westernblot原理及操作流程課件

2011-5-7WB實驗技術及常見問題分析2011-5-7WB實驗技術及常見問題分析1Westernblot定義

WesternBlot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡通過聚丙烯酰胺電泳根據(jù)分子量大小分離蛋白后轉(zhuǎn)移到雜交膜上分離的蛋白可以通過一抗/二抗復合物進行檢測是蛋白質(zhì)分析的最流行的技術之一Westernblot定義WesternBlo2WesternBlot操作流程蛋白樣品的制備（蛋白抽提、定量）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS凝膠制備、上樣）轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternBlot操作流程蛋白樣品的制備轉(zhuǎn)膜3水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。細胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0有機溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白樣品的制備水溶液提取法一、蛋白樣品的制備4二、蛋白樣品的定量(Bradford法)原理—考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。制作標準曲線（插入表格）檢測樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍+95l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5l待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測試。二、蛋白樣品的定量(Bradford法)原理—考馬斯亮藍G5

20-30ug

細胞/組織裂解物

100ng

純化蛋白根據(jù)蛋白表達豐度調(diào)整適當?shù)牡鞍咨蠘恿可蠘恿恳恢拢好靠咨蠘恿勘３忠恢律蠘忧坝胠oadingbuffer加熱變性樣本三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳20-30ug細胞/組織裂解物三、SDS-聚丙烯酰胺凝6Anode-內(nèi)槽緩沖液帶有負電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode+帶有負電荷的蛋白質(zhì)從上到下運動（負極到正極），分開電泳進程可以根據(jù)前沿指示劑來確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快.蛋白根據(jù)分子量大小分開蛋白質(zhì)帶有負電荷，因此電泳時可以從負極向正極移動標本加入到上樣孔中Anode-外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cath7westernblot原理及操作流程課件8四、WesternBlot轉(zhuǎn)膜

分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜方式從凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交膜上（PVDF或NC膜）PVDF膜：價格較貴，可重復使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強，但價格比較昂貴。NC膜（硝酸纖維素膜）：價格比較便宜，應用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。四、WesternBlot轉(zhuǎn)膜分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜9五、封閉脫脂奶粉（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）五、封閉脫脂奶粉（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）10六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液與濾膜溫育，室溫小時或4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。加入配制的二抗，搖床上緩慢搖動，室溫一小時或4℃過夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一11七、二抗與底物反應顯色ECL化學發(fā)光顯色

比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是靈敏度差一點DAB顯色

比較靈敏，是HRP最敏感的底物七、二抗與底物反應顯色ECL化學發(fā)光顯色12WesternBlot

需要的主要試劑WesternBlot需要的主要試劑13WB需要試劑－膜常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜WB需要試劑－膜常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜14WB需要試劑－封閉試劑BSA或者脫脂奶粉(光明脫脂奶粉)商業(yè)化的封閉試劑WB需要試劑－封閉試劑BSA或者脫脂奶粉(光明脫脂奶粉)15主要目的是確定靶蛋白的分子量大??；使用預染的Marker還可以實時檢測電泳分離情況，并可以轉(zhuǎn)移到膜上。WB需要試劑－蛋白質(zhì)MarkerPrestainedproteinladdersUnstainedproteinladdersFermentas主要目的是確定靶蛋白的分子量大小；使用預染的Marker還可16WB需要試劑－一抗選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體根據(jù)說明書推薦的濃度優(yōu)化最佳稀釋比例

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.選擇合適的一抗：WB需要試劑－一抗選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）17雜交需要試劑－二抗二抗選擇：根據(jù)一抗來源種屬以及抗體Ig亞型選擇合適的二抗。二抗的使用：根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋二抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時。

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.雜交需要試劑－二抗二抗選擇：根據(jù)一抗來源種屬以及抗體Ig亞型18雜交需要試劑－底物顯色底物：操作簡單，靈敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT化學發(fā)光底物：靈敏度高，需要曝光檢測設備（暗室、曝光設備和膠片）或者凝膠成像設備。雜交需要試劑－底物顯色底物：操作簡單，靈敏度低，如TMB、D19WB常見問題沒有信號高背景非特異性條帶條帶大小不對WB常見問題沒有信號20標本問題

標本中不含檢測蛋白：設置陽性對照上樣量不夠，或者蛋白表達豐度比較低：增加上樣量轉(zhuǎn)膜問題轉(zhuǎn)膜不完全：轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色，確定目的大小蛋白條帶是否存在于膜上，使用蛋白質(zhì)Marker.洗滌過度：減少洗滌時間和次數(shù).封閉封閉過度：減少封閉試劑濃度，封閉時間，更換封閉試劑抗體孵育和檢測抗體濃度和時間孵育不夠：增加抗體濃度，延長孵育時間一抗不工作：設置陽性對照二抗不工作：和其他一抗配合檢測二抗是否工作一抗/二抗不匹配：檢查抗體的來源和亞型。正確選擇二抗底物失活：重新配制有效的底物沒有信號/弱信號標本問題沒有信號/弱信號21背景高封閉封閉時間不夠：延長封閉時間優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度封閉試劑和抗體有交叉反應：更換封閉試劑.磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑：推薦BSA封閉抗體孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛忍撸航档涂贵w濃度孵育溫度太高：建議4度孵育過夜其他洗膜不充分：5*3mins，多次短時間的洗膜曝光時間過長：縮短曝光時間出現(xiàn)干膜現(xiàn)象：保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜二抗非特異性：設置只加二抗對照背景高封閉22非特異性條帶標本制備二聚體或者多聚體：增加上樣前煮沸變性時間蛋白不同剪切體或者isoforms存在.蛋白降解：使用新鮮制備的標本，標本中加入新鮮配制的蛋白酶抑制劑上樣量過大：減少上樣量封閉Blocking封閉不充分：優(yōu)化封閉時間和封閉試劑濃度抗體孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛冗^高：降低抗體濃度抗體沒有經(jīng)過純化二抗非特異性結(jié)合：使用二抗對照其他洗膜保證充分非特異性條帶標本制備23條帶大小不對標本制備二聚體/多聚體存在：使用還原變性電泳，除非說明書上有特殊說明多個亞型存在？（Isoforms）蛋白降解？蛋白修飾條帶大小不對標本制備24TheendTheend252011-5-7WB實驗技術及常見問題分析2011-5-7WB實驗技術及常見問題分析26Westernblot定義

WesternBlot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡通過聚丙烯酰胺電泳根據(jù)分子量大小分離蛋白后轉(zhuǎn)移到雜交膜上分離的蛋白可以通過一抗/二抗復合物進行檢測是蛋白質(zhì)分析的最流行的技術之一Westernblot定義WesternBlo27WesternBlot操作流程蛋白樣品的制備（蛋白抽提、定量）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS凝膠制備、上樣）轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternBlot操作流程蛋白樣品的制備轉(zhuǎn)膜28水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。細胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0有機溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白樣品的制備水溶液提取法一、蛋白樣品的制備29二、蛋白樣品的定量(Bradford法)原理—考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。制作標準曲線（插入表格）檢測樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍+95l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5l待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測試。二、蛋白樣品的定量(Bradford法)原理—考馬斯亮藍G30

20-30ug

細胞/組織裂解物

100ng

純化蛋白根據(jù)蛋白表達豐度調(diào)整適當?shù)牡鞍咨蠘恿可蠘恿恳恢拢好靠咨蠘恿勘３忠恢律蠘忧坝胠oadingbuffer加熱變性樣本三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳20-30ug細胞/組織裂解物三、SDS-聚丙烯酰胺凝31Anode-內(nèi)槽緩沖液帶有負電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode+帶有負電荷的蛋白質(zhì)從上到下運動（負極到正極），分開電泳進程可以根據(jù)前沿指示劑來確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快.蛋白根據(jù)分子量大小分開蛋白質(zhì)帶有負電荷，因此電泳時可以從負極向正極移動標本加入到上樣孔中Anode-外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cath32westernblot原理及操作流程課件33四、WesternBlot轉(zhuǎn)膜

分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜方式從凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交膜上（PVDF或NC膜）PVDF膜：價格較貴，可重復使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強，但價格比較昂貴。NC膜（硝酸纖維素膜）：價格比較便宜，應用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。四、WesternBlot轉(zhuǎn)膜分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜34五、封閉脫脂奶粉（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）五、封閉脫脂奶粉（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）35六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一抗溶液與濾膜溫育，室溫小時或4℃過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。加入配制的二抗，搖床上緩慢搖動，室溫一小時或4℃過夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗濾膜3次，每次10min。六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入一36七、二抗與底物反應顯色ECL化學發(fā)光顯色

比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是靈敏度差一點DAB顯色

比較靈敏，是HRP最敏感的底物七、二抗與底物反應顯色ECL化學發(fā)光顯色37WesternBlot

需要的主要試劑WesternBlot需要的主要試劑38WB需要試劑－膜常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜WB需要試劑－膜常用的有PVDF膜，硝酸纖維素膜或者尼龍膜39WB需要試劑－封閉試劑BSA或者脫脂奶粉(光明脫脂奶粉)商業(yè)化的封閉試劑WB需要試劑－封閉試劑BSA或者脫脂奶粉(光明脫脂奶粉)40主要目的是確定靶蛋白的分子量大小；使用預染的Marker還可以實時檢測電泳分離情況，并可以轉(zhuǎn)移到膜上。WB需要試劑－蛋白質(zhì)MarkerPrestainedproteinladdersUnstainedproteinladdersFermentas主要目的是確定靶蛋白的分子量大?。皇褂妙A染的Marker還可41WB需要試劑－一抗選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體根據(jù)說明書推薦的濃度優(yōu)化最佳稀釋比例

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.選擇合適的一抗：WB需要試劑－一抗選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）42雜交需要試劑－二抗二抗選擇：根據(jù)一抗來源種屬以及抗體Ig亞型選擇合適的二抗。二抗的使用：根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋二抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時。

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.雜交需要試劑－二抗二抗選擇：根據(jù)一抗來源種屬以及抗體Ig亞型43雜交需要試劑－底物顯色底物：操作簡單，靈敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT化學發(fā)光底物：靈敏度高，需要曝光檢測設備（暗室、曝光設備和膠片）或者凝膠成像設備。雜交需要試劑－底物顯色底物：操作簡單，靈敏度低，如TMB、D44WB常見問題沒有信號高背景非特異性條帶條帶大小不對WB常見問題沒有信號45標本問題

標本中不含檢測蛋白：設置陽性對照上樣量不夠，或者蛋白表達豐度比較低：增加上樣量轉(zhuǎn)膜問題轉(zhuǎn)膜不完