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文檔簡介

關(guān)于色層分離法生物分離工程第1頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六色層技術(shù)(層析技術(shù))色層法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù),本世紀(jì)初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。現(xiàn)在色層法已成為生物工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。第2頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六色層分離方法-Chromatography

色層分離法是一組相關(guān)分離方法的總稱,它的機(jī)理是多種多樣的,但不管哪種方法都必須包括兩個(gè)相。一相是固定相,通常為表面積很大的或多孔性固體;另一相是流動(dòng)相,是液體或氣體。當(dāng)流動(dòng)相流過固定相時(shí),由于物質(zhì)在兩相間的分配情況不同,經(jīng)過多次差別分配而達(dá)到分離,或者說,易分配于固定相的物質(zhì)移動(dòng)速度慢,易分配于流動(dòng)相中的物質(zhì)移動(dòng)速度快,因而得到逐步分離。第3頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六層析法的發(fā)展過程1903年

Tswett發(fā)表了吸附色譜分離植物色素的論文,三年后他在另外兩篇論文中正式提出色譜法。1931年色譜法提出后,并未立即受到重視。經(jīng)過大約20年,由于Lederer的工作,人們才重視色譜技術(shù)。1938年

Izmailov和Shraiber第一次使用薄層色譜法。1938年

Taylor和Uray用離子交換分離鋰和鉀的同位素。40年代,合成離子交換樹脂商品出現(xiàn)后,離子交換色譜才得到廣泛應(yīng)用。1944年在美國橡樹嶺國家實(shí)驗(yàn)室和衣阿華州立大學(xué)分離和鑒定了稀土元素。在1944年到50年代中,芝加哥大學(xué)和加州大學(xué)完成了超鈾元素的分離。第4頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六1941年Martin和Synge發(fā)展了分配色譜。1944年Martin等發(fā)展了紙色譜。1952年Martin和James發(fā)展了氣-液分配色譜。1956年VanDeemter等發(fā)表關(guān)于色譜效率的速率理論,并應(yīng)用到氣相色譜中。1957年制作離子交換色譜氨基酸分析儀。1959年在CordonConference上提出了第一篇凝膠過濾色譜的報(bào)告。1963年Giddings的理論工作為現(xiàn)代液相色譜奠定了理論基礎(chǔ)。第5頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六60年代中期凝膠滲透色譜出現(xiàn)。60年代后期親和色譜出現(xiàn)。1969年現(xiàn)代液相色譜開始受到重視。有兩次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)是授予色譜學(xué)領(lǐng)域的研究工作:1948年瑞典科學(xué)家Tiselins由于他的關(guān)于電泳和吸附分析的研究獲獎(jiǎng),1952年英國的Martin和Synge因?yàn)榘l(fā)展了分配色譜而獲獎(jiǎng)。第6頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六層析的原理“層析譜的本質(zhì)是使一種液體均勻地滲過一個(gè)相當(dāng)細(xì)碎的物質(zhì)的柱體,這些物質(zhì)通過某種過程有選擇地阻留了液體內(nèi)的某些組分?!?/p>

——馬?。ˋ.J.P.Martin)(英)第7頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

層析分離法常用的層析技術(shù)有(親和層析、離子交換層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳)特點(diǎn):(1)純化倍數(shù)高(2)操作規(guī)模小,放大困難(3)

最終產(chǎn)品純化(4)適用于價(jià)格昂貴的產(chǎn)品第8頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六層析分離分類(1)按溶質(zhì)分子與固定相相互作用機(jī)理吸附層析(范德華力,氫鍵,靜電力,共價(jià)力)分配層析(溶質(zhì)在兩液相間分配系數(shù)不同)凝膠過濾(分子大小與形狀)實(shí)驗(yàn)技術(shù)分類低壓(小于0.5Mpa)中壓(0.5-5Mpa)高壓(5-40Mpa)電泳(溶質(zhì)在電場(chǎng)中移動(dòng))第9頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六⑴分析色譜(10mg)⑵半制備色譜(10-50mg)⑶制備色譜(0.1-1g)⑷工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模色譜(>20g/d)年產(chǎn)10g合格的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGcs-F),其產(chǎn)值高達(dá)1億元。層析分離分類(3)第10頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六層析分離分類(3)根據(jù)固定相形狀分類柱層析紙層析薄層層析根據(jù)流動(dòng)相分類氣相層析液相層析超臨界流體層析按操作方式分類(展開)迎頭法(frontalanalysis)頂替法(displacementanalysis)洗脫分析(elutionanalysis)第11頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六基本概念(1)分配系數(shù)溶質(zhì)在固定相與流動(dòng)相濃度比值(2)解離常數(shù)有效結(jié)合位子濃度與溶質(zhì)在液相的濃度乘積與溶質(zhì)在固相中的濃度比值(3)分離因素某一瞬間被吸附溶質(zhì)量占總量的分?jǐn)?shù)

(4)

阻滯因子分配層析溶質(zhì)移動(dòng)速度(距離)與流動(dòng)相移動(dòng)速度(距離)比值

(5)

洗脫(容積)溶出體積在柱色層分離中,使溶質(zhì)從柱中流出時(shí)所通過的流動(dòng)相體積

(6)

分辨率兩峰之間的距離與兩峰寬的平均值之比

(7)理論塔板流動(dòng)相與固定相平均濃度達(dá)傳質(zhì)平衡時(shí)的一段柱高(8)溶量因子固定相中溶質(zhì)總量與流動(dòng)相中溶質(zhì)總量之比第12頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六色層分離法基本原理第13頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六色層分離法基本原理第14頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六分子篩層析示意圖t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量:>>第15頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六分配系數(shù)在一定的溫度下,溶質(zhì)在兩液相之間的平衡關(guān)系服從分配定律:

Kd=C1/C2Kd為分配系數(shù)C1,C2為兩液相中的溶質(zhì)濃度。應(yīng)用條件:溫度一定低濃度第16頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六解離常數(shù)和分離因數(shù))mt-結(jié)合溶質(zhì)分子的有效位子總濃度m-空余的有效結(jié)合位子濃度q-溶質(zhì)在固相的濃度c-溶質(zhì)在液相的濃度解離常數(shù)第17頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六圖3恒定緩沖液條件下,色層分離的拖尾現(xiàn)象第18頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

Rf=

阻滯因數(shù)Am—流動(dòng)相的平均截面積As---固定相的平均截面積流動(dòng)相的移動(dòng)距離=V/Am第19頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六洗脫容積Ve在柱色層分離中,使溶質(zhì)從柱中流出時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積第20頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六第21頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六理論塔板fr—第r塊塔板上溶質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:r=nE/(E+1)時(shí)rmax=nE/(E+1)最大濃度塔板rmax=nE/(E+1)E=第22頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六N越大,加入的溶劑越多,展開的時(shí)間越長色帶下移高峰濃度減少、色帶擴(kuò)大第23頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六層析介質(zhì)要求:(1)不溶于流動(dòng)相(2)化學(xué)穩(wěn)定(3)機(jī)械強(qiáng)度(4)大的表面積(5)粒度均勻?qū)游鼋橘|(zhì)種類無機(jī)(氧化鋁,硅膠,活性碳)有機(jī)(瓊脂糖,纖維素,聚丙烯酰胺等)第24頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六常用層析介質(zhì)氧化鋁:(活性氧化鋁)它是一種多孔性、高分散度固體(1)有很大的比表面積,其微孔表面具有吸附性能。(2)分子式Al2O3簡單,空間形態(tài)復(fù)雜,8種以上的形態(tài)(3)同一形態(tài)宏觀結(jié)構(gòu)性質(zhì)如密度、孔隙率、孔徑分布、比表面積等存在差異(4)吸附量與含水量關(guān)系很大制備:由氫氧化鋁加熱脫水得到的。吸附基團(tuán):鋁離子種類:堿性:由氫氧化鋁高溫脫水,用于堿性穩(wěn)定的溶質(zhì)酸性:堿性氧化鋁經(jīng)鹽酸洗滌,用于在酸性穩(wěn)定的溶質(zhì)中性:堿性氧化鋁經(jīng)水洗后活化制得應(yīng)用:有機(jī)溶劑中分離天然成分第25頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六第26頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六硅膠硅膠是由多聚硅酸經(jīng)分子間脫水而形成的一種多孔性物質(zhì)(1)化學(xué)組成SiO2.XH20,(2)屬于無定形結(jié)構(gòu),基本結(jié)構(gòu)質(zhì)點(diǎn)為Si—O四面體,相互堆積形成硅膠的骨架。質(zhì)點(diǎn)間的空間即為硅膠的孔隙。(3)硅膠中的水以羥基的形式和硅原子相連而覆蓋于硅膠表面。硅膠的分類(常以孔徑大小來分),(1)特細(xì)孔硅膠(0.8nm以下)。

(2)細(xì)孔硅膠(1.5—2.0nm)(3)中孔硅膠(4.0一5.0nm)(4)粗孔硅膠(10.nm以上)應(yīng)用:吸附層析劑與分配層析劑優(yōu)先吸附極性分子及不飽和的碳?xì)浠衔?,用于天然產(chǎn)物分離,可用在水溶液中或有機(jī)溶劑中第27頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六瓊脂糖由海洋生物瓊脂提取得到的主要成分

①中性不帶電②水溶性線狀多糖③高親水性,含大量羥基④能制成多孔性凝膠,分離大分子制備:

①去除帶電瓊膠成分②將溶化的瓊脂糖采用懸浮,乳化或噴珠的方法制得珠狀介質(zhì)。③采用交聯(lián)劑增加介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度第28頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

瓊脂糖的基本結(jié)構(gòu)單位和親水性凝膠結(jié)構(gòu)a瓊脂糖結(jié)構(gòu)b親水性凝膠結(jié)構(gòu)第29頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六瓊脂糖(2)介質(zhì)商品種類Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B。經(jīng)過交聯(lián)而增加機(jī)械強(qiáng)度的瓊脂糖SepharoseCL-2B,SepharoseCL-4B,SepharoseCL-6B應(yīng)用水溶液中分離蛋白質(zhì)第30頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六葡聚糖α-1,6相連的葡萄糖聚合物,由環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)得到珠粒性質(zhì):(1)親水性比瓊脂糖高(羥基數(shù)多)(2)化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性好(3)孔度與機(jī)械強(qiáng)度與交聯(lián)度有關(guān)(4)用于凝膠過濾分子篩應(yīng)用:水溶液中分離蛋白質(zhì)等第31頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六纖維素β-1,4相連的D-葡萄糖(偶而有1,6鍵合)線性天然高聚物(1)親水(2)微晶與無定型兩部分組成,缺乏孔度大孔珠狀纖維素(1)高孔度(2)高機(jī)械強(qiáng)度(3)親水性強(qiáng)應(yīng)用:離子交換分離蛋白質(zhì)介質(zhì)第32頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六聚丙烯酰胺性質(zhì):(1)丙烯酰胺與交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺共聚(2)烷烴骨架與酰胺側(cè)鏈(3)控制交聯(lián)劑比例可控制網(wǎng)格孔度(4)親水好,但不如多糖介質(zhì)

(5)機(jī)械強(qiáng)度差應(yīng)用:(1)凝膠過濾(2)電泳介質(zhì)第33頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六親和層析

親和層析(AffinityChromatography)是利用生物體內(nèi)存在的特異性相互作用的分子對(duì)而設(shè)計(jì)的層析方法。生物體內(nèi)相互作用的分子對(duì):(1)酶—底物或抑制劑(2)抗原—抗體(3)激素—受體(4)糖蛋白與凝集素(5)生物素—生物素結(jié)合蛋白等第34頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

基質(zhì)活化方法與配基偶聯(lián)活化(activation):

基質(zhì)(matrix)上的化學(xué)基團(tuán)是不活潑的,無法與配基直接偶聯(lián),通過化學(xué)反應(yīng)使介質(zhì)上化學(xué)基團(tuán)處于活化狀態(tài)。(1)大分子配基如蛋白質(zhì)等可與活化基質(zhì)直接偶聯(lián)。(2)小分子配基,在基質(zhì)與配基之間插入若干碳原子手臂(spacer),然后再與配基偶聯(lián)。(3)環(huán)氧氯丙烷,1,4-丁二醇縮水甘油醚本身是活化劑亦具有手臂作用。第35頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六活化方法(1)A溴化氰法溴化氰在堿性條件下與多糖上的羥基反應(yīng)導(dǎo)入氰酯鍵或亞氨碳酸酯到基質(zhì)上、進(jìn)而與配基偶聯(lián)優(yōu)點(diǎn):(1)適用于含羥基多糖及含羥基的合成基質(zhì)(2)用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶聯(lián)(3)操作步驟簡單,重現(xiàn)性好。(4)偶聯(lián)條件溫和,特別適用于偶聯(lián)敏感性生物大分子。缺點(diǎn):(1)形成的異脲鍵易產(chǎn)生非特異性吸附;(2)共價(jià)鍵不穩(wěn)定,配基容易脫落;(3)活化操作危險(xiǎn)性大,反應(yīng)后的殘余液需經(jīng)處理再排放。

第36頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六溴化氰活化與配基偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)式圖6第37頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

活化方法(2)B環(huán)氧氯丙烷活化

(1)所形成的共價(jià)鍵穩(wěn)定,配基不易落脫(2)自動(dòng)引入手臂,(3)有更小的非特異性吸附,(4)活化操作簡單易行,危險(xiǎn)性相對(duì)較小缺點(diǎn):在強(qiáng)堿性條件反應(yīng),不適用于堿敏感物質(zhì)。第38頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六環(huán)氧氯丙烷活化反應(yīng)式第39頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

環(huán)氧基的氨化及偶聯(lián)配基反應(yīng)第40頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六活化方法(3)C對(duì)甲苯磺酰氯活化(1)用于活化含羥基基質(zhì)、將羥基轉(zhuǎn)化為磺?;?、在配基偶聯(lián)后容易脫落、不引入電荷。(2)配基與羥基間形成穩(wěn)定化學(xué)鍵。(3)活化操作需在無水丙酮環(huán)境中進(jìn)行,偶聯(lián)配基根據(jù)情況、既可在有機(jī)相中進(jìn)行、亦可在水相中進(jìn)行。第41頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六對(duì)甲苯磺酰氯活化反應(yīng)式第42頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六手臂(spacer)作用:減少親和作用空間位阻連接:通過化學(xué)反應(yīng)與活化基團(tuán)連接手臂化合物:乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH環(huán)氧氯丙烷1、4-丁二醇縮水甘油醚第43頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六D殘余電荷的掩蔽目的:防止產(chǎn)生非特異性吸附原理:通過化學(xué)反應(yīng)消除基團(tuán)上的電荷方法:(1)自發(fā)水解(2)氨基:醋酸酐(3)羧基:水溶性碳二亞胺第44頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六手臂氨末端的掩蔽第45頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六殘留羧基掩蔽反應(yīng)第46頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六E活化基團(tuán)與配基密度測(cè)定方法:(1)氨基或羧基可用酸堿滴定。(2)有紫外吸收特征的、可用紫外分光法測(cè)定。(3)通過測(cè)定反應(yīng)余液中配基殘留量推算(偶聯(lián)率較高的情況)(4)某些情況下需將親和膠樣品分解破壞測(cè)定第47頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六F親和介質(zhì)吸附容量測(cè)定

方法:(1)流出曲線法:

流出液中目標(biāo)蛋白濃度達(dá)到進(jìn)口濃度的90%(2)

Langmiur吸附等溫線法第48頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

層析裝置與操作裝置1

普通2高級(jí)柱操作(1)裝柱:均勻,無氣泡(2)平衡(equilibrium):緩沖液,pH,鹽濃度(3)上樣(loading):蛋白濃度,pH,鹽濃度,緩沖液(4)洗滌(washing):pH,鹽濃度,洗滌劑,緩沖液(5)洗脫(elution):條件與吸附相反(6)清洗(cleaning):弱酸,弱堿,蛋白質(zhì)變性劑(尿素,鹽酸胍,硫氰酸鹽(7)再生:與平衡條件相同第49頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六柱層析分離法的有關(guān)裝置第50頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六Pharmacia?KTA層析系統(tǒng)

第51頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六Pharmacia?KTA層析系統(tǒng)

第52頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六裝置⑴泵⑵混合器⑶層析柱⑷檢測(cè)器⑸記錄儀⑹分部收集器第53頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六裝柱調(diào)糊:50%(緩沖液+介質(zhì))一次連續(xù)加入懸膠液打開出口閥:層析劑沉降排除空氣檢查均勻度第54頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六上樣樣品處理:(1)溶解A調(diào)整濃度B鹽CpH(2)過濾:除去不溶物流速:根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定上樣量:80%吸附容量第55頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六淋洗(去除殘留在介質(zhì)中的雜質(zhì))鹽濃度pH表面活性劑(0.1-0.5%)淋洗體積:根據(jù)流出液雜蛋白濃度而定防止產(chǎn)物丟失又要除去雜質(zhì)第56頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六洗脫方法按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機(jī)理專一性洗脫(specificelution)非專一性洗脫(nonspecificelution)添加劑:乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積:5倍床體積第57頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六恒定洗脫第58頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六分步洗脫第59頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六(c)梯度洗脫第60頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六清洗與再生弱酸:HAC堿:氨水促溶劑:1-3MKCNS、6-8M尿素、

6M鹽酸胍極性溶劑:20%乙醇表面活性劑:吐溫-80緩沖液平衡第61頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六思考題1理解概念:解離常數(shù),分離因素,阻滯因子,理論塔板高度,洗脫體積,分辨率。2不同的層析分類方法各有何意義?3常用的層析介質(zhì)有哪些?各適用于何種狀況下的分離?4親和層析的機(jī)理是什么?5配基偶聯(lián)后殘留電荷對(duì)分離有何影響?如何消除?6小分子配基為何需插入手臂?7層析柱洗脫方式有幾種?各適用于何種情況?第62頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六

第8章

色層分離法

(第二講)

第63頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六柱層析分離法的有關(guān)裝置第64頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六裝置⑴泵⑵混合器⑶層析柱⑷檢測(cè)器⑸記錄儀⑹分部收集器第65頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六裝柱調(diào)糊:50%(緩沖液+介質(zhì))一次連續(xù)加入懸膠液打開出口閥:層析劑沉降排除空氣檢查均勻度第66頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六上樣樣品處理:(1)溶解A調(diào)整濃度B鹽CpH(2)過濾:除去不溶物流速:根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定上樣量:80%吸附容量第67頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六淋洗(去除殘留在介質(zhì)中的雜質(zhì))鹽濃度pH表面活性劑(0.1-0.5%)淋洗體積:根據(jù)流出液雜蛋白濃度而定防止產(chǎn)物丟失又要除去雜質(zhì)第68頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六洗脫方法按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機(jī)理專一性洗脫(specificelution)非專一性洗脫(nonspecificelution)添加劑:乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積:5倍床體積第69頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六恒定洗脫第70頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六分步洗脫第71頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六(c)梯度洗脫第72頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六清洗與再生弱酸:HAC堿:氨水促溶劑:1-3MKCNS、6-8M尿素、

6M鹽酸胍極性溶劑:20%乙醇表面活性劑:吐溫-80緩沖液平衡第73頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六無機(jī)吸附劑羥基磷灰石(hydroxyapatite、Ca10(PO4)6(OH)2(1)純化蛋白質(zhì)的無機(jī)介質(zhì)。(2)廉價(jià),易于大規(guī)模應(yīng)用,(3)使用后易于清潔吸附機(jī)理與規(guī)律:偶極離子作用而不是離子交換作用(1)每一個(gè)正電荷區(qū)周圍都有負(fù)電荷區(qū),反之亦然。(2)蛋白質(zhì)在中性pH范圍具有最大的形成毗鄰正負(fù)離子的可能性?!綦娦宰饔檬撬降鞍踪|(zhì)的重要原因第74頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六羥基磷灰石(HydroxyIapatite,簡稱HAP)是一種結(jié)晶狀無機(jī)鹽,屬六方晶系,存在于自然界中,與生物體有很好的相容性,也是目前分離各類生物分子最常用的液相色譜介質(zhì)之一.在分離過程中,待分離分子以多種方式吸附于HAP晶體表面,即分子以不同的局部面向HAP晶體表面,并以不同方向排列.根據(jù)統(tǒng)計(jì)力學(xué)定律,在這些不同的吸附配置之間遵從Boltzmann分布,且能量最穩(wěn)定狀態(tài)配置的幾率最高,酸性分子(pI<7)主要吸附于c位點(diǎn),堿性分子(pI>7)主要吸附于P位點(diǎn).由于HAP晶面具有規(guī)則的立體化學(xué)結(jié)構(gòu),可以分辨被吸附分子表面上原子幾何排列的微小差別.因此,HAP在DNA、核苷酸、多肽以及多種蛋白質(zhì)的分離中得到廣泛的應(yīng)用第75頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六蛋白質(zhì)在無機(jī)鹽表面的偶極作用第76頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六工藝條件吸附:(1)pH在6—9之間吸附最有可能發(fā)生(2)低濃度緩沖液離子(通常是磷酸鹽)(3)低鹽濃度洗脫:(1)增加緩沖液濃度(2)高鹽濃度中進(jìn)行(3)鹽可以采用恒定或梯度形式應(yīng)用。第77頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六紫球藻B—藻紅蛋白的分離純化

紫球藻(Porphyridiumcruentum)的藻紅蛋白粗提物經(jīng)硫酸銨沉淀及透析后,分別用羥基磷灰石(HA)和SephadexG-100兩種方法柱層析,均可分離純化出B-藻紅蛋白(B-PE),純度(A545nm/A280nm)分別為4.92和3.78,兩種方法純化后的B-PE在聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳時(shí)均得到一條帶,B-PE的最大吸收峰在545nm,其室溫?zé)晒獍l(fā)射峰為574.5nm。第78頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六藻紅蛋白可作為熒光探針,用于免疫熒光檢測(cè)、熒光顯微、組織化學(xué)等方面。藻膽蛋白還是理想的天然色素,可應(yīng)用于食品、化妝品工業(yè)研究發(fā)現(xiàn)從螺旋藻中提取的藻藍(lán)蛋白具有直接調(diào)節(jié)和激活免疫反應(yīng)的生理活性。第79頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六吸附:1mmol/L,PH6.8磷酸緩沖液預(yù)平衡(1.8cm×4cm)層析柱上樣量:2mL洗脫:磷酸鹽緩沖液1、5、50、l00、200mmol/L,PH6.8,+0.1MOL/LNaCl溶液洗脫速度:18mL/h分步收集洗脫液(每管約4mL)紫球藻B—藻紅蛋白的分離純化

第80頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六B-藻紅蛋白的洗脫曲線第81頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六體積排阻層析

SizeExclusionChromatography凝膠滲透層析

GelPermeationChromatography凝膠排阻層析

GelExclusionChromatography凝膠過濾

GelFiltration分子篩層析

GelChromatography22.9凝膠層析法第82頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六凝膠層析的用途

應(yīng)用對(duì)象——主要是大分子物料,特別是蛋白質(zhì)混合物。主要優(yōu)點(diǎn)——相對(duì)成本低、操作簡便,具有相對(duì)較大規(guī)模操作的能力。其它用途——脫鹽,生物大分子按分子大小分級(jí)分離以及分子量測(cè)定等。第83頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六特性參數(shù)

排阻極限(exclusionlimit)分級(jí)范圍(Fractionationrange)吸水量(waterregains)凝膠粒徑(凝膠顆粒大小)床體積(bedvolume)空隙體積(voidvolume)第84頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六排阻極限不能進(jìn)入到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子量,稱為排阻極限。這時(shí)的洗脫體積就等于孔隙體積V0。譬如SephadaxG50的排阻極限是30kD。第85頁,共97頁,2022年,5月20日,3點(diǎn)17分,星期六分級(jí)范圍能為凝膠阻滯、并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子量范圍。譬如:SephadaxG50的分級(jí)范圍為1.5k

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