艾滋病病毒滅活試驗

艾滋病病毒滅活試驗（1）目

的測定消毒劑對艾滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）滅活所需的劑量，以驗證對該病毒污染物消毒實用劑量。（2）實驗原理

用細胞感染法測定消毒劑作用前后（或?qū)嶒灲M與對照組）樣本中HIV的量。以細胞病變作為判斷指標，確定各組病毒的感染滴度，計算消毒劑對HIV的滅活對數(shù)值。（3）安全防護試驗中要求采取嚴密防護措施。我國規(guī)定所有接觸HIV的試驗均需在生物安全三級（biologicalsafetylevel3，BSL3）實驗室內(nèi)進行，并制定有相應(yīng)的安全防護措施。在HIV滅活試驗時，必須嚴格按照有關(guān)安全規(guī)定進行。（4）試驗分組1）試驗組。根據(jù)所測消毒劑對其他微生物的殺滅或滅活劑量估計，設(shè)立適宜的濃度與作用時間組（不少于1個濃度，3個作用時間），對作用時間的設(shè)計應(yīng)不短于30s。所設(shè)組應(yīng)能測出使HIV全部滅活所需的最低有效劑量（藥物濃度與作用時間）。2）陽性對照組。用去離子水代替消毒劑，按試驗組規(guī)定步驟加入HIV懸液進行試驗和培養(yǎng)，觀察HIV生長是否良好。3）陰性對照組。用不含HIV的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，觀察所用培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。4）消毒劑對細胞毒性組。取100μl待測消毒劑，加入含有100μl用完全培養(yǎng)基制備的MT4細胞懸液（含細胞400000個/ml）的96孔培養(yǎng)板內(nèi)。置二氧化碳溫箱（37℃）中培養(yǎng)7d，觀察細胞生長情況，確定消毒劑對細胞無毒性的最高稀釋度。（5）HIV懸液定量滅活試驗操作程序1）從液氮中取出凍存的MT4細胞，在37℃溫水中迅速融化，并用細胞維持液洗滌兩次后，轉(zhuǎn)種于加有10ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細胞生長情況，在細胞對數(shù)生長期時收獲細胞用于消毒試驗。2）從液氮中取出凍存HIV-1毒種，接種于含10ml細胞懸液（含細胞700000個/ml～800000個/ml）培養(yǎng)瓶中。逐日觀察病變，待3/4細胞出現(xiàn)病變時，收獲病毒。收獲時，將培養(yǎng)液取出，盡快離心，并將含病毒的上清液按每管0.5ml分裝于無菌離心管（1.5ml）中，冷凍保存于-80℃?zhèn)溆?。如不能立即離心，可暫將培養(yǎng)瓶冷凍保存于-20℃，并爭取盡快離心分裝。3）取待測消毒劑，用無菌去離子水作1:2、1:4、1:8...系列稀釋。視消毒劑的類型和實驗?zāi)康模_定最高稀釋度。為防止污染培養(yǎng)液，必要時在試驗前需將消毒劑過濾除菌。4）取50μl待檢消毒劑，與50μl病毒原液混合。在規(guī)定溫度作用一定時間（根據(jù)試驗要求確定作用時間和溫度），立即加入0.9ml用完全培養(yǎng)基制備的MT4細胞懸液（400000個/ml），在37℃，放置40min，以確保殘留病毒全部吸附在細胞上。陽性（病毒）對照組試驗中，用無菌去離子水代替消毒劑；消毒劑對細胞毒性組試驗中，用無菌去離子水代替病毒。5）取出反應(yīng)管，立即采取去除殘留消毒劑處理。處理可用物理去除法或中和劑法（所用方法需先經(jīng)試驗證明，既可有效去除殘留消毒劑，又對細胞和HIV無殺滅或抑制作用。6）在96孔培養(yǎng)板上滴定樣本中殘留的病毒量。先在培養(yǎng)板（96孔）的各孔中，加入100μl用完全培養(yǎng)基制備的MT4細胞懸液（含細胞400000個/ml）。同時，用完全培養(yǎng)基對待滴定樣本做1：10系列稀釋，然后取100μl稀釋好的樣本加入已含MT4細胞懸液的96孔培養(yǎng)板內(nèi)。每個稀釋度做4孔。7）將按上述程序加液的96孔培養(yǎng)板，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2），逐日在顯微鏡下觀察細胞病變。被感染細胞融合腫脹，出現(xiàn)多核巨細胞。第4d，在各反應(yīng)孔內(nèi)補加50μl新鮮完全培養(yǎng)基。第7d，逐孔觀察并記錄細胞病變情況。8）試驗重復(fù)3次。（6）評價規(guī)定1）對測試滴度的HIV，3次滅活試驗后均應(yīng)不再檢出，此時的滅活對數(shù)值應(yīng)≥4.00，可判為該消毒劑濃度與作用時間，對HIV污染物消毒的實驗室試驗合格。2）在正常情況下，HIV陽性對照組病毒感染滴度（TCID50）對數(shù)值應(yīng)在5～7之間。陰性對照組宿主細胞生長良好，并且無HIV檢出。所用濃度的消毒液對宿主細胞生長無不良影響。否則，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的問題，或調(diào)整HIV懸液濃度，或選擇適宜消毒液濃度，或更換污染試劑和培養(yǎng)基，或改進其他有關(guān)條件后，重做試驗。（7）注意事項

1）操作人員應(yīng)具有較豐富的病毒學(xué)實驗工作經(jīng)驗，必須絕對遵守BSL3實驗室的安全制度。身體狀態(tài)欠佳，或有傷口時，應(yīng)暫時停止工作。2）有感染可能性的操作，均應(yīng)在BSL