遺傳工程動物模型課件

遺傳工程動物模型Chapter11主講實驗動物中心張仕斌11/25/20221第一節(jié)概述人們經(jīng)過了長期不懈的努力，渴望揭開生命之謎，雖有進展，但謎仍然是謎。然而，隨著2001年6月人類基因組草圖公布，生命科學(xué)也隨著進入到一個新的紀元－后基因組時代，即由結(jié)構(gòu)基因組轉(zhuǎn)向功能基因組的研究，大規(guī)模、系統(tǒng)地研究基因功能及其在生理和病理過程中的作用。因此，遺傳工程動物模型是必不可少的研究工具。一、定義運用各種技術(shù)手段有目的地干預(yù)動物的遺傳組成，導(dǎo)致動物新的性狀的出現(xiàn)，并使其能有效地遺傳下去，形成新的可供生命科學(xué)研究和其他目的所用的動物模型，這類動物可被稱為遺傳工程動物模型。顯微注射法胚胎干細胞法

(embryonicstemcells，ES細胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法細胞核移植ENU誘變?nèi)?、基本方法第二?jié)轉(zhuǎn)基因動物Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序TGM。1982年P(guān)almiter等運用此法得到的所謂“超級巨鼠”,曾引起整個生物學(xué)界的轟動。到目前為止，人類已獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等等大小動物。從轉(zhuǎn)基因動物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學(xué)遺傳、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開發(fā)研究等。一、概念通過實驗手段將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到動物生殖細胞中，并能穩(wěn)定遺傳，由此獲得的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。

遺傳改變：

外源DNA的插入使基因組中任何一個基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排；導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實體。顯微注射法胚胎干細胞法

(embryonicstemcells，ES細胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法細胞核移植三、基本方法1.程序準備假孕母鼠受精卵的準備基因?qū)肱咛ヒ浦矊τ资蟮蔫b定外源DNA大小基本不受限制（1～50kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高2.優(yōu)點：基因特異表達的研究發(fā)現(xiàn)基因的新功能發(fā)現(xiàn)新基因建立基因表達、調(diào)控的動物模型建立人類疾病的動物模型等4.應(yīng)用（二）胚胎干細胞（ES）法ES細胞是早期胚胎的內(nèi)細胞團經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細胞系。將攜帶有外源基因的ES細胞注入到動物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動物。它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。在ES細胞上的基因操作：可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細胞。因此，借用ES細胞系可將人們企望的某種不完整的、無功能基因直接引入到ES細胞中，通過細胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動物后代。胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性外源目的基因打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidine

kinase)1.必備條件打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細胞：重組置換基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種2.基本程序InjectionofES

cellsintoblastocysts外源基因整合情況的可控性高。可預(yù)先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便。3.優(yōu)點ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體目前，胚胎干細胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動物上應(yīng)用較晚。4.缺點遺傳病研究腫瘤的研究生物制藥5.在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（三）反轉(zhuǎn)錄病毒法（四）精子載體法細胞核移植法轉(zhuǎn)基因動物是在單細胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。而許多基因的表達是無法通過轉(zhuǎn)染的方法來研究；基因表達有時空與組織的特異性；外源基因的表達受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；因此，只有通過轉(zhuǎn)基因的動物才有可能研究基因的表達、調(diào)控及基因之間的相互作用。四轉(zhuǎn)基因動物的意義進行功能基因組學(xué)的研究，研究外源基因在動物整體水平的表現(xiàn)調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)基因動物疾病模型可用來進行疾病發(fā)病學(xué)和治療性研究。也可改變動物基因使其表現(xiàn)型更適合人類需要。還可以用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)一些人類所需的生物活性物質(zhì)。第三節(jié)ENU誘變小鼠ENU致突變技術(shù)是高通量大規(guī)模篩選新基因及發(fā)育突變技術(shù)的化學(xué)方法：當(dāng)人們還不能獲得ES細胞時，小鼠遺傳學(xué)家最常用的方法是用乙烷基亞硝基脲（ENU)處理公鼠，然后在后代中篩選顯性或隱性突變的小鼠。隨著越來越多的基因和微衛(wèi)星標記被定位，突變基因的定位也隨之變得容易；因此對小鼠進行化學(xué)誘變將越來越變得低成本而高效益。一、ENU誘變的技術(shù)路線1.ENU誘變的簡單流程ENU處理雄性C57BL/6小鼠，10周后與同品系母鼠配種，F(xiàn)l離乳時篩查，陽性突變小鼠留種，與同品系正常母鼠配種，F(xiàn)l有親代突變表型者留種(為顯性遺傳)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隱性突變篩選需由Fl互交或F2回交Fl，發(fā)現(xiàn)突變表型者留種，進行進一步的研究。2．顯性突變的篩選10周齡的雄性小鼠按150mg/kg體重的劑量腹腔注射ENU，60天后待處理公鼠恢復(fù)生殖能力后與野生型雌性配種，通過對F1代小鼠進行形態(tài)學(xué)、行為學(xué)、血液學(xué)、生理生化等指標的檢測，可篩選基因的顯性突變。

3．隱性突變的篩選基因隱性突變的篩選需將F1代的雄性鼠與野生型雌性小鼠交配，再將F1代雌性小鼠與F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，獲得F3代小鼠，并將F3代小鼠用于大規(guī)模篩選。

4．基因驅(qū)動法與表型驅(qū)動法相結(jié)合的ENU誘變篩選單基因剔除是典型的基因驅(qū)動的研究。研究者必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關(guān)的染色體組克隆，繪制相應(yīng)的物理圖譜，構(gòu)建特異性的打靶載體以及篩選中靶ES細胞等。通常一個基因剔除純合子小鼠的獲得需要1年或更長的時間。面對人類基因組計劃產(chǎn)生出來的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統(tǒng)的基因剔除方法顯得力不從心，不符合現(xiàn)代生物學(xué)高通量、大規(guī)模篩選的要求。用放射線導(dǎo)致缺失和突變以及用各種化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)點突變等許多經(jīng)典的遺傳學(xué)研究屬于表型驅(qū)動的研究。早在20世紀90年代初，研究者就提出帶有第7號染色體缺失的小鼠可用來篩選ENU誘導(dǎo)的缺失區(qū)域內(nèi)的點突變?；虼虬械难芯窟M展使得研制攜帶染色體組任意片段的缺失、倒位或者易位突變小鼠成為可能。RamirezSolis應(yīng)用位點特異的重組酶系統(tǒng)首次在小鼠ES細胞中實現(xiàn)了最長3～4cM染色體組片段的缺失、倒位和重復(fù)。并采用同源重組技術(shù)構(gòu)建了大片段染色體缺失的基因剔除小鼠。將基因打靶這種基因驅(qū)動的研究和ENU誘變這種表型驅(qū)動的研究結(jié)合起來具有明顯的優(yōu)勢。ENU誘變可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的突變體小鼠，但點突變的鑒定依然是費時費力的工作。采用通過基因打靶獲得的特定染色體組缺失或者易位的ES細胞建立突變小鼠可以簡化篩選的程序和工作量，并把點突變限定在序列已知的區(qū)域內(nèi)，這樣可以大大簡化點突變鑒定的過程。

5．ENU突變表型篩選ENU誘導(dǎo)突變表型的篩選包括形態(tài)異常表型、行為和神經(jīng)功能異常、血液學(xué)和臨床生化指標和老年癥狀篩選等。形態(tài)異常表型的篩選通常在小鼠分窩時進行。行為和神經(jīng)功能異常篩選包括肌肉缺陷和運動神經(jīng)元低下、感官缺陷、精神、小腦平衡、自律行為方面的缺陷等。有表型的小鼠將通過更復(fù)雜的測試，如探險運動、食物攝取、學(xué)習(xí)和記憶；焦慮、神經(jīng)心理學(xué)測試等等。血液學(xué)測試在小鼠6～10周時進行。隨機挑選無表型的小鼠飼養(yǎng)1年以上再進行老年癥狀表型篩選。主要觀察是否具有老年相關(guān)疾病的表型，包括體重增加、動脈硬化、骨質(zhì)疏松、心血管異常、感知功能和行為異常等等。ENU誘變的最終目的是為了鑒定導(dǎo)致表型的突變基因，發(fā)現(xiàn)新的基因和新的代謝途徑，促進人類對哺乳類動物基因功能的了解。位置候選基因法是鑒定突變基因的首選方法：用50只突變回交小鼠做連鎖分析。突變大致可定位在10～20cM的范圍內(nèi)。分析500只回交小鼠可將突變定位在1cM的范圍內(nèi)?；蝌?qū)動法與表型驅(qū)動法相結(jié)合的ENU誘變篩選的小鼠，其突變已被定位在特定的染色體組區(qū)域內(nèi)，因而不用再作連鎖分析。二、ENU誘導(dǎo)點突變的鑒定在突變基因被精確地定位后，結(jié)合突變小鼠的表型進行候選基因的預(yù)測。候選基因的線索可從多方面的分析獲得。比如小鼠表型是否與某種已知突變基因的人類疾病相似；小鼠的表型與候選范圍內(nèi)某些基因的表達模式具有相關(guān)性；候選范圍內(nèi)某些基因的功能與小鼠表型可能相關(guān)等。小鼠基因組已定位近7000多個微衛(wèi)星，使得染色體上大約每0.35cM便有一個標記。可以根據(jù)已知微衛(wèi)星的位置定位突變基因，相信隨著技術(shù)的進步，穩(wěn)定的高通量基因型鑒定方法將會極大地發(fā)展。我們目前所認知的基因絕大多數(shù)來源于對突變基因的研究，突變意味著某一些基因?qū)ι矬w的原有功能發(fā)生了變化，通過研究這種變化的遺傳機制，可以獲得有關(guān)基因功能的極有價值的資料。只有通過分析不正常才能知道基因的正常功能是什么，才能通過對突變的分析建立起因果關(guān)系。大量突變動物模型的獲得為基因功能的研究提供了充足的研究資源。三、ENU誘變小鼠的應(yīng)用ENU誘變小鼠的研究利用基因組研究的最新成果，不僅能促進分子遺傳學(xué)的發(fā)展，為人類疾病的發(fā)病機制、功能基因及相關(guān)學(xué)科研究提供大量不同表型的動物模型，而且，ENU誘變是近年來被公認的最有潛力的制造突變型動物的手段，新的動物模型的建立有可能導(dǎo)致新的疾病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，對開發(fā)具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的藥物標靶和相應(yīng)藥物至關(guān)重要，具有潛在的商業(yè)價值。