胚胎及卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)

關(guān)于胚胎及卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)第1頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五概述概念胚胎及卵母細(xì)胞冷凍保存是采取特殊的保護(hù)措施和降溫程序，使胚胎或卵母細(xì)胞在-196℃的條件下停止代謝，而升溫后又不失去代謝恢復(fù)能力的一種長期保存胚胎和卵母細(xì)胞的技術(shù)。意義是保護(hù)品種資源和拯救瀕危動(dòng)物不可缺少的技術(shù)保障之一。是加快家畜品種改良和胚胎移植技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要組成部分，可代替活畜進(jìn)口，不受時(shí)間和空間的限制。第2頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五歷史回顧冷凍原理冷凍方法卵母細(xì)胞冷凍保存胚胎冷凍保存解凍方法冷凍效果鑒定影響冷凍效果的因素存在問題及展望第3頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五歷史回顧1972年，Whittingham等首次用慢速冷凍法成功保存小鼠胚胎。1977年，Whittingham再次報(bào)道了冷凍、解凍小鼠卵母細(xì)胞得到活仔。1977年Willadsen進(jìn)行了改良，建立了快速冷凍法。1985年Rail和Fahy建立了玻璃化冷凍法。目前，胚胎及卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)研究集中于尋求效果更佳的保護(hù)劑和簡(jiǎn)化冷凍和解凍程序方面。第4頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五冷凍原理低溫冷凍保存的細(xì)胞能長期保存而不喪失活性，其原因是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)一切新陳代謝過程中的化學(xué)反應(yīng)被低溫所抑制，細(xì)胞內(nèi)所有化學(xué)變化處于一種“暫?！睜顟B(tài)而使細(xì)胞得以長期保存。低溫保存的細(xì)胞以一定方式復(fù)蘇后，又具有存活能力。細(xì)胞的冷凍保存并不在于能否長期耐受低溫，而是在于冷凍和解凍時(shí)對(duì)細(xì)胞的致死性作用（致死性溫區(qū)-50~-15℃）第5頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五一、胚胎和卵母細(xì)胞在低溫冷凍保存過程中的受損機(jī)制在冷凍過程中，冰晶首先在細(xì)胞外液中形成，此時(shí)冰晶與溶質(zhì)分離，使細(xì)胞外液濃度升高、滲透壓增加，細(xì)胞內(nèi)水分滲出產(chǎn)生溶液效應(yīng)。隨著溫度繼續(xù)下降，細(xì)胞外冰晶不斷形成，未凍結(jié)部分的溶液濃度增加，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差增大。這時(shí)可能發(fā)生兩種情況：

（1）當(dāng)降溫速度很慢時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)更多的水分有足夠的時(shí)間滲出，水分在細(xì)胞外凍結(jié)，隨著細(xì)胞外冰晶的形成，細(xì)胞內(nèi)外形成了較高的滲透壓差，使細(xì)胞內(nèi)水分逐漸減少，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，導(dǎo)致細(xì)胞膜蛋白復(fù)合體的破壞和膜的分解。（2）當(dāng)降溫速度很快時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)水分形成的冰晶使細(xì)胞受到物理性的損傷。這個(gè)因素影響是胚胎及卵母細(xì)胞冷凍保存的關(guān)鍵。第6頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五在-5~-15℃細(xì)胞內(nèi)液處于超冷凍狀態(tài)時(shí)，如果細(xì)胞尚未充分脫水，一旦結(jié)冰，冰晶就會(huì)迅速聚集，釋放潛熱引起溫度瞬間劇增，造成過冷損傷。冷凍的卵母細(xì)胞或胚胎解凍后可見到透明帶破裂，這主要是由于物質(zhì)的膨脹率和收縮率不同，這種現(xiàn)象被稱作破裂損傷。卵母細(xì)胞或胚胎在冷凍液中平衡或脫出冷凍保護(hù)劑時(shí)，由于滲透壓的急劇變化而引起細(xì)胞過度膨脹或收縮使細(xì)胞受到損傷。冷凍還能損傷細(xì)胞整體，阻礙極體產(chǎn)生，增加DNA的不穩(wěn)定性而導(dǎo)致染色體異常。第7頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五二、保護(hù)措施誘發(fā)結(jié)晶

溶液在溫度達(dá)到冰點(diǎn)時(shí)不結(jié)冰，待降到冰點(diǎn)以下一定溫時(shí)才結(jié)晶，這種現(xiàn)象叫過冷現(xiàn)象，易對(duì)卵母細(xì)胞造成損傷。為了防止過冷現(xiàn)象的發(fā)生，通常在-7℃左右時(shí)通過人工強(qiáng)制誘發(fā)結(jié)晶，以避免較大冰晶的形成和劇烈的溫度變化。誘發(fā)結(jié)晶主要在降溫速率較慢的冷凍方法中使用。誘發(fā)方法有兩種：①用液氮預(yù)冷過的鑷子夾麥管中部含卵母細(xì)胞的冷凍液上部；②在冷凍液中加入制冷劑晶母等。第8頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五使用冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑作用原理：當(dāng)冷凍保護(hù)劑滲入到細(xì)胞內(nèi)后，能增加整個(gè)細(xì)胞的粘度和細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，使冰晶生長的驅(qū)動(dòng)力減弱，減少冰晶的形成。在濃度增加到一定程度后，整個(gè)保存系統(tǒng)可以在相對(duì)較慢的冷卻速率下形成玻璃化，避免“胞內(nèi)冰晶損傷”。此外，保護(hù)劑可改變細(xì)胞膜通透性，降低細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差，避免“溶質(zhì)性損傷”。滲透性保護(hù)劑滲透性保護(hù)劑是一類小分子化合物，因其在冷凍過程中能夠滲透進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)而得名，常用的有甘油（GL）、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。該類物質(zhì)在冷凍過程中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可以起到以下作用：①防止細(xì)胞因脫水過度收縮；②與水分子發(fā)生水合作用，減慢溶液結(jié)晶速度；③稀釋胞質(zhì)中因脫水而產(chǎn)生的高鹽，減少鹽害作用的產(chǎn)生。第9頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五非滲透性保護(hù)劑這是一類大分子化合物，能溶于水，但不能滲入細(xì)胞，較為常用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。在快速冷凍時(shí)，可協(xié)助滲透性保護(hù)劑促使細(xì)胞脫水，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成；組成玻璃化液時(shí)，可有效降低滲透性保護(hù)劑的分子濃度、可使發(fā)生玻璃化的相變溫度升高、可促進(jìn)胞質(zhì)及保護(hù)液玻璃化；解凍時(shí)，為卵母細(xì)胞和胚胎提供一個(gè)高滲環(huán)境，避免水分進(jìn)入胞內(nèi)過快而產(chǎn)生的滲透性破裂。其他保護(hù)劑

主要是指最近所發(fā)現(xiàn)的一些新型冷凍保護(hù)劑，如抗凍蛋白（AFP）。第10頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五玻璃化的保護(hù)作用

玻璃化是高濃度的冷凍保護(hù)液在低溫或超低溫下溶液由液相變?yōu)楣滔鄷r(shí)，其內(nèi)部的分子、離子分布不改變其原有的分布，不形成有規(guī)則外表的物質(zhì)形態(tài)，可有效避免冰晶形成時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)部骨架結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞器膜的牽拉斷裂和尖銳刺傷。第11頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五冷凍方法一、卵母細(xì)胞的冷凍保存卵母細(xì)胞的獲得活體卵巢采卵屠宰動(dòng)物卵巢采卵1.抽吸法2.切割法3.剝離法刀片切割卵巢可采取卵巢內(nèi)部卵泡第12頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五卵母細(xì)胞的分級(jí)與篩選牛的卵母細(xì)胞可分為以下幾個(gè)等級(jí)：A級(jí)：外周有3層以上致密卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻并充滿于透明帶內(nèi)。B級(jí)：外周有1~3層卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻。C級(jí)：卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，卵母細(xì)胞胞質(zhì)不均勻。D級(jí)：無卵丘細(xì)胞的裸卵，細(xì)胞質(zhì)不均勻，且有暗斑。應(yīng)篩選A、B級(jí)卵母細(xì)胞，用于成熟培養(yǎng)和冷凍。第13頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五卵母細(xì)胞冷凍方法卵母細(xì)胞的冷凍方法有慢速冷凍法、快速冷凍法、一步冷凍法、超快速冷凍法和玻璃化冷凍法5種。慢速冷凍法此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎冷凍研究中常用的方法。該法將胚胎置于冷凍保護(hù)液中以0.2~0.8℃/min的速率緩慢降至-80℃，然后投入液氮保存。利用這一方法先后對(duì)多種家畜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胚胎進(jìn)行冷凍試驗(yàn)并取得成功，但由于其冷凍過程花費(fèi)的時(shí)間比較長（6h以上），而且需要特殊的冷凍降溫設(shè)備，因此目前已經(jīng)很少采用。

第14頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五超快速冷凍法超快速冷凍法是把卵母細(xì)胞用適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑混合液進(jìn)行短暫處理后，直接投入液氮中，在冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)外都形成結(jié)晶。玻璃化冷凍法玻璃化冷凍法是超快速降低細(xì)胞溫度的一種冷凍模式，主要依靠溶液的玻璃化特性，將卵母細(xì)胞用玻璃化溶液處理后，直接投入液氮保存。因?yàn)槔鋬鲆涸谝旱行纬傻氖且环N非晶體物質(zhì)狀態(tài)，因而避免了慢速冷凍過程中細(xì)胞所遭受的機(jī)械損傷，同時(shí)縮短了冷凍處理所需的時(shí)間，簡(jiǎn)化了步驟，也不需要昂貴的程序降溫儀，逐漸成為胚胎和卵母細(xì)胞冷凍的趨勢(shì)。玻璃化液的組成較為復(fù)雜，包括丙二醇、二甲基亞砜、乙酰胺、聚乙二醇等。第15頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五二、胚胎冷凍保護(hù)劑的選擇和配制不同動(dòng)物的胚胎冷凍所用的保護(hù)劑種類和濃度各不相同。牛用1.0~1.5mol/LDMSO、1.0mol/L的甘油或1.5mol/L的乙二醇、丙二醇效果均好。一步冷凍時(shí)常采用兩種保護(hù)劑組成的高濃度玻璃化液。奶山羊胚胎冷凍一般選用1~1.4mol/L（7.3％~10％）甘油。綿羊用1.5mol/L甘油、DMSO、乙二醇或丙二醇。馬5~7日齡的胚胎一般采用1.0~1.3mol/L的甘油作為保護(hù)劑。第16頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五圖為世界首例冷凍胚胎克隆水?！芭闻巍保ㄗ螅┡c“代孕媽媽”在一起第17頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五胚胎的凍前處理保護(hù)劑的加入大都采用一步法加入保護(hù)劑。胚胎移入保護(hù)液時(shí)溫度應(yīng)為18~20℃，平衡時(shí)間為15~25min。裝管胚胎冷凍一般采用0.25ml精液冷凍細(xì)管。將細(xì)管有棉塞的一端插入裝管器。按保護(hù)液（Ⅰ段）→氣泡→胚胎和保護(hù)液（Ⅱ段）→氣泡→保護(hù)液（Ⅲ段）順序裝管。在實(shí)體顯微鏡下檢驗(yàn)胚胎是否裝入管內(nèi)。封管。第18頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五冷凍過程快速冷凍法由室溫開始以1℃/min的速度降至-5~-7℃誘發(fā)結(jié)晶，在此溫度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至-30℃~40℃，投入液氮保存。一步冷凍法牛和山羊目前仍處于試驗(yàn)階段牛7日齡囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中室溫下脫水2min，將裝有胚胎的細(xì)管垂直放在液氮罐頸部5min，結(jié)晶后投入液氮。山羊胚胎先在室溫下將胚胎移入低于最終濃度或?qū)⒆罱K濃度的保護(hù)液對(duì)倍稀釋的液體中平衡10min，再移入4℃預(yù)冷的最終濃度保護(hù)液中，裝入細(xì)管并在4℃下平衡10~15min，即可直接或在液氮蒸汽中停留1~2min后投入液氮。第19頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五被冷凍的人工胚胎第20頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五存放冷凍胚胎的液氮罐第21頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五解凍方法解凍快速解凍優(yōu)于慢速解凍

快速解凍法通常采用溫水浴法，以300～360℃/min的速率使胚胎在30～40s內(nèi)從-196℃迅速升至室溫。即將裝有胚胎的細(xì)管由液氮中取出，直接(或在空氣中停留5～10s)投入20～35℃的溫水中，輕輕擺動(dòng)，1min即可完成解凍過程。第22頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五脫出保護(hù)劑

目前多采用蔗糖液一步或兩步法脫除胚胎里的保護(hù)劑，使胚胎復(fù)水。

用PBSS配置成0.2~0.5mol/L的蔗糖液，胚胎解凍后，在室溫（25~26℃）下放入該液體中，保持5~10min，在顯微鏡下觀察，胚胎擴(kuò)張至接近凍前狀態(tài)即認(rèn)為保護(hù)劑已脫除，然后移入PBSS中準(zhǔn)備移植。一步冷凍的胚胎解凍時(shí)一般使用1.0mol/L和0.5mol/L蔗糖脫除兩次后再移入PBSS中的效果較好。冷凍卵母細(xì)胞，要先在25℃水浴中解凍，將細(xì)管內(nèi)含物一起排入一空培養(yǎng)皿中，5min后把卵母細(xì)胞移入0.25mol/L蔗糖液中，再經(jīng)5min移入PBS/FCS中，洗滌兩次，即完成解凍過程。第23頁，共26頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)59分，星期五冷凍效果鑒定胚胎冷凍效果鑒定冷凍胚胎解凍后要對(duì)其活力進(jìn)行鑒定，才能確定