極性C18-親水作用色譜-強(qiáng)極性化合物分離專題-2013課件

1極性小分子分離分析專題講座強(qiáng)極性小分子分析難點(diǎn)1.我的樣品是兩性極性小分子化合物，反相柱不保留，怎樣選擇合適的色譜柱分析。關(guān)鍵詞：不保留2.我的樣品分析條件比較特殊，必須要進(jìn)行質(zhì)譜檢測，要選擇可以進(jìn)質(zhì)譜的分析條件。關(guān)鍵詞：質(zhì)譜兼容強(qiáng)極性小分子分析難點(diǎn)中強(qiáng)極性化合物強(qiáng)極性化合物一般極性化合物普通反相模式C18/C8可解決部分化合物在純水條件下反相模式解決在反相上無保留，正相不溶解，難點(diǎn)問題：疏水塌陷問題：不保留，不溶解強(qiáng)極性小分子分析解決方案選用親水性和極性很強(qiáng)的封尾試劑封尾避免疏水塌陷的幾個(gè)策略選用短鏈烷基鍵合相且不對硅醇基封尾選用鏈長更長的烷基固定相選用大孔硅膠對烷基鏈固定相進(jìn)行極性基團(tuán)嵌入的改造強(qiáng)極性小分子分析解決方案一步法反應(yīng)較好保持了烷基鏈的疏水性可調(diào)的極性基團(tuán)種類和數(shù)量增加了材料的穩(wěn)定性Polar-copolymerized極性共聚Polar-embeded極性包埋Polar-endcapped極性封尾破壞了烷基鏈的疏水性兩步反應(yīng)，極性基團(tuán)數(shù)量不可控利用極性共聚技術(shù)研發(fā)出耐水的XAqua系列色譜柱強(qiáng)極性小分子分析解決方案停流實(shí)驗(yàn)強(qiáng)極性小分子分析解決方案原兒茶醛色譜條件：色譜柱：XAquaC18(150×4.6mm，5mm)流動(dòng)相：乙腈：1%醋酸水溶液=5:95；柱溫：30°C;流速:1.0mL/min;強(qiáng)極性小分子分析解決方案中性或酸性極性小分子化合物XAqua系列堿性極性小分子化合物★解決XAqua系列拖尾一般解決辦法流動(dòng)相中加入離子對試劑質(zhì)譜不兼容強(qiáng)極性小分子分析解決方案羥氨芐青霉素色譜條件：色譜柱：XChargeC18；流動(dòng)相：A0.1%甲酸水，B0.1%甲酸甲醇；梯度：0~20min，5%B~95%B強(qiáng)極性小分子分析解決方案超強(qiáng)極性怎么辦，反相純水條件下不保留HILIC

模式XAquaC18流動(dòng)相：100%水XAmide流動(dòng)相：85%乙腈水強(qiáng)極性小分子分析解決方案增加保留與反相不同保留機(jī)理正交性更好的溶解度和質(zhì)譜兼容性強(qiáng)極性小分子分析解決方案色譜柱：XAmino，250mm×4.6mm，5mm流動(dòng)相：A:乙腈B：水等度：A/B=85:15流速：1.0mL/min柱溫：35oC選擇性：1.12分離度：3.08甘露醇山梨醇強(qiáng)極性小分子分析解決方案色譜柱：XAmide，250mm×4.6mm，5mm流動(dòng)相：A:磷酸鹽緩沖液B：乙腈等度：A/B=30:70流速：1.0mL/min柱溫：35oC左旋肉堿強(qiáng)極性小分子分析解決方案未知極性小分子化合物XAquaC18拖尾XChargeC18XAmideS-ClickXIon不保留拖尾反相模式親水模式方案特點(diǎn)1.該方案基本適用于所有極性小分子化合物，普試性好。2.該方案所有流動(dòng)相都可應(yīng)用于質(zhì)譜，質(zhì)譜兼容性好。3.采用兩種模式，增加了樣品的選擇性。強(qiáng)極性小分子分析解決方案樣品2樣品為某CRO公司提供合成中間體小分子化合物XAquaC18乙腈甲酸水主峰純度96.55%S-ClickXIon乙腈甲酸水主峰純度84.91%分離度差保留適中分離度良好強(qiáng)極性小分子分析解決方案樣品3樣品為某CRO公司提供合成中間體小分子化合物XAquaC18100%甲酸水主峰純度96.55%XChargeC18100%甲酸水主峰純度96.55%分離度差保留弱分離度差保留適中分離度良好主要內(nèi)容親水作用色譜保留機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜影響因素及應(yīng)用中藥中強(qiáng)極性化合物的分離研究方向親水作用色譜親水作用色譜法的分離原理與正相色譜法相近的極性固定相、以高比例極性有機(jī)溶劑和低比例水的混合溶液為流動(dòng)相，主要用于極性化合物的分離。被分析物質(zhì)在色譜柱中的保留和其自身的極性成正比，和流動(dòng)相的極性成反比。被分析物質(zhì)的極性越強(qiáng)，在色譜柱中保留越強(qiáng)。增加流動(dòng)相中水的比例，使流動(dòng)相極性增強(qiáng)，則分析物保留減弱。親水色譜固定相(1)傳統(tǒng)的正相色譜固定相，包括純硅膠固定相、氨基鍵合相、二醇基鍵合相、氰基固定相。該類固定相對糖、有機(jī)酸、核苷等強(qiáng)極性化合物表現(xiàn)出良好的分離選擇性;(2)離子交換固定相，該類固定相具有很好的親水性，表面帶有較強(qiáng)的表面電荷，用于親水作用色譜時(shí)表現(xiàn)為一種離子交換(或排斥)/親水作用混合色譜模式;(3)專門應(yīng)用于親水作用色譜的固定相，包括酰胺類固定相、醇羥基固定相和兩性離子固定相。酰胺類固定相可用于分離核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇及有機(jī)酸等親水化合物;醇羥基固定相適合于分離各種糖，如單糖、二糖、糖醇、寡糖及堿基、核苷、肽和中藥中的強(qiáng)極性組分。強(qiáng)極性化合物反相模式分離ODSColumn1.000mL/minA:0.1%

甲酸/水B:

乙腈時(shí)間/分鐘03050B/%53070親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)川芎強(qiáng)極性成分反相模式分離，UV檢測（260nm）吸附親水作用色譜保留機(jī)理親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)分配極性固定相富水層流動(dòng)相極性固定相溶質(zhì)A.J.Alpert,J.Chromatogr.,499(1990)177.Y.Guo,J.Chromatogr.A1074（2005）71Y.Guo,J.Pharm.Biomed.Anal.31（2003）1191T.Yoshida,J.Biochem.Biophys.Meth.60（2004）265親水作用色譜影響因素固定相有機(jī)溶劑緩沖鹽pH柱溫親水作用色譜影響因素及應(yīng)用(A)KeystoneCarbohydrate,(B)AsahipakNH2P,(C)BetaBasicCyano,(D)MetasilCyano,(E)TSKGelAmide-80,(F)CyclobondIII,(G)PolyhydroxyethylAspartamide0-40min，ACN：90-75%；40-80min，ACN：75%terreicacidoosporeinguanine

nocardicinAcephalosporinCvancomycin固定相對親水模式分離的影響M.A.Strege,

Anal.Chem.70(1998)2439親水作用色譜影響因素及應(yīng)用有機(jī)溶劑對親水模式分離的影響(1)epidaunorubicin,(2)daunorubicin,(3)epirubicin,(4)doxorubicinKromasilKR100-5SIL10%HCOONabuffer(20mM,pH2.9)R.P.Li,J.Chromatogr.A,1041(2004)163親水作用色譜影響因素及應(yīng)用有機(jī)溶劑對親水模式分離的影響aspirincytosineTSKgelAmide-80YMC-PackNH2HILICSilica×ZIC-HILIC5mMammoniumacetate，30℃Y.Guo,J.Chromatogr.A1074（2005）71親水作用色譜影響因素及應(yīng)用緩沖鹽對親水模式分離的影響親水作用色譜影響因素及應(yīng)用terreicacidoosporeinguanine

nocardicinAcephalosporinCvancomycinA:6.5mM三氟乙酸；B:7.9mM甲酸銨pH4.4C:6.5mM乙酸銨pH5.5；D:6.3mM碳酸氫銨pH7.9TSKGelAmide80column0-40min，ACN：90-75%；0-80min，ACN：75%M.A.Strege,

Anal.Chem.70(1998)2439pH對親水模式分離的影響RetentionofBTEACasafunctionofpHAtlantissilica85%ACN-0.1MNH3pHadjustedwithformicacidACN–0.1MHCOONH4,

pH8.2–10.2D.V.McCalleyJ.Chromatogr.A1171（2007）46AnalysisoftestsolutesonAtlantissilica親水作用色譜影響因素及應(yīng)用柱溫對親水模式分離的影響aspirincytosineTSKgelAmide-80YMC-PackNH2HILICSilica×ZIC-HILICACN/water:90/10(10mMammoniumacetate)Y.Guo,J.Chromatogr.A1074（2005）71親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜應(yīng)用血漿中葉酸化合物的檢測NestGroupHILICcolumn，乙腈/水（75：25）5mM乙酸銨，pH6.9S.D.Garbis，Anal.Chem.73（2001）5358親水作用色譜影響因素及應(yīng)用單糖、寡糖分離單糖、二糖分離氰基柱乙腈/水/甲酸銨

(240mM,pH3.0)76:23:1麥芽寡糖分離氨基柱乙腈/水/甲酸銨

(240mM,pH3.0)70:29:1A.H.Que，Anal.Chem.74（2004）5184

親水作用色譜影響因素及應(yīng)用糖基磷脂酰肌醇錨蛋白（GPI-APs）分離（A）HILICeluate；（B）PNGaseF-treatedHILICeluateM.J.Omaetxebarria,Anal.Chem.78(2006)3335親水作用色譜影響因素及應(yīng)用MALDI-TOFmassspectraofpeptidesfromMDPtrypticdigest皂樹皂苷分離（HILIC×HILIC-Q-TOF-MS模式）Y.Wang,J.Chromatogr.A,1181(2008)51親水作用色譜影響因素及應(yīng)用中藥中強(qiáng)極性化合物的分離各種親水色譜固定相用于中藥水提樣品的分離色譜柱固定相應(yīng)用AtlantisHILICsilica甘草、葛根中黃酮類化合物的分離VenusilHILIC酰胺川芎、紅花水提樣品分離β-CD環(huán)糊精枳實(shí)、黃芩水提樣品，甘草、葛根中黃酮類化合物的分離川芎親水指紋圖譜研究川芎樣品預(yù)處理方法優(yōu)化方法學(xué)考察川芎指紋圖譜相似度評價(jià)中藥中親水化合物的分離中藥中強(qiáng)極性化合物的分離川芎樣品預(yù)處理方法優(yōu)化川芎水提液95%乙腈上清液中等、弱極性反相模式分離川芎指紋圖譜Ⅰ沉淀

70%甲醇醇溶液強(qiáng)極性親水模式分離川芎指紋圖譜Ⅱ中藥中強(qiáng)極性化合物的分離川芎中等、弱極性成分反相模式分離（上圖）；強(qiáng)極性成分反相（中圖）、親水模式分離（下圖），UV檢測（260nm）1110987654321川芎指紋圖譜Ⅰ1’2’3’4’5’6’7’8’10’9’川芎指紋圖譜Ⅱ方法學(xué)考察序號(hào)R.S.D.(%)精密度(n=5)重現(xiàn)性(n=5)穩(wěn)定性(n=7)10.260.110.3720.220.070.3530.110.070.3340.110.050.3050.130.050.2760.090.050.2570.110.040.2080.090.040.1690.060.020.10100.050.020.10110.050.020