酶促反應(yīng)動力學(xué)課件

酶促反應(yīng)動力學(xué)一、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響二、米氏公式的導(dǎo)出三、米氏方程的討論四、米氏常數(shù)的求法五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)一、底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響21345678002

4

68底物濃度mmole生成物濃度806040200S+E↓P(固定酶的濃度在固定時間內(nèi)反應(yīng))（單底物酶促反應(yīng)）酶與底物先絡(luò)合成一個中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物進一步分解成產(chǎn)物和游離的酶。酶的底物飽合現(xiàn)象——中間絡(luò)合物學(xué)說非酶催化劑酶催化劑中間產(chǎn)物假說證據(jù)Michaelis與

Menten提出酶催化動力學(xué)MichaelisMentenNelson&Cox(2000)LehningerPrinciplesofBiochemistry(3e)p.2581913年Ks為底物解離常數(shù)（底物常數(shù)）二、米氏方程的導(dǎo)出1、根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說：假定E+SES迅速建立平衡，底物濃度遠遠大于酶濃度下，K3<<K2即K3反應(yīng)特別慢，可以忽略不計。

米式方程的導(dǎo)出：早年的米式方程基于快速平衡假說①

在反應(yīng)的初始階段，[S]遠遠大于[E]，因此，[S]可以認為不變。②

因為研究的是初速度，P的量很小，由P+EES可以忽略不記。③

游離的酶與底物形成ES的速度極快（快速平衡），而ES形成產(chǎn)物的速度極慢，故，[ES]的動態(tài)平衡與ESP+E沒有關(guān)系（既K1、K2

＞＞K3

）ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]反應(yīng)速度：KS現(xiàn)在稱為底物常數(shù)

米氏推導(dǎo)酶促反應(yīng)速度公式時，認為[ES]的積累是快速平衡的結(jié)果，而沒有考慮ESE+P這一步。而Briggs認為應(yīng)當(dāng)考慮這一步，因為并不總是K3<<K2,ESE+P這一步也可能速度很快，這時，E，S和ES將不能處于一個平衡狀態(tài)。布氏提出穩(wěn)態(tài)理論。1925年Briggs和Haldane提出穩(wěn)態(tài)理論ES+P+ES的生成量與消失量相等，故平衡時

[ES]濃度成一穩(wěn)定狀態(tài)。SEESteadyState時

ES的濃度恒定SPEES反應(yīng)時間濃度穩(wěn)態(tài)理論(SteadyStatetheory)的假設(shè)穩(wěn)態(tài)理論下米氏方程的推導(dǎo)E+SESE+P(vo)k2k1k3

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]vo=Vmax

[S]Km

+

[S][E0]

=

[E]

+

[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0]酶必須先與底物結(jié)合ES的生成量等于其消失量[ES]濃度恒定SteadyState由上式出發(fā)可推得Michaelis-Menten公式[E0]

酶的總量穩(wěn)態(tài)理論下米氏方程的推導(dǎo)E+SESE+P(vo)k2k1k3S穩(wěn)態(tài)理論下米氏方程的推導(dǎo)[E0]

=

[E]

+

[ES]vo=k3[ES]Vmax=k3[E0][E0]

酶的總量當(dāng)[S]<<Km時當(dāng)[S]>>Km時當(dāng)[S]=Km時米氏方程定量的表達了反應(yīng)初速度與底物濃度之間的關(guān)系與實驗結(jié)果相符合。三、米氏方程的討論

米氏方程的意義①物理意義:

當(dāng)反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度（Vmax)的一半時的底物濃度.②Km的引伸意義:Km是酶學(xué)研究中的重要研究數(shù)據(jù),表示了酶的一個基本性質(zhì).Km值是酶的特征常數(shù)之一,與酶的性質(zhì)有關(guān),而與酶的濃度無關(guān),不同的酶,其Km值不同.對于專一性不強的酶來說對于每一個底物都有一個相應(yīng)的Km值.2、米式方程中各參數(shù)的意義

1)Km的意義三、米氏方程的討論Km與天然底物Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物。因為：Km愈?。ㄟ_到Vmax一半所需的底物濃度愈?。┍硎綱對△[S]越靈敏。V[S]1/2VmaxKm三、米氏方程的討論快速平衡假說與穩(wěn)態(tài)平衡假說的實質(zhì)區(qū)別當(dāng)K1、K2>>K3時，即ESP+E是整個反應(yīng)平衡中極慢的一步“穩(wěn)態(tài)平衡=快速平衡+慢速平衡”：當(dāng)ESP+E極慢（K3/K1極?。r，穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡三、米氏方程的討論Km、Ks與底物親和力Km是ES分解速度（K2+K3）與形成速度（K1）的比值，它包含ES解離趨勢（K2／K1）和產(chǎn)物形成趨勢（K3／K1）。Ks是底物常數(shù)，只反映ES解離趨勢（底物親和力），1/Ks可以準(zhǔn)確表示酶與底物的親和力大小。只有當(dāng)K1、K2>>K3時，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物親和力的大小。底物親和力大不一定反應(yīng)速度大（反應(yīng)速度更多地與產(chǎn)物形成趨勢K3／K1有關(guān)）三、米氏方程的討論2)Km值的用途——根據(jù)Km推測代謝的方向及程度根據(jù)正逆反應(yīng)Km的差別及細胞內(nèi)正逆兩相底物的濃度推測酶促反應(yīng)的正逆方向。根據(jù)代謝途徑中各個酶的Km及其相應(yīng)底物濃度判斷限速步驟（Km最大的步驟不一定是限速步驟）根據(jù)Km值的大小判斷分支代謝的流向酶工程與代謝工程中改造酶的Km調(diào)控代謝途徑（強化則降低Km，弱化則提升Km

）三、米氏方程的討論3)米式方程的用途（1）根據(jù)[S]求V（2）根據(jù)V（或相對速度a）求[S]三、米氏方程的討論設(shè)定達到最大反應(yīng)速度的0.9倍時，所需底物濃度為[S]0.9[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=21三、米氏方程的討論（3）根據(jù)相對速度推測酶活性中心飽和度當(dāng)v=Vmax時，表明酶的活性部位已全部被底物占據(jù)。當(dāng)v=1/2Vmax時，表示活性部位有一半被占據(jù)。3)米式方程的用途4)、Vmax與K3（

Kcat）的意義Vmax不是一個常數(shù)，它取決于酶的濃度，它是一個酶反應(yīng)體系的速度的極限值。Vmax=K3[E0]K3代表酶被底物飽和時每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)（或催化常數(shù)，Kcat），表明酶的最大催化效率三、米氏方程的討論5)、Kcat/Km

表示酶的實際催化效率

三、米氏方程的討論在生理條件下，大多數(shù)酶并不被底物所飽和，在體內(nèi)[S]/Km的比值通常介于0.01到1之間[S]<<Km時：Kcat/Km的上限是K1，既生成ES復(fù)合物的速度(酶促反應(yīng)的速度不會超過ES的形成速度K1，在水相中不會超過108~109）只有Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率1、

Lineweaver-Burk

雙倒數(shù)作圖法四、米氏常數(shù)的求法選底物濃度應(yīng)考慮能否得到1/[S]的常數(shù)增量[S]為1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10時1/[S]為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常數(shù)增量。[S]為常數(shù)增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10時，1/[S]為0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常數(shù)增量，點多集中在1/v軸附近。該作圖的缺點是：實驗點過分集中在直線的左下方，而低濃度S的實驗點又因倒數(shù)后誤差較大，往往偏離直線較遠。從而影響Km和Vmax的準(zhǔn)確測定。四、米氏常數(shù)的求法2、Eadie-HofsteeV—V/[S]作圖法3、Hanes-Woolf作圖法

4、Eisenthal作圖法

5、Hill作圖法（寡聚酶）-LogKmLog[S]四、米氏常數(shù)的求法（一）雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)機理序列反應(yīng)或單一置換反應(yīng):有序反應(yīng)Orderedreaction(orderedBiBi)隨機反應(yīng)Randomreactions(randomBiBi)乒乓反應(yīng)或雙置換反應(yīng)五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)1、有序反應(yīng)機理只有先導(dǎo)底物A(Leadingsubstrate)首先與酶結(jié)合，然后B才能與酶結(jié)合，形成的三元復(fù)合物EAB（ternarycomplex)轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，B的產(chǎn)物P先釋放，A的產(chǎn)物Q后釋放?！裨谌鄙貯時，B不能與E結(jié)合五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQ反應(yīng)的總方向決定于A、Q的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)NAD與NADH相互競爭E上的NAD結(jié)合部位2、隨機反應(yīng)機理底物A、B與酶結(jié)合的順序是隨機的，形成的三元復(fù)合物AEB→QEP，產(chǎn)物P、Q的釋放順序也是隨機的。五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)限速步驟是AEB→QEPA與Q相互競爭E上的底物結(jié)合部位A，B與P相互競爭E上的底物結(jié)合部位B反應(yīng)的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)3、乒乓反應(yīng)機理五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)整個反應(yīng)歷程中只有二元復(fù)合物形式，沒有三元復(fù)合物形式谷氨酸：草酰乙酸氨基轉(zhuǎn)移酶符合雙置換、雙底物機制的酶（二）雙底物反應(yīng)的動力學(xué)方程1、乒乓機制的動力學(xué)方程KmA：[B]達到飽和濃度時A的米氏常數(shù)KmA’：A的表觀米氏常數(shù)Vmax：[A][B]都達到飽和濃度時的最大反應(yīng)速度五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)2、序列機制的底物動力學(xué)方程五、多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)六、pH值對酶反應(yīng)速度的影響七、溫度對酶促反應(yīng)速度的影響八、酶濃度對反應(yīng)速度的影響九、激活劑對酶活性的影響十、抑制劑對酶活性的影響第四節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)（二）

大多數(shù)酶的活性受pH影響顯著，在某一pH下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適pH。典型的酶速度-pH曲線是較窄的鐘罩型曲線。六、pH對酶促反應(yīng)速度的影響2.最適pH(optimumpH)2.pH影響酶活力的因素①影響酶蛋白構(gòu)象，過酸或過堿會使酶變性。②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。③影響酶和底物分子中另外一些基團解離，這些基團的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。3.pH對酶穩(wěn)定性的影響酶的提純及測活時要選擇酶的穩(wěn)定pH，通常在某一pH緩沖液中進行。一般最適pH總是在該酶的穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，故酶在最適pH附近最為穩(wěn)定。六、pH對酶促反應(yīng)速度的影響4.酶活力——pH曲線的類型最適pH與底物種類、濃度及緩沖液成分有關(guān)。雖然大部分酶的pH—酶活曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。六、pH對酶促反應(yīng)速度的影響1．最適溫度及影響因素溫度對酶促反應(yīng)速度的影響有兩個方面：①提高溫度，加快反應(yīng)速度。

溫度系數(shù)Q10：溫度升高10℃，反應(yīng)速度與原來的反應(yīng)速度之比，大多數(shù)酶的Q10一般為1~2。②提高溫度，酶變性失活。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)速度達到最大時對應(yīng)的溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度（optimumtemperatureTm）.七、溫度對酶促反應(yīng)速度的影響最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因為一種酶的最適溫度不是一成不變的，它要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應(yīng)時間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反應(yīng)條件有關(guān)。八、酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響

v===在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大大超過酶濃度時，速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對速度的影響機理：酶濃度增加，[ES]也增加，故反應(yīng)速度增加。激活劑（activator):凡是能提高酶活性的物質(zhì)。1、

無機離子的激活作用（1）金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）陰離子：Cl-、Br-、PO43-（3）氫離子不同的離子激活不同的酶。不同離子之間有拮抗作用和可替代作用，如Na+與K+、Mg2+與Ca2+之間常常拮抗，但Mg2+與Zn2+?？商娲?。激活劑的濃度要適中，過高往往有抑制作用，1~50mM九、激活劑對酶活性的影響2、簡單有機分子的激活作用①還原劑（如Cys、還原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。②金屬螯合劑（EDTA）能去除酶中重金屬離子，解除抑制作用。3、蛋白酶對酶原的激活酶原可被一些蛋白酶選擇性水解肽鍵而被激活，這些蛋白酶也可看成為激活劑。九、激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響抑制作用(inhibition):

酶的必需基團化學(xué)性質(zhì)的改變，但酶未變性，而引起酶活力的降低或喪失。變性作用(denaturation):

由于酶分子的次級鍵(酶分子結(jié)構(gòu)）受到破壞而使酶活性下降或失活的現(xiàn)象.抑制劑:

不引起酶蛋白變性但能與酶分子的必需基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而引起酶活力的下降甚至喪失,能引起這種酶活力下降或喪失的物質(zhì)叫抑制劑.變性劑:

不專一作用于某一類化學(xué)基團,而只是破壞蛋白分子中次級鍵的化學(xué)物質(zhì).叫變性劑.失活:

是指酶活力的喪失.變性劑和抑制劑均可使酶失活.十、抑制劑對酶活性的影響十、抑制劑對酶活性的影響抑制作用變性作用抑制與變性的結(jié)果是酶失活抑制作用：酶的結(jié)構(gòu)與功能，催化機制、代謝途徑研究的基本手段，藥物設(shè)計的理論依據(jù)（一）抑制程度的兩種表示方法相對活力分數(shù)相對活力百分數(shù)2、抑制率抑制分數(shù)抑制百分數(shù)1、相對活力十、抑制劑對酶活性的影響（二）抑制作用的類型不可逆的抑制作用:這一類抑制劑通常以比較牢固的共價鍵與酶蛋白中的基團結(jié)合,而使酶分子失活.不能用透析,超濾等物理方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活性.可逆抑制劑作用:這類抑制劑與酶蛋白的結(jié)合是可逆的,可用透析,超濾等物理方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活性.競爭性抑制(competitiveinhibition)非競爭性抑制(noncompetitiveinhibition)反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)

十、抑制劑對酶活性的影響（1）競爭性抑制抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，競爭酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合?？梢酝ㄟ^增加底物濃度而解除此種抑制。十、抑制劑對酶活性的影響（2）非競爭性抑制底物和抑制劑可以同時與酶結(jié)合，但是，中間的三元復(fù)合物ESI不能進一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中的以外的基團結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物無關(guān)。不能通過增加底物的濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用某些重金屬離子對酶的抑制屬于非競爭性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+十、抑制劑對酶活性的影響（3）反競爭性抑制酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。E+S→ES+I→ESI≠P常見于多底物的酶促反應(yīng)中十、抑制劑對酶活性的影響EnzymeInhibition(Mechanism)CompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferentsiteCompeteforactivesiteInhibitorSubstrateCartoonGuideEquationandDescription[I]bindstofree[E]only,andcompeteswith[S];increasing[S]overcomesInhibitionby[I].[I]bindstofree[E]or[ES]complex;Increasing[S]cannotovercome[I]inhibition.[I]bindsto[ES]complexonly,increasing[S]favorstheinhibitionby[I].E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EI

←

↑E+S

→

ES

→

E+P++

I

I↓↓EI

+

S

→EIS

←

↑

↑E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EIS

←

↑X（三）可逆抑制作用動力學(xué)十、抑制劑對酶活性的影響1、競爭性抑制：酶濃度恒等:由米氏學(xué)說:十、抑制劑對酶活性的影響Vmax不變Km變大，而且隨[I]濃度的增大而增大交于y軸十、抑制劑對酶活性的影響2、

非競爭性抑制抑制程度決定于[I]和Ki，與底物的Km和[S]無關(guān)動力學(xué)方程：十、抑制劑對酶活性的影響交于x軸Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）十、抑制劑對酶活性的影響3、反競爭性抑制Km及Vmax都變小。一組平行直線十、抑制劑對酶活性的影響動力學(xué)方程：抑制程度決定于Km、Ki、[S]、[I]KmEnzymeInhibition(Plots)CompetitiveNon-competitiveUncompetitive

DirectPlotsDoubleReciprocalVmaxVmaxKmKm’[S],mMvo[S],mMvoIIKm[S],mMVmaxIKm’Vmax’Vmax’VmaxunchangedKmincreasedVmaxdecreasedKmunchangedBothVmax&KmdecreasedI1/[S]1/Km1/vo1/

VmaxITwoparallellinesIIntersectatXaxis1/vo1/

Vmax1/[S]1/Km1/[S]1/Km1/

Vmax1/vo

IntersectatYaxis=

Km’（四）一些重要的抑制劑十、抑制劑對酶活性的影響1、不可逆抑制劑：

(1)非專一性不可逆抑制劑與酶活性中心及活性中心外某一類或幾類必需基團反應(yīng)①有機磷的?；锒惐柞７―FP）和許多有機磷農(nóng)藥。抑制機理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂鍵。強烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經(jīng)毒劑）。解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷?；鶊F除去。十、抑制劑對酶活性的影響②有機汞、有機砷化合物

抑制機理：使酶的巰基(-SH)烷化解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GS