明，轉錄打亂了著絲粒的功能。而且，發(fā)生在人類人工染色體形成時期載體輸入中的轉錄同著絲粒的功能是不能相比的。未來的研究對于在著絲粒處RNA種類的特征描述，定義在著絲粒的形成、功能甚至相互作用中轉錄的作用將會非常重要。五、從失活的著絲粒中研究著絲粒的組織方式我們大多數(shù)關于著絲粒如何起作用的知識是基于常染色體或人工染色體，但是關于著絲粒的信息同樣重要的可以通過從研究在著絲粒失去作用或被阻止成為一個有功能的著絲粒的情況來搜集。雙著絲粒染色體和可調(diào)控的人類人工染色體是剖析遺傳和表性遺傳的極好的模型，而這些機制是著絲粒沉默的基礎。正常的人類染色體有一個著絲粒，但是，自然發(fā)生的重排常常導致染色體的融合和轉座，以致包含兩個著絲粒。McClintock的先驅工作描述了帶有兩個功能著絲粒的雙著絲粒為什么是不穩(wěn)定的，因為它經(jīng)歷了一系列的事件，不是分向相同的紡錘體極，而是兩個著絲粒都分向相反地紡錘極，導致了染色體的斷裂。確實，在芽殖酵母中，大多數(shù)雙著絲粒是不穩(wěn)定的，導致單著絲粒染色體的斷裂，這種模型卻正確。但是，在果蠅、植物、哺乳動物中，當雙著絲粒的一個失去活性時，這個雙著絲粒仍然是有活性的。著絲粒的失活由于著絲粒和同著絲粒和動粒功能正?；嗦?lián)系的重要的CENPS收縮現(xiàn)象的消失而被發(fā)現(xiàn)，然而，以分子為基礎的著絲粒的失活在最近幾年仍不清楚。由于觀察到雙著絲粒一旦形成就以各種方式起作用，使得我們對雙著絲粒穩(wěn)定性的了解變得更為復雜。大多數(shù)的雙著絲粒經(jīng)歷著著絲粒的失活，但一些仍然是有功能的雙著絲粒。那么，我們能預測到一個雙著絲粒形成后的命運嗎？研究表明，雙著絲粒的失活可能和雙著絲粒的結構和內(nèi)部著絲粒的距離有關。在酵母雙著絲粒和來自病者的人類染色體的雙著絲粒，帶有遠距離隔開著絲粒的雙著絲粒比那些近距離隔開著絲粒的的雙著絲粒更容易遭受到失活。據(jù)猜測，立體的控制對于內(nèi)部著絲粒距離較小的雙著絲?？梢詼p少不合適的的微管的系附或是減少著絲粒定位到相反紡錘極的可能性。然而，denovo人造雙著絲粒、人類著絲粒并不是經(jīng)常失活。其他的因素，比如基因組的或染色體或著絲粒的染色質特性，微管的內(nèi)部作用或者紡錘體自身的屬性可能最終影響著絲粒的命運。六、失活著絲粒和可變?nèi)旧|結構在人類中，一個失活的著絲粒上最基本的a-衛(wèi)星DNA似乎經(jīng)常很穩(wěn)定，于是著絲粒的失活被認為是一個表觀遺傳學現(xiàn)象。因此，非活性的著絲粒了采用一種與著絲粒的維持不適應的染色質結構。對人類人工染色體，在人造動粒處，染色質周圍的操縱的研究已提供了新的關于導致中斷或失活著絲粒染色質結構的證據(jù)。染色質修飾蛋白可以結合到a-衛(wèi)星DNA，改變改變?nèi)嗽熘z粒蛋白的構象。如果一個轉錄激活因子結合上，染色質變成常染色質，但一個轉錄抑制蛋白結合上時，染色質變成異染色質。令人吃驚的是，從這些研究中我們發(fā)現(xiàn)，染色質的狀態(tài)和染色質的功能和維持都是不相適應的。對人類人工染色體著絲粒的進一步研究揭示了動粒CENPS的逐漸喪失。當KAP1（轉錄阻遏蛋白）聚集到人工染色體的人工著絲粒處時，CENP-C、CENP-H在CENP-A之前減少完。這些研究表明，著絲粒的解聚過程中，CENP-A是最后一個從非活性著絲粒上移除的蛋白。現(xiàn)在仍然不清楚的是是否染色質的改變促進CENP的解離或是CENP的去除使得異染色質取代了著絲粒染色質。當CENP-A減少時，H3很容易取代CENP-A的位點，而當CENP-A過量表達時，CENP-A就可以取代H3位點而組裝。因為H3K9被認為對CENP-A的限制有反作用，對于所有異染色質CENP-A染色質的總體比率可能比特定修飾的存在和缺失的存在更重要。另外的支持著絲粒非活性的表觀遺傳學機制的證據(jù)來自轉染的a-衛(wèi)星DNA載體不能形成自主人工染色體。這個聚合的a-衛(wèi)星DNA陣列不能夠募集CENP-A或者別的CENPS，不管CENPS的存在與否，聚合的a-衛(wèi)星DNA結構域在野生型細胞中是異染色質化的并且富含H2K9me3,這表明是活性著絲粒有異染色質化的屬性。這個假設有在小鼠細胞中缺少CENP-B的變得稍不異染色質化的（亞甲基化和減少的H3K9me3）同樣的陣列所支持。在Suv39缺陷細胞中，聚集的a-衛(wèi)星DNA陣列可以降低CENP-A的募集水平，這表明在聚集的a-衛(wèi)星DNA異染色質化修飾或許還有別的非活性著絲粒可能會抑制著絲粒的功能和CENP-A的組裝。當然，比如H3K27甲基化這樣的同異染色質化相關的組蛋白的修飾也對著絲粒沉默和解釋為什么在Suv39null細胞中a-衛(wèi)星DNA聚合陣列不能建立完全的有功能的著絲粒有重要作用。實際上，H3K27甲基化的作用在小麥三著絲粒的兩個非活性著絲粒中已經(jīng)被證明，通過免疫熒光分析，非活性的著絲粒富含H3K27me2和H3K27me3。然而，由于甲基化染色體分析的限制，H3K27的精確位置和是否它和CENP-A最初所在的區(qū)域相重合并不清楚。據(jù)報道，在三著絲粒無活性的著絲粒是最小的一個，這表明，著絲粒的基因組偏好非活性的。這種傾向在玉米三著絲粒染色體中發(fā)現(xiàn)，這里最小的著絲粒是非活性的。盡管在人類中a-衛(wèi)星DNA陣列大小對著絲粒非活性的影響有待檢測，但以前的關于三著絲粒Robertsonian轉座的研究表明一些著絲粒比其他的一些更容易失活。盡管在著絲粒中a-衛(wèi)星DNA陣列的大小從10-20倍不等，但很可能在三著絲粒中有連續(xù)小陣列的著絲粒更容易失活。另外，比如從夫單體長度或CENP-B盒的密度這樣的序列也會影響三著絲粒失活的“選擇”。七、失活著絲粒和基因組的改變盡管現(xiàn)在在這一領域中流行的觀點是失活是由表觀遺傳機制引起的，但支持以非表觀遺傳途徑為基礎的著絲粒失活模型也有很多。著絲粒的刪除被當作一種在酵母穩(wěn)定有條件雙著絲粒染色體的一種有效途徑。來自病人的二著絲粒的研究表明在失活的著絲粒中，a-衛(wèi)星DNA陣列數(shù)量在減少。最近，在人類細胞誘導雙著絲粒處，這已經(jīng)被證實為與著絲粒失活相聯(lián)系的一種機制。在失活著絲粒部分刪除導致更小a-衛(wèi)星DNA陣列。因為CENP-A染色質在常染色體著絲粒內(nèi)是幾百萬堿基對的a-衛(wèi)星DNA陣列的一部分，因此非活性著絲?？梢杂肅ENP-A染色質陣列部分的移除來解釋。當然，有必要提的是著絲粒的刪除很可能僅僅是著絲粒失活機制的一種，因為a-衛(wèi)星DNA陣列數(shù)量的改變在其他雙著絲粒染色體中并不經(jīng)常相聯(lián)系。著絲粒刪除是雙著絲粒穩(wěn)定的一種機制，這僅僅在芽殖酵母、植物和人中出現(xiàn)。這種機制可以包含重組甚至DNA損傷聯(lián)系，因為這兩者的過程都同著絲粒相聯(lián)系。實際上，在酵母中，雙著絲粒在著絲粒通過堿基重組和堿基配對途徑刪除時而穩(wěn)定，而這種堿基對的重塑和修復是同微管動力學相聯(lián)系的，最近在小鼠細胞的實驗已經(jīng)揭示了在著絲粒融合中紡錘體的作用。在Dido（死亡誘導刪除因子）突變種和，異常的紡錘體引起著絲粒和動粒的扭曲，猜測可能是由于著絲粒微管的連結和隨后的在著絲粒染色體處發(fā)生的著絲粒剪切導致了著絲粒的丟失。在植物和哺乳動物著絲粒處觀察到出乎意料的高數(shù)量的重組。而且，異染色質在限制由于重組而引起的大量著絲粒的減少上是必須的。著絲粒遭受更多的重組（十字交叉、基因改變和同源重組）在雙著絲粒處更容易失活。然而，重組可能是著絲粒功能正常的一方面。在人類中CENP-A伴侶HJURP（Holliday連結識別蛋白）的鑒定和它的在芽殖酵母和裂殖酵母CENP-A伴侶Scm3的鑒定，在重組CENP-A的裝載或著絲粒的鑒定著絲粒形成方面的作用都是有啟發(fā)意義的。最后，研究它的特定位點，如果HJURP/Scm3參與著絲粒的重組或對于常染色體著絲粒和著絲粒失活是必需的。結束語想到著絲粒在基因組穩(wěn)定方面起到關鍵的作用而著絲粒的DNA序列在不同的物種中又是高度變化的是就讓人感到吃驚。著絲粒不知怎么地在脆弱和韌性間找到了一種平衡-著絲粒的建立和功能會被染色質的改變或翻譯打亂，但是體內(nèi)染色體著絲粒有表現(xiàn)出了一種韌性的染色質結構。未來的研究有必要在著絲粒的形成因素方面達到表觀遺傳學和序列因子作用的統(tǒng)一，特別是RNA的作用，轉錄和相關組蛋白的修飾。在它們形成之后通過鑒別紡錘體和雙著絲粒間的結構的相互作用和解釋著絲粒和DNA損傷途徑的組成部分的相互作用來行成著絲粒失活模型也是很重要的。最后，關于在著絲粒的功能上重組的作用的新的廣泛發(fā)現(xiàn)將確切地顯示這個過程對著絲粒穩(wěn)定性的影響。參考文獻.PalmerDK,O'DayK,WenerMH,AndrewsBS,MargolisRL:A17-Kdcentromereprotain(CENP-A)copurifieswithnucleosomecoreparticleandwithhistones.JCellBio1987,104:805-815..BlackBE,BassettEA:ThehistonevariantCENP-Aandcentromerespecification.CurrOpinBiol2008,20:91-100..DalaY,BuiM:Downtherabbitholeofcentromereassemblyanddynamic.CurrOpinCellBiol2010,22:392-402..FuruyamaS,BigginsS:Centromereidentityisspecifiedbyasinglecentromericnucleosomeinbuddingyeast.ProcNatlAcadSciUSA2007,104:14706-14711..WangG,ZhangX,Jim