植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介及其應(yīng)用課件

植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介及其應(yīng)用主要內(nèi)容植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)基本操作植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介

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組織培養(yǎng)的概念

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植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下,將離體的植物器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等)、組織(如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細胞(如體細胞、生殖細胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質(zhì)體(如脫壁后仍具有生活力的原生質(zhì)體),培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上,給予適宜的培養(yǎng)條件,誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織,或潛伏芽等,或長成完整的植株,統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng)。由于是在試管內(nèi)培養(yǎng),而且培養(yǎng)的是脫離植株母體的培養(yǎng)物,因此也稱離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。?

根據(jù)外植體來源和培養(yǎng)對象的不同,又分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介?

(1)植株培養(yǎng)(plantculture)對完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株的培養(yǎng)。

?(2)器官培養(yǎng)(organculture)離體器官的培養(yǎng)，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養(yǎng)。

?(3)組織或愈傷組織培養(yǎng)(tissurecallusculture)對植物體的各部分組織進行培養(yǎng)或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。

?(4)細胞培養(yǎng)(cellculture)對由愈傷組織等進行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分散性的離體單細胞或花粉單細胞或很小的細胞團的培養(yǎng)。

?(5)原生質(zhì)體培養(yǎng)(proplastculture)用酶及物理方法除去細胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)簡介

?外植體（器官、組織、細胞）完整植物

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植物細胞全能性：植物的單個細胞所具有的產(chǎn)生完整植物個體的潛在能力。細胞的脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細胞全能性表現(xiàn)的基本過程。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用?在植物脫毒和快速繁殖上的應(yīng)用??在植物育種上的應(yīng)用

(1)單倍體育種

單倍體植株往往不能結(jié)實,在培養(yǎng)中用秋水仙素處理,可使染色體加倍,成為純合二倍體植株,這種培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應(yīng)用稱為單倍體育種。單倍體育種具有高速、高效率、基因型一次純合等優(yōu)點,因此,通過花藥或花粉培養(yǎng)的單倍體育種,已經(jīng)作為一種嶄新的育種手段,并已開始育成大面積種植的作物新品種。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

(2)胚胎培養(yǎng)在植物種間雜交或遠緣雜交中,雜交不孕給遠緣雜交帶來了許多困難。而采用胚的早期離體培養(yǎng)可以使胚正常發(fā)育并成功地培養(yǎng)出雜交后代。遠緣雜交中,可把未受精的胚珠分離出來,在試管內(nèi)用異種花粉在胚珠上萌發(fā)受精,產(chǎn)生的雜種胚在試管中發(fā)育成完整植株,此法稱為“試管受精”。用胚乳培養(yǎng)可以獲得三倍體植株,為誘導(dǎo)形成三倍體植物開辟了一條新途徑。三倍體加倍后可得到六倍體,可育成多倍體新品種。

組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

(3)細胞融合植物體細胞雜交在植物遠源雜交育種中,除了應(yīng)用離體胚培養(yǎng)或離體受精和授粉培養(yǎng)技術(shù)之外,還可采用植物體細胞雜交技術(shù)——原生質(zhì)體融合。由于不同來源的原生質(zhì)體都有彼此融合的能力,在遠源雜交中,通過細胞融合可獲得種間、屬間、科間、甚至界間的細胞融合體系，因此，細胞融合打破了種屬間的界限，克服遠緣雜交不親和性障礙，在植物新品種的培育和種性改良中有著巨大的潛力。目前，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)已經(jīng)能從不雜交的植物中如番茄和馬鈴薯、煙草和龍葵、芥菜和油菜等獲得屬間雜種。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

(4)基因工程基因轉(zhuǎn)化是有目的地將外源基因或DNA導(dǎo)入植物細胞內(nèi),使之整合、表達并遺傳，通過外源基因的導(dǎo)入，并植物體內(nèi)表達，有目的地改變植物性狀，以提高作物的抗逆性，改良作物品質(zhì)。植物組織培養(yǎng)是外源基因?qū)胫参锛毎年P(guān)鍵技術(shù)，通過組織培養(yǎng)技術(shù)可以建立一個良好的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，目前通常使用的再生系統(tǒng)有愈傷組織再生系統(tǒng)、直接分化再生系統(tǒng)、原生質(zhì)體再生系統(tǒng)、胚狀體再生系統(tǒng)和生殖細胞受體系統(tǒng)等。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

(5)培養(yǎng)細胞突變體無論是愈傷組織培養(yǎng)，還是細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條件和外界壓力(如射線、化學(xué)物質(zhì)等)的影響而產(chǎn)生誘變，從中可以篩選出對人們有用的突變體，從而育成新品種。目前，用這種方法已篩選出抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白、矮稈高產(chǎn)的突變體，有些已用于生產(chǎn)。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

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在提取植物次生產(chǎn)物生產(chǎn)上的應(yīng)用

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在人工種子和種質(zhì)保存方面的應(yīng)用

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在植物檢疫方面的作用植物組織培養(yǎng)基本操作?洗滌(略）?培養(yǎng)基配制?離體培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)基的配制

?培養(yǎng)基的種類和成分?

目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，如：MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、

WPM培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。?培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、有機物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。1、水大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水；

2、無機元素大量元素：有N，P，K，Ca，Mg，S等；微量元素：Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。Fe鹽：FeSO4·7H2O和Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。

培養(yǎng)基的配制3、有機化合物

(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用濃度在2％-3％，常用3％；

(2)維生素(vitamin)主要有VB1(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、VC(抗壞血酸)、有時還使用生物素、葉酸、VB2等。一般用量為0.1-1.0mg/L。

(3)肌醇又叫環(huán)己六醇。使用濃度一般為100mg/L。

(4)氨基酸是有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用甘氨酸。培養(yǎng)基的配制4．植物激素(hormone)

在培養(yǎng)基的各成分中植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì),對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。(1)生長素類(auxin)，如NAA、IAA、IBA、2,4-D等主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進細胞分裂、伸長生長；(2)細胞分裂素類(cytokinin)，如BA、TDZ、KT、ZT等多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時使用；(3)GA(赤霉素)用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)；(4)ABA（脫落酸）促進細胞成熟老化等。

培養(yǎng)基的配制

5.瓊脂(agar)

在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂溶解于90℃以上的熱水。瓊脂的用量在6-10g／L之間。培養(yǎng)基的配制?配制培養(yǎng)基的方法和步驟

1、MS培養(yǎng)基及激素母液的配制培養(yǎng)基配方中各種成分的用量從每升幾毫克到幾千毫克不等，為了配制培養(yǎng)基的方便，通常將培養(yǎng)基的不同成分先配制成高濃度的母液。無機鹽按大量元素、微量元素和Fe鹽3部分分別配制。一般將大量元素配制成20×母液，微量元素、Fe鹽和有機成分配制成200×母液。激素的使用濃度很低，一般分別配制成0.1～1mg/ml濃度的溶液。配好的母液貯存于2～4℃的冰箱中備用。

培養(yǎng)基的配制2、MS培養(yǎng)基的配制及分裝按照各種母液順序和規(guī)定量，用移液管或量筒取母液，放在燒杯或三角瓶中。稱取蔗糖（30g/L）、瓊脂（7.5g/L），倒入約占配制培養(yǎng)基總量1/2以上的蒸餾水中，然后邊攪拌邊加入各種母液混合，最后定容，用1mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)PH值至5.8～6.0。加熱混合均勻后，趁熱將配制好的培養(yǎng)基分裝入培養(yǎng)容器中，封口。

培養(yǎng)基的配制（以MS為例）：母液的配制和保存，稱量，溶解，定容，分裝，標(biāo)簽，滅菌保存。

母液種類成分規(guī)定用量擴大稱取量母液定容配1LMS培養(yǎng)基吸取量(ml)(mg/L)倍數(shù)(mg)體積(ml)

KNO31900

38000

NH4NO31650

33000

大量元素MgSO4.7H2O370207400100050

KH2PO4170

3400

CaCI.2H2O440

8800

微量元素MnSO4.4H2O22.3

4460

ZnSO47H2O8.6

1720

H3BO36.2200124010005KI0.83

166

Na2MoO4.2H2O0.25

50

CuSO4.5H2O0.025

5

CoCI2.6H2O0.025

5

鐵鹽Na2-EDTA37.3200746010005FeSO4.7H2O27.85560有機物煙酸0.5

100

甘氨酸2

400

VB0.12002010005VB0.5

100

肌醇100

20000

培養(yǎng)基的配制?配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意的問題

1、在配制培養(yǎng)基母液或者培養(yǎng)基時，各種成分要嚴格按照添加方式和添加順序加入，以免培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象。如：⑴、配制大量元素母液時，各種無機鹽單獨溶解后，必須按照硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣的次序混合定容，因為氯化鈣與磷酸二氫鉀、硫酸鎂極易形成磷酸三鈣、硫酸鈣之類不溶于水的沉淀。⑵、配制微量元素母液時，應(yīng)按硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、鉬酸鈉、碘化鉀和氯化鈷的順序混合定容。⑶、配制Fe鹽時，分別溶解FeSO4·7H2O和Na2EDTA·2H2O在適當(dāng)體積的蒸餾水中，適當(dāng)加熱并不停攪拌，待完全溶解后將二者混合在一起，調(diào)整pH至5.5，最后定容到所需體積。培養(yǎng)基的配制2、配制培養(yǎng)基母液時，應(yīng)當(dāng)按照培養(yǎng)基配方清單逐一添加成分，以免出現(xiàn)錯誤。此時如發(fā)生錯誤，將會導(dǎo)致以后用此母液配制的所有培養(yǎng)基都出現(xiàn)問題而不能及時發(fā)現(xiàn)。3、配好的鐵鹽應(yīng)裝入棕色瓶。鐵鹽和有機化合物應(yīng)放入冰箱保存。4、培養(yǎng)基的pH值會顯著影響培養(yǎng)物的生長狀態(tài)，因此要注意培養(yǎng)基在經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后pH會降低0.2～0.5個單位。5、新的玻璃器皿在第一次使用之前應(yīng)當(dāng)徹底清洗干凈。6、要添加的過濾滅菌成分，應(yīng)當(dāng)在經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基溫度降到凝固溫度之上的10℃左右時加入，添加后充分混勻，盡快分裝。7、滅菌后的培養(yǎng)基一般在2周內(nèi)使用，貯存時間過長會造成潛在的污染。培養(yǎng)基的配制

?滅菌

培養(yǎng)基配置好后，在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min。瓶裝的培養(yǎng)基在滅菌前分裝，而要用培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基在滅菌后分裝。?

注意：對于不能高壓滅菌的成分，如IAA、ZT、GA3、ABA、AgNO3、谷氨酰胺、抗生素等，需先過濾滅菌，待高壓滅菌的培養(yǎng)基冷至50℃左右時，再加入這些成分分裝。離體培養(yǎng)體系的建立——初代培養(yǎng)植物外植體都是帶菌的，在進行離體培養(yǎng)之前，必須先對外植體進行消毒滅菌處理，以獲得無菌植物材料。常用的方法是用消毒劑進行表面滅菌。消毒劑對植物細胞有殺傷作用，因此，要根據(jù)外植體對消毒劑的敏感性和其受污染程度來確定消毒劑種類、濃度及處理時間。常用的消毒劑有酒精、次氯酸鈉、過氧化氫、升汞、硝酸銀和溴水等。用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌。離體培養(yǎng)體系的建立——初代培養(yǎng)接種是嚴格的無菌操作。外植體經(jīng)過滅菌后，立即在無菌操作臺上進行無菌操作。接種過程應(yīng)盡可能快，以避免染菌。操作要謹慎，操作不當(dāng)極易引起污染。接種后的材料盡快放置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)。適宜的培養(yǎng)條件主要包括光照、溫度、培養(yǎng)基pH和培養(yǎng)環(huán)境的空氣流通程度等。初代培養(yǎng)

1、外植體的選擇（1）、外植體的部位在組織培養(yǎng)中，如何選擇合適的，最能表達全能性的部位，是決定組織培養(yǎng)體系成功建立的前提之一。（2）、取材季節(jié)取材季節(jié)也是重要因素之一，對大多數(shù)植物，應(yīng)在其生長開始的季節(jié)。（3）、器官的生理特點和發(fā)育幼年組織比老年組織具有較高的行態(tài)發(fā)生能力。（4）、外植體的大小莖段長0.5cm，葉片面積5mm2。

初代培養(yǎng)

2、外植體的消毒外植體的消毒步驟

首先，把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，洗時可加入洗衣粉清洗；第二步要在超凈臺用70％酒精消毒10-30s；第三步是用殺菌劑0.1%升汞處理5-20min；第四步用無菌水涮洗4-6次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。

初代培養(yǎng)

3、無菌操作

⑴超凈工作臺滅菌開始無菌操作前半小時，打開超凈工作臺上的紫外燈，照射20分鐘后，關(guān)閉紫外燈，使超凈工作臺正常送風(fēng)，10分鐘左右后，即可開始無菌操作。⑵雙手及接種器械滅菌進行無菌操作前，先用肥皂洗滌雙手，穿好工作服。用70％～75％的酒精擦拭臺面并消毒雙手。所有接種器械用75％酒精浸泡，在酒精燈上灼燒滅菌。⑶接種切去材料兩端各0.5cm左右長度莖段，將莖段接種到初代培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)容器上標(biāo)明培養(yǎng)基代號和接種日期。

4、初代培養(yǎng)接種完成后，盡快將接種材料置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。并定期進行觀察記錄。初代培養(yǎng)

5、污染的原因及對策

污染：組培過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌導(dǎo)致培養(yǎng)失敗現(xiàn)象。（1）污染的原因

外植體帶菌，培養(yǎng)基滅菌不徹底，操作員不遵守操作規(guī)程等。細菌污染在接種后1-2天可發(fā)現(xiàn)，菌斑呈粘液狀。真菌污染在接種3天后可發(fā)現(xiàn)，污染部分長有不同顏色的霉菌。

（2）污染的預(yù)防措施將取的枝條用水沖干凈后插入自來水中使其抽枝，用新抽的枝作外植體。晴天中午到下午采樣操作人員嚴格遵守操作規(guī)程接種培養(yǎng)基及其用具滅菌要徹底組織培養(yǎng)時的注意事項

1、表面消毒劑對植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。

2、消毒劑最好在使用前臨時配制，氯化汞可在短時間內(nèi)貯用。

3、滅菌后的材料應(yīng)立即接種，以免造成二次污染。

組織培養(yǎng)時的注意事項

4、紫外線對人體有危害，在工作臺滅菌時，不能將皮膚暴露于紫外燈下，不可直接用眼睛看紫外光。超凈工作臺上的紫外燈關(guān)閉后不要立即走近工作臺，以免臭氧傷害呼吸道和眼睛。

5、無菌操作時注意手臂切勿從培養(yǎng)基、無菌材料或接種工具上方經(jīng)過，以免引起污染。離體培養(yǎng)體系的建立——繼代與生根培養(yǎng)

1、無菌苗繼代培養(yǎng)

2、生根培養(yǎng)當(dāng)無菌苗植株健壯，高度達到2-3cm時，即可進行生根培養(yǎng)。配制生根培養(yǎng)基在1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基中，添加濃度比例較高的生長素和細胞分裂素。繼代與生根培養(yǎng)注意事項：1、進行繼代時，如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物的底部長出愈傷組織，應(yīng)將其切去。2、無菌苗用于生根培養(yǎng)前，應(yīng)適當(dāng)進行壯苗，否則無菌苗