營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法

關(guān)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法第1頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六什么是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株？經(jīng)過(guò)人工誘變或自然突變失去合成某種營(yíng)養(yǎng)（氨基酸，維生素，核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因子才能生長(zhǎng)的野生型菌株。它是一種生化突變株，它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。遺傳信息的載體是一系列為酶蛋白編碼的核酸系列，如果核酸系列中某堿基發(fā)生突變，由該基因所控制的酶合成受阻，該菌株也因此不能合成某種營(yíng)養(yǎng)因子，使正常代謝失去平衡。超阻遏突變體（表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)缺陷型）第2頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六

營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選4個(gè)步驟：1、誘變培養(yǎng)2、淘汰野生型3、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型4、鑒別缺陷種類，確定生長(zhǎng)譜一、誘變培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變方法和誘變因子與普通誘變育種基本相同。用于誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變劑有亞硝基胍,紫外線,亞硝酸等,其中亞硝基胍的誘發(fā)突變率極高,一般可達(dá)10%以上,另外,隨著誘變劑量的提高突變頻率也追加。第3頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六二、淘汰野生菌株在誘變后的存活菌體中營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的數(shù)量很少，一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細(xì)胞卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細(xì)胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于檢出。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過(guò)濾法、差別殺菌法和饑餓法等。1、抗生素法：細(xì)菌用青霉素法：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖，而青霉素能抑制細(xì)胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細(xì)胞壁。處在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的細(xì)菌對(duì)青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處休止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌。將誘變處理后的菌懸液分離加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細(xì)胞由于正常生長(zhǎng)繁殖而被殺死，營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞因不能生長(zhǎng)而被保留下來(lái)，達(dá)到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇，引起細(xì)胞膜的損傷，殺死生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的真菌，起到富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型的作用。第4頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六2、菌絲過(guò)濾法真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)長(zhǎng)成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)10h左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛?cè)庋劭梢?jiàn)，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3~4h過(guò)濾一次，重復(fù)3~4次，最大限度地除去野生型細(xì)胞。然后稀釋、涂皿分離。3、高溫殺菌法利用芽孢桿菌類的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)熱敏感性的差異，讓誘變后的細(xì)菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細(xì)菌移到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，野生型芽孢萌發(fā)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。此時(shí)將培養(yǎng)物加熱到80℃，維持一定時(shí)間，野生型細(xì)胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。第5頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：點(diǎn)植對(duì)照法、夾層平板法、限量營(yíng)養(yǎng)法和影印接種法等1、點(diǎn)植對(duì)照法：誘變后的孢子或菌體，經(jīng)富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培養(yǎng)基平板進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽或接種針把每個(gè)菌落上孢子或菌體分別接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上的相應(yīng)位置，同時(shí)培養(yǎng)，然后觀察對(duì)比菌落生長(zhǎng)情況。如果基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)而完全培養(yǎng)基相應(yīng)位置上生長(zhǎng)的菌落，可能為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進(jìn)一步復(fù)證。該法可靠性強(qiáng)，但工作量大。2、夾層平板法：先在培養(yǎng)皿上倒一薄層基本培養(yǎng)基，凝固后再倒一層經(jīng)過(guò)誘變處理的菌液，其上再澆一層基本培養(yǎng)基；經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆在皿底標(biāo)記，然后再倒一層完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)，出現(xiàn)的形態(tài)較小的新菌落，多為缺陷型。3、限量營(yíng)養(yǎng)法：如果試驗(yàn)的目的僅是檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，則其該法是將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有0.01%蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細(xì)胞迅速地長(zhǎng)成大菌落，在平皿底部作好顏色標(biāo)記，而生長(zhǎng)緩慢的小菌落可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)。如果試驗(yàn)的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基本培養(yǎng)基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)，稱為補(bǔ)充培養(yǎng)。夾層平板法第6頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六4、影印接種法經(jīng)富集后的孢子或菌體分離在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落成熟（母皿），用滅菌后的特制“絲絨印?！痹谀该笃桨寰渖陷p輕一印，再轉(zhuǎn)印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)后觀察比較菌落生長(zhǎng)情況，凡是在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，而在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，分別移接到以上兩種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)一步復(fù)證。另外還可采用更簡(jiǎn)便的方法，以上印模從母皿中沾上菌體細(xì)胞后，僅影印在基本培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，生長(zhǎng)的菌落情況與存放于冰箱的母皿菌落比較即可檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型。本法適用于細(xì)菌、酵母菌，其次對(duì)小型菌落的放線菌和霉菌也適用。第7頁(yè)，共9頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)29分，星期六營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定1、缺陷類別的測(cè)定通常分別用以下物質(zhì)來(lái)代表氨基酸、維生素、核酸堿基：①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類②酵母浸出液，基中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均有③維生素混合物，代表維生素類④核酸堿基混合液，代表嘌呤、嘧啶類。將待測(cè)微生物從斜面上用生理鹽水或緩沖液?jiǎn)滔聪聛?lái)，離心洗滌，制成濃度為106~108ml-1菌懸液，取0.1ml加入到基本培養(yǎng)基中，混勻倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圓濾紙分別浸濕沾取以上四類代表物質(zhì)，覆于平板標(biāo)定的位置上。培養(yǎng)后，觀察圓濾紙片周圍菌株生長(zhǎng)情況，如出現(xiàn)混濁的生長(zhǎng)圈，就可初步確定缺陷型所需的生長(zhǎng)因子屬于哪一類別，進(jìn)一步復(fù)證。2、缺陷型所需生長(zhǎng)因子的測(cè)定缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把5組或6組生長(zhǎng)因子直接加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩組區(qū)產(chǎn)生混濁生長(zhǎng)圈，即可確定該菌株缺陷的生長(zhǎng)因子。如果要測(cè)定數(shù)十或上百個(gè)缺陷型菌株時(shí)，則可改成一個(gè)平皿中加入一種生長(zhǎng)因子，制成平板，在翻轉(zhuǎn)平皿底部，幾十個(gè)方格