研制具有較高免疫保護(hù)作用的DNA疫苗

研制具有較高免疫保護(hù)作用的SjserpinDNA疫苗

立項(xiàng)依據(jù)目前我國(guó)仍有108個(gè)縣有血吸蟲(chóng)病流行，69.5萬(wàn)人感染血吸蟲(chóng)病，并且隨著近年來(lái)長(zhǎng)江洪水泛濫和退耕還湖又有重新升高的趨勢(shì)[1]。多年來(lái)，控制血吸蟲(chóng)病以化療為主．輔以易感地帶滅螺的綜合性防治措施，取得較好的效果。但由于在流行區(qū)化療停止后再感染迅速出現(xiàn)和長(zhǎng)期、反復(fù)、大規(guī)模使用吡喹酮化療，血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的潛在耐藥性，迫切需要發(fā)展血吸蟲(chóng)疫苗以補(bǔ)充血吸蟲(chóng)病的防治措施[2]。DNA疫苗作為一種新型的疫苗，已在包括寄生蟲(chóng)感染在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)開(kāi)展了廣泛研究[3]．但是現(xiàn)行的酶抗原，血吸蟲(chóng)肌球蛋白組抗原，血吸蟲(chóng)膜相關(guān)蛋白，血吸蟲(chóng)鈣相關(guān)蛋白，血吸蟲(chóng)線粒體相關(guān)蛋白和信號(hào)蛋白，血吸蟲(chóng)性別相關(guān)蛋白等制作出的DNA疫苗的免疫保護(hù)效果僅有小幅增加[4]。最新研究表明，來(lái)自哺乳動(dòng)物內(nèi)部的消化酶：胰蛋白酶和胰彈性蛋白酶(PE)很容易被抑制[5],以纖溶酶原激活物抑制因子2為代表了一種細(xì)胞抑制劑（serpin）可以通過(guò)一種獨(dú)立的途徑（不經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體）分泌到細(xì)胞外[6]。據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道多房棘球絳蟲(chóng)六鉤蚴入侵人體階段，分泌的serpin，能夠阻斷宿主消化酶的酶解攻擊，這樣，Sjserpin就可以在免疫系統(tǒng)做為一個(gè)靶位，引發(fā)免疫反應(yīng)[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)將能夠表達(dá)serpin的血吸蟲(chóng)的一段cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作出SjserpinDNA疫苗，并對(duì)小鼠保護(hù)性免疫進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而為人類血吸蟲(chóng)防治提供新思路。

實(shí)驗(yàn)摘要提取全長(zhǎng)的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株絲氨酸蛋白酶抑制劑(Sjserpin)基因，并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建DNA疫苗

pcDNA3.1—serpin；制備SjserpinDNA疫苗和對(duì)照pcDNA3.1。將20只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B2組。A組小鼠肌注100ugpcDNA3.1；B組注射100ugpcDNA3.l-Sjserpin。每隔2周各免疫1次，共3次。第8周每鼠感染30±2條／只尾蚴，45d后剖殺，計(jì)數(shù)成蟲(chóng)及肝內(nèi)蟲(chóng)卵。采用免疫組化法檢測(cè)局部組織中Sjserpin的表達(dá)；用脾細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)經(jīng)Sjserpin刺激后．攻擊前、后小鼠脾細(xì)胞IL-2,IL-4,IL-10和IFN-r的水平。用ELISA檢測(cè)血清中抗Sjserpin抗體。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)2DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制備1研究SjserpinDNA疫苗作用機(jī)制

3

數(shù)據(jù)處理4實(shí)驗(yàn)方法步驟

1.1

1.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Sjserpin的基因序列設(shè)計(jì)兩條引物P1和P2，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別在Pl和P2的5'端引入BamHI和Xhol的酶切位點(diǎn)。以日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制備Sjserpin亞克隆入pcDNA3.1

1.2

將PCR產(chǎn)物與T載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)提取Sjserpin，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物Sjserpin再與pcDNA3.1連接，用同樣方法得到重組質(zhì)粒[9]。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，作DNA測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。

1.3

DNA疫苗pcDNA3.1，pcDNA3.1-Sjserpin的制備按說(shuō)明書用大規(guī)模質(zhì)粒純化試劑盒Qiagen2500大量制備，制得的質(zhì)粒。DNA溶解于無(wú)菌的生理鹽水(0.9％)中．在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD值，計(jì)算DNA濃度。

2.動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)將20只小鼠隨機(jī)分為A，B2組，每組10只。A組(pcDNA3.1組)經(jīng)小鼠股四頭肌注射100ugpcDNA3.1質(zhì)粒DNA；B組(Sjserpin組)注射100ugpcDNA3.l-sjserpin質(zhì)粒DNA。分別于第0、2、4周各免疫接種一次（劑量和方法相同)．于第8周每鼠以30+/-2條／只尾蚴用腹部貼片法攻擊感染，攻擊后45d剖殺小鼠收集成蟲(chóng)計(jì)數(shù)，取出肝臟稱重后用5％KOH37℃消化過(guò)夜，進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。按公式：減蟲(chóng)率=(對(duì)照組平均每鼠成蟲(chóng)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均每鼠成蟲(chóng)數(shù))／對(duì)照組平均每鼠成蟲(chóng)數(shù)×100％．減卵率=(對(duì)照組平均每鼠蟲(chóng)卵數(shù)一實(shí)驗(yàn)組平均每鼠蟲(chóng)卵數(shù))/對(duì)照組平均每鼠蟲(chóng)卵數(shù)×100％．計(jì)算減蟲(chóng)率及減卵率。

3.1

3.研究SjserpinDNA疫苗作用機(jī)制

Sjserpin在小鼠局部肌肉組織內(nèi)的表達(dá)每組各取2只小鼠在第一次免疫后10d再以同劑量加強(qiáng)免疫一次，4d后剖殺小鼠，取兩腿股四頭肌做冰凍切片，Sjserpin的組化檢測(cè)首先在每張冰凍切片上加入日本血吸蟲(chóng)重感染兔血清．4℃過(guò)夜后加二抗羊抗兔IgG-HRP，反應(yīng)后經(jīng)DAB顯色，顯微鏡下觀測(cè)結(jié)果。

3.2

細(xì)胞因子檢測(cè)訪談結(jié)果與析雙抗體夾心法分別于攻擊前后2周每組各取兩只小鼠拉頸處死，取出脾臟，常規(guī)法制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，用10％FCSRPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為6*10^3個(gè)／ml，每孔加入100ul脾細(xì)胞。每組分別用100ConA(10ug／ml)和serpin(10ug／m1)進(jìn)行刺激。空白孔加入100ul10％FCSRPMI1640，于5％CO237℃培養(yǎng)72h，離心收集上清進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。細(xì)胞因子檢測(cè)按說(shuō)明書采用雙抗體夾心法。

3.3

抗體檢測(cè)攻擊前2周各組分別取6份血清、攻擊后各組取6份血清．用ELISA法檢測(cè)血清中的Sjserpin抗體。

4數(shù)據(jù)處理減蟲(chóng)均數(shù)和減卵均數(shù)數(shù)據(jù)用均數(shù)+-標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-wayANOVA分析，P<0.05表示差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性[10]統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

參考文獻(xiàn)[1]．陳賢義．姜慶五，趙根明．等2000年全國(guó)血吸蟲(chóng)疫情通報(bào)，中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志，2000．13：129-131.[2].McManusDP.AvaccincagainstAsiaschistosonnasis:ticcstoryandunfolds,IntJParasitol.2000，30：265—27l.[3]．RamsayAJ.RamshawLA,AdaGL.etal.DNA1997．75：360365.[4].曹建平，李小紅，劉述先我國(guó)血吸蟲(chóng)疫苗研究進(jìn)展和展望，中國(guó)傳染病雜志，2005.12第23卷第六期.[5].ArminMerckelbach,AndreasRuppelBiochemicalpropertiesofanintracellularserpinfromEchinococcusmultilocularis.156(2007)84–88.[6].RitchieH,BoothNA.Secretionofplasminogenactivatorinhibitor2byhumanperipheralbloodmonocytesoccursviaanendoplasmicreticulumgolgi-independentpathway.ExpCellRes1998;242:439–50.[7].PrevotPP,AdamB,ZouaouiBoudjeltiaK,etal.Anti-haemostaticeffectsofaserpinfromthesalivaofthetickIxodesricinus.JBiolChem2006;281:26361–9.[8].ArminMerckelbach,AndreasRuppelBiochemicalpropertiesofanintracellularserpinfromEchinococcusmultilocularis.156(2007)84–88.[9].王陽(yáng)陽(yáng)，劉淼，朱紹春等日本血吸蟲(chóng)表膜蛋白Tetraspanin2-A基因的克隆、表達(dá)與鑒定中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志2008.2第26卷第一期[10].汪世平，高冬梅，何卓，余路新等日本血吸蟲(chóng)核糖體蛋白SjRPS4、SjRPL7DNA疫苗對(duì)小鼠免疫保護(hù)作用研究1002—2694(2010)02—0097—04.

本項(xiàng)目創(chuàng)新之處

首先，DNA疫苗疫苗做為第三代疫苗廣泛被人研究，它與傳統(tǒng)的疫苗相比有許多優(yōu)點(diǎn)：①安全可靠，其生產(chǎn)過(guò)程中不需要大量病原體的培養(yǎng)，無(wú)減毒活疫苗可能引起的致病作用；②更為有效，可引起細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)；③制備簡(jiǎn)便，只需要對(duì)編碼抗原的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)和克隆，不需要在體外表達(dá)和純化蛋白；④價(jià)格低廉、使用劑量低、便于運(yùn)輸保存、易于構(gòu)建和大規(guī)模生產(chǎn)；⑤DNA疫苗可能作為細(xì)胞內(nèi)的“抗源儲(chǔ)藏器”，抵抗抗體的廓清，在沒(méi)有免疫接種的情況下，連續(xù)不斷地產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物刺激免疫系統(tǒng)，從而保持長(zhǎng)期的免疫記憶，甚至可終生免疫；⑥不同DNA序列組成的混合DNA疫苗可對(duì)付變異抗原的侵襲；⑦可針對(duì)相同或不同病原體的幾種抗原進(jìn)行聯(lián)合免疫。其次，以血吸蟲(chóng)表達(dá)的serpi