細胞免疫治療課件

細胞免疫治療吳艷峰2015-11-12細胞治療是指采用經(jīng)體外操作過的自體、異體或者異種的細胞用于疾病或損傷的治療、預防。用于腫瘤、艾滋病、肝炎、糖尿病、器官移植、心血管疾病、脊髓損傷、帕金森病等領域腫瘤的繼承性免疫治療治療性細胞疫苗腺體細胞移植神經(jīng)細胞及心血管細胞移植為基礎的細胞治療技術(shù)以鎮(zhèn)痛和抗衰老的牛腎上腺細胞和羊胎細胞的異種細胞治療技術(shù)體細胞治療已經(jīng)成為多種疾病的有效治療方式腫瘤的免疫治療/生物治療抗體腫瘤疫苗樹突狀細胞疫苗過繼細胞治療細胞因子……2013年六大值得關(guān)注的科學領域之一：腫瘤免疫治療Onebookhasclosed,andanewonehasopened.2014年1月2013年度十大科技突破之一：腫瘤免疫治療腫瘤免疫治療方興未艾Cancerimmunotherapyholdsconsiderablepromise以樹突狀細胞為基礎的治療性腫瘤疫苗使腫瘤個性化治療成為可能Dendritic-Cell-BasedTherapeuticCancerVaccinesmightenablethedevelopmentofnext-generationcurativetherapiesforindividualswithcancer在研的多種治療性疫苗將能夠啟動新的T細胞，并誘導慢性活化的非保護性的CD8+T細胞成為健康CD8+T細胞，進而形成CTL發(fā)揮抗腫瘤效應，還可以產(chǎn)生長壽記憶性CD8+

T細胞從而能夠快速產(chǎn)生新的效應T細胞，分泌細胞毒分子，從而防止腫瘤復發(fā)。PaluckaKetal.Immunity.

2013;39(1):38-48多肽重組蛋白腫瘤細胞病毒載體核酸細菌

美國Dendreon公司進行了樹突狀細胞疫苗(PROVENGE)治療雄性激素非依賴的晚期前列腺癌患者的Ⅲ期臨床試驗（2009.4.28），結(jié)果顯示：

PROVENGE治療組的患者中位生存時間高于安慰劑組患者4.1個月（25.8個月vs21.7個月）

PROVENGE治療組的患者三年生存率比安慰劑組高出38%（31.7%vs23%）

IMPACTstudy的結(jié)果p=0.032，高于預期的p=0.043，治療組死亡風險比對照組降低了22.5%（HR=0.775）

PROVENGE的安全性良好，顯著延長患者的中位生存時間，提高三年生存率。腫瘤過繼性細胞免疫治療已成為腫瘤的第四種治療模式?特異性T細胞免疫治療?可實現(xiàn)晚期惡性黑色素瘤的50%以上的CR+PRScience,2002NEJM,2008?可顯著提高晚期惡性黑色素瘤患者的生存期PNAS,2002?T細胞特異性基因修飾?TCR轉(zhuǎn)基因可實現(xiàn)晚期惡性黑色素瘤患者的PRScience,2006?白血病患者的CRSciTranslMed,2011?非特異性細胞免疫治療?αβT細胞可顯著延長術(shù)后患者的無復發(fā)生存期TheLancet,2000韓國KFDAIV期臨床證實?可顯著延長患者的生存期美國II期臨床(NK-92)日本III期臨床(αβT細胞)韓國III期臨床(αβT細胞)限制腫瘤免疫應答的因素細胞免疫治療分類主動性細胞免疫治療（細胞治療性疫苗）被動性細胞免疫治療（過繼性細胞治療）1985CellularImmunotherapy,wherehavewebeen…LAK,TIL,CD3AK,CIK,NK,NKT,γδT,CTL,………Tumorcellvaccine,DendriticCellvaccine…….AdoptiveCellularImmunotherapy2008CellBasedTumourVaccine淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokineactivatedkillercells,LAK)腫瘤浸潤性淋巴細胞(Tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)CD3單克隆抗體激活的腫瘤殺傷細胞(Anti-CD3monoclonalantibodyactivatedkillercells,CD3AK)細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokineinducedkillerceils，CIK)自然殺傷細胞(Naturalkillercells,NK)細胞毒性T淋巴細胞(CytotoxicTlymphocytes,CTL)樹突狀細胞(Dendriticcells,DC)、免疫平衡狀態(tài)細胞毒性T細胞殺傷T輔助細胞的活性樹突狀細胞抗原提呈NK細胞的活性其他效應細胞…正相調(diào)控負相調(diào)控ENHANCERREGULATORSUPPEREESOR調(diào)節(jié)性T細胞腫瘤相關(guān)巨噬細胞抑制性樹突狀細胞髓系抑制性細胞負向免疫分子其他…過繼性免疫治療(Adoptiveimmunotherapy)體外分離細胞抗原提呈細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞）T淋巴細胞自然殺傷（NK）細胞離體擴增、培養(yǎng)、活化細胞因子刺激抗原沖擊基因修飾自體回輸誘發(fā)機體特異性抗腫瘤免疫淋巴因子激活的殺傷細胞

Lymphokine-activatedkillercells,LAKLAK的發(fā)現(xiàn)1980年，美國癌癥研究所的Rosenberg實驗室首次報道了荷瘤小鼠的脾臟淋巴細胞或腫瘤患者的外周血淋巴細胞在含有IL-2的培養(yǎng)液中短期培養(yǎng)可以誘導出一種非特異性的殺傷細胞，能殺傷新鮮分離的實體瘤細胞和多種腫瘤細胞株。其中很多是對CTL和NK不敏感的腫瘤細胞。目前尚未發(fā)現(xiàn)LAK細胞特有的表面標志，許多實驗表明，LAK細胞的前體細胞是NK細胞和T細胞。腫瘤浸潤淋巴細胞

Tumorinfiltratinglymphocyte,TIL1986年Rosenberg研究組首先報道了TIL。TIL細胞表型具有異質(zhì)性：一般來說絕大多數(shù)：CD3陽性細胞不同腫瘤來源：CD4+/CD8+T細胞比例有差異多數(shù)情況下以CD8+T細胞為主隨著體外加IL-2培養(yǎng)時間的延長，CD25+細胞百分率由低逐漸升高。NK細胞的標記(CD16，CD56)在TIL體外加IL-2培養(yǎng)過程中有先增高后降低的趨勢。用機械處理和酶消化方法，從腫瘤局部分離出腫瘤浸潤的淋巴細胞，加入高劑量IL-2體外培養(yǎng)，殘存的腫瘤細胞7-13天全部死亡。與來自PBMC的LAK細胞比較，其特點是:(1)殺傷活性強50-100倍，因此在治療中可以減少效應細胞和IL-2的用量，而且對LAK治療無效的晚期腫瘤仍有一定治療效果；(2)主要由CD8陽性細胞誘導而來,在動物實驗中發(fā)現(xiàn)TIL殺傷腫瘤作用具有特異性；腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤2002.ScienceTIL治療后轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者腋窩（上）、骨盆（中）及腹腔內(nèi)（下）巨大轉(zhuǎn)移灶的消退TIL治療后轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者肝臟巨大轉(zhuǎn)移灶的消退左：治療前；右：治療后CD3抗體激活的殺傷細胞CD3McAbactivatedkillercells,CD3AK抗CD3單抗與IL-2協(xié)同，能顯著提高LAK細胞的數(shù)量和殺傷活性。抗體含量在10～20ng/ml即可達到刺激殺傷活性的高峰，體外培養(yǎng)數(shù)天后即可出現(xiàn)明顯的殺傷活性。CD3AK激活需要單核細胞存在，其增殖速度和細胞毒活性均高于LAK。所有的CD3+CD8+T細胞和1-6％CD3+CD4+T細胞可誘導出CD3AK。CD3AK已開始應用于臨床。細胞因子誘導的殺傷細胞cytokine-inducedkillercell,CIK1991年斯坦福大學醫(yī)學院骨髓移植中心首先報道了這種具有高增殖力和高細胞毒性的細胞因子激活的殺傷細胞；1994年Schmidt-wolf報道了體外大量增殖CIK細胞的方法。增殖后的CIK細胞主要為CD3+CD56+(50%以上)，在正常人外周血中極其罕見(1-5%)。絕大多數(shù)細胞共表達CD2、TCR/、CD5和CD8與LAK比較：不需NK細胞活化不需持續(xù)給以大量IL-2

增殖活性和細胞毒性更高由IFN-、CD3單抗、IL-1、IL-2等細胞因子在體外誘導并大量擴增的具有殺傷腫瘤活性的細胞，是目前國際上廣泛應用的腫瘤免疫治療手段。特點：1）高增殖活性加入細胞因子后迅速增殖，在培養(yǎng)第22天增殖曲線達頂峰；

CD3+CD56+細胞增加1000-6000倍；

28-30天達平臺期，細胞毒活性亦達峰值；2）高細胞毒力

CIK細胞對腫瘤細胞的抑制指數(shù)為1.5-3.5，LAK細胞為0.5-1.5；3）殺瘤作用譜廣泛，非MHC限制性4）細胞來源豐富正?；蚧颊撸–ML、MM、ALL、AML、淋巴瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌）的骨髓單個核細胞或外周學單個核細胞、干細胞均可誘導獲得CIK細胞；5）對多耐藥性腫瘤細胞同樣敏感阿霉素、常春藤新堿等6）不受免疫抑制劑CSA、FK506影響7）抵抗腫瘤細胞誘發(fā)的效應細胞Fas-FasL凋亡細胞內(nèi)表達抗凋亡基因和保護基因8）對正常骨髓前體細胞毒性很小CIK細胞不僅對白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)腫瘤治療有效，對腎癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌等細胞系均有極強的殺傷活性（60～90％）。將CIK細胞與樹突狀細胞和腫瘤細胞系抗原聯(lián)合應用，能夠進一步提高對腫瘤的殺傷活性。最適合放、化療后、手術(shù)后或骨髓移植后的患者。毒副作用：輕度發(fā)熱、畏寒、疲乏等，較輕且可自行緩解分2-3次靜脈回輸體內(nèi)采集病人外周血單個核細胞加入多種細胞因子培養(yǎng)擴增、活化、誘導成為CIK細胞發(fā)揮抗腫瘤作用到達病變部位直接清除殘存腫瘤細胞調(diào)節(jié)和增強全身免疫機能防止腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移CIK的臨床應用經(jīng)IL-2基因轉(zhuǎn)染的CIK治療肺、肝、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腎癌(1)、直腸癌(7)、淋巴瘤(2)的I期臨床試驗結(jié)果：10例經(jīng)CIK治療后，患者血清-IFN、GM-CSF和TGF-水平均升高，外周血CD3+T細胞均顯著增加，外周血淋巴細胞殺傷活力均升高。1例完全緩解，3例病情得到穩(wěn)定。國內(nèi)對87例急性白血病患者進行了CIK細胞治療，其中84例血液學緩解期接受CIK治療的持續(xù)完全緩解(CCR)率為75%，中位CCR期為26月；2例（2/3）脾臟腫大明顯縮小，均CCR至今（12及16月）。CIK后持續(xù)完全緩解（CCR）概率CIK治療后不同型患者的CCR概率（CR期）CIK治療后CR期患者追蹤CIK治療后骨髓殘留異常染色體和/或白血病標志消失

IgH/TCRδ14/14轉(zhuǎn)陰t(15;17)和/或PML/RARa3/3轉(zhuǎn)陰t(8;21)和/或AML1/ETO2/2轉(zhuǎn)陰有微小殘留白血病的ALL兒童在?；熀笥肅IK的療效化療12月后仍殘留IgH和/或TCRδ（+）者，自愿選擇CIK或單純化療CIK組：14/14IgH和/或TCRδ轉(zhuǎn)陰

中位隨訪18月，均CCR

單純化療：6/14IgH和/或TCRδ轉(zhuǎn)陰

8/14復發(fā)國內(nèi)1999-2001年對256例各種中晚期腫瘤患者（包括乳腺癌、肺癌、腸癌、胃癌、淋巴瘤等）進行了1-4療程CIK治療治療后部分緩解和輕度緩解為207例（80.86%）

隨訪1年生存期為96.06%

2年生存期為92.96%

3年生存期為88.38%

生存質(zhì)量卡氏評分提高率為88.28%經(jīng)治療后對心、肝、腎功能均未引起不良反應，僅數(shù)例有一過性發(fā)熱，24小時即正常。國內(nèi)對13例原發(fā)性肝癌進行CIK治療，肝癌患者血清平均病毒載量由治療前1.85×106HBVDNA拷貝/ml降低為治療后1個月8.75×105，2個月1.44×105，3個月1.41

×105非特異性特異性如何建立高效的、穩(wěn)定的、記憶的、特異的過繼性細胞免疫治療？TCRengineeringoflymphocytes

foruseinACT治療方法原理優(yōu)點缺點已開展的臨床試驗TIL提取患者的手術(shù)標本或者轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中抗腫瘤活性強的，親和能力好的T淋巴細胞，體外增殖和活化后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)1.

高效、特異、副作用小；2.

TIL抗腫瘤效果明顯；1.

并不適合所有腫瘤患者，如喪失手術(shù)機會或無法取到腫瘤標本；2.

在體內(nèi)的有效T細胞數(shù)量少，活力較低；3.

T細胞體內(nèi)存活時間不夠長。1.

轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤，1988；2.

轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤，2009，Rosenberg。TCRT比較常用的是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)構(gòu)建腫瘤抗原特異性TCR，通過病毒載體等方法將其轉(zhuǎn)入T淋巴細胞，大量擴增后回輸患者。

特異性更高，副作用更??；

腫瘤適用范圍更廣；

體內(nèi)存活時間更長；

體內(nèi)細胞數(shù)量更多。MHC限制性；內(nèi)外源性α和β鏈的錯配；安全性相對較差;TIL來源有限HLA-A2陽性的轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤(MART-1)，2006，Morgan；黑色素瘤患者和滑膜瘤(NY-ESO-1)，2011,

JCO；2015,ClinCancerRes治療方法原理優(yōu)點缺點已開展的臨床試驗TCRT比較常用的是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)構(gòu)建腫瘤抗原特異性TCR，通過病毒載體等方法將其轉(zhuǎn)入T淋巴細胞，大量擴增后回輸患者。

特異性更高，副作用更??；

腫瘤適用范圍更廣；

體內(nèi)存活時間更長；

體內(nèi)細胞數(shù)量更多。MHC限制性；內(nèi)外源性α和β鏈的錯配；安全性相對較差;TIL來源有限HLA-A2陽性的轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤(MART-1),2006,Morgan；黑色素瘤患者和滑膜瘤(NY-ESO-1)，2011,JCO;2015,ClinCancerResCART將識別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體(通常是scFv)和T細胞的活化基序(ITAM,常為CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ)相結(jié)合，通過基因轉(zhuǎn)導賦予T細胞腫瘤靶向性、更強的殺傷活性和持久的生命力。特異性高；腫瘤抗原類型多,腫瘤適用范圍廣；非MHC限制性；體內(nèi)存活時間長。毒副作用較大，如脫靶效應、細胞因子風暴等；T細胞在體內(nèi)的活性無法檢測。1.霍奇金淋巴瘤(CD20-CART)，2008，Till；2.慢性淋巴細胞白血病(CD19-CART)，2011，June；3.難治性B細胞淋巴瘤，2012，Rosenberg。將CAR克隆入病毒載體患者表達CAR的人T細胞-CART體外擴增ChimericAntigenReceptorTcell(CAR-T)跨膜區(qū)Transmambranedomain抗原結(jié)合區(qū)Epitopebindingsite鉸鏈區(qū)Hinge胞內(nèi)信號區(qū)(第1、2、3、4代)Signalingdomain單克隆抗體MAbTCRFirst-Generation(prototype)CARTheintroductionofCARsrecognizingtumorantigensthroughsingle-chainvariablefragments(scFvs)isolatedfromantigen-specificmonoclonalantibodies(mAbs)linkedtointracellularsignalingdomainsscFvstructure50Second-andThird-GenerationCARNewerGenerationCARsConstructs

(Thefourth-generationCAR)TRUCKs:TcellsRedirectedforUniversalCytokineKilling?CARredirectedTcellswhichconstitutivelyproduceatransgenicprotein(‘payload’)andreleasetheproteinuponCARengagementoftarget.?anuclearfactoroftheactivatedTcell(NFAT)-responsiveexpressioncassettefortheinducibleexpressionofatransgeniccytokine,forexample,IL-12.

?TRUCKcellswithinduciblereleaseofIL-12attractandactivateinnateimmunecellstothetargetedtumorlesionwhichinturneliminatecancercellsnotrecognizedbyCARTcells.用于嵌合型抗原受體改造的靶點CAR-T研究進展——雙特異性抗體ImmunolRev.2014.257:107-26.CAR-T細胞治療惡性血液病臨床研究靶標腫瘤載體CAR信號域研究進度（期）研制機構(gòu)CD19兒童B細胞白血病和淋巴瘤慢病毒4-1BB-CD3I賓夕法尼亞大學CD19CD19+腫瘤慢病毒4-1BB-CD3I賓夕法尼亞大學CD19急性淋巴細胞白血病慢病毒4-1BB-CD3I賓夕法尼亞大學CD19慢性淋巴細胞白血病慢病毒4-1BB-CD3II賓夕法尼亞大學CD19慢性淋巴細胞白血病慢病毒CD28-CD3,4-1BB-CD3I賓夕法尼亞大學CD19復發(fā)或新診斷的急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒CD28-CD3I斯隆-凱特琳癌癥紀念醫(yī)院CD19兒童復發(fā)性B細胞白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒CD28-CD3I斯隆-凱特琳癌癥紀念醫(yī)院CD19非霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒CD28-4-1BB-CD3/CD28-CD3I貝勒醫(yī)學院CD19急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病，非霍奇金淋巴瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒CD28-CD3I貝勒醫(yī)學院CD19慢性淋巴細胞白血病和淋巴瘤轉(zhuǎn)座子CD28-CD3I安德森腫瘤中心CD19B細胞白血病轉(zhuǎn)座子CD28-CD3I安德森腫瘤中心CD19兒童白血病和淋巴瘤，慢性淋巴細胞、小淋巴細胞性淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，大細胞性淋巴瘤、B-細胞白血病

逆轉(zhuǎn)錄病毒CD28-CD3I國立癌癥研究院CAR-T的挑戰(zhàn)與風險不良反應可能原因應對措施細胞因子風暴與CAR結(jié)構(gòu)、腫瘤負荷及類型、患者基因多態(tài)性等相關(guān)1、設計安全的CARs；2、劑量爬坡；3、自殺基因；4、調(diào)節(jié)CAR親和性腫瘤溶解綜合征輸注CAR-T細胞的體內(nèi)增殖以及體內(nèi)細胞因子釋放有關(guān)1、劑量爬坡2、嚴密監(jiān)控脫靶效應TAA特異性不高尋找腫瘤特異性抗原插入突變插入外源基因優(yōu)化載體類型和轉(zhuǎn)染方式挑戰(zhàn)：尋找新靶標、研發(fā)新技術(shù)樹突狀細胞與腫瘤免疫治療

加工處理和提呈抗原的過程抗原可分為內(nèi)源性抗原(病毒、細胞內(nèi)感染細菌、腫瘤抗原)與外源性抗原(絕大多數(shù)細菌或其它病原、異物)?？乖岢?/p>

+融合裂解酸提合成提取mRNA抗原肽抗原肽裂解物vectorcDNA轉(zhuǎn)染腫瘤細胞樹突狀細胞的抗原致敏抗原提呈

腫瘤細胞DC

惡性黑色素瘤、前列腺癌、惡性淋巴瘤、白血病、其他實體瘤（結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝胰管壺腹癌、胃癌、食管癌、轉(zhuǎn)移性腎癌、兒童青少年好發(fā)的間葉組織來源的肉瘤）的免疫治療。樹突狀細胞瘤苗的臨床應用研究機構(gòu)產(chǎn)品名稱描述腫瘤類型研究狀態(tài)NeoStem,Inc.(美國)DC-TC采用輻照后凋亡的腫瘤細胞激活自體DC轉(zhuǎn)移性黑色素瘤Ⅲ期(NCT01875653)UniversityHospitalErlangen(德國)DC自體DC負載自體腫瘤mRNA黑色素瘤Ⅲ期(NCT00045968)NorthwestBiotherapeutics(美國)DCVax(R)-L腫瘤細胞裂解物激活自體DC多發(fā)性骨髓瘤Ⅲ期(NCT01983748)ArgosTherapeutics(美國)AGS-003腫瘤抗原多肽激活自體DC腎細胞癌Ⅲ期(NCT01582672)NCCR(美國)DC腫瘤激活自體DC非霍奇金淋巴瘤完成Ⅲ期(NCT00006434)CreaGene(韓國)CreaVaxRCC自體單核細胞在GM-CSF和IL-4作用下誘導成未成熟DC，采用腫瘤提取物刺激活化轉(zhuǎn)移性腎細胞癌韓國獲批上市GenoaBiotechnolo