關(guān)于HPLC色譜中檢測限和定量限中信噪比SN的一些思考

9/9關(guān)于HPLC色譜中檢測限和定量限中信噪比S/N的一些思考

檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中規(guī)定這2項(xiàng)是重要的驗(yàn)證指標(biāo)，包括定量、限度的雜質(zhì)測定需要著重考慮檢測限和定量限，且在該版本指導(dǎo)原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規(guī)定。本文試圖從定義、測量方法、常見問題和解決方案進(jìn)行簡單的討論，為分析方法驗(yàn)證活動中檢測限和定量限的的開展提供一定的參考。

1、檢測限和定量限的定義

檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量，定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量。檢測限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。而對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時，應(yīng)確定方法的定量限，需要注意的是定量限的測定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。

2、一般規(guī)定及要求

檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。藥品的鑒別試驗(yàn)和雜質(zhì)檢査方法，均應(yīng)通過測試確定方法的檢測限。檢測限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。常用的方法如下。

直觀法

用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

信噪比法

用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把巳知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測出的被測物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時相應(yīng)濃度或注人儀器的量確定檢測限。

基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

按照LOD=3.3δ/S公式計(jì)算。式中LOD:檢測限；

δ：響應(yīng)值的偏差；S:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

δ可以通過下列方法測得：①測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

②標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來代替。

數(shù)據(jù)要求

上述計(jì)算方法獲得的檢測限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測定圖譜，說明試驗(yàn)過程和檢測限結(jié)果。

3、信噪比法具體怎么操作

信噪比的規(guī)定1：一種使空白樣與供試品，以空白樣目標(biāo)峰位置的信號為噪音（ASTM，此噪音為歐盟和美國認(rèn)可的噪音參數(shù)）（注意agilent此時應(yīng)該選擇的噪聲時間至少大于1min，waters建議為半峰寬的20倍），以供試品目標(biāo)峰的峰高為信號。以此手工計(jì)算信噪比。這種方法是最符合藥典要求，限制條件更高，更科學(xué)。

信噪比的規(guī)定2：另一種是只用供試品，以供試品除目標(biāo)峰之外選取基線平滑段為噪音，此法可直接讀出信噪比（性能報告+噪音），但該法對選擇的平滑段存在很大的隨意性，如位置和時間長短（國內(nèi)有些公司規(guī)定為0.2min）。此法雖然方便快速，而且基本能成功，但其實(shí)很大程度上存在數(shù)據(jù)拼湊的嫌疑。

另關(guān)于噪音的選擇時間USP為>=5倍半峰寬，EP、JP為>=20倍半峰寬。

檢測限：針對數(shù)據(jù)的要求問題，除了上述藥典要求外。檢測限應(yīng)該對比的是同一個樣品6針的平均信噪比（不得小于3）和保留時間（應(yīng)不大于2.0%）（即藥典雖然沒有要求定量要求（準(zhǔn)確度和精密度）），但應(yīng)保證精密度）

定量限：雜質(zhì)峰與噪音峰信號的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液雜質(zhì)峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于5.0%。3倍信噪比是檢出限，10倍信噪比是定量限，除此之外，檢出限表示方法能測出該物質(zhì)時的最低濃度。定量限則表示方法能準(zhǔn)確定量出該物質(zhì)的最低濃度。

具體來講：

檢測限：分析方法在規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件下所能檢出被測組分的最低濃度或最低量；定量限：分析方法可定量測定樣品中待測組分的最低濃度或最低量。

檢出限和定量限的區(qū)別在于：

檢測限：

檢測限指試樣在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。它是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，無需定量測定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。

非儀器分析目視法：

用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

信噪比法：

用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），將已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，算出能被可靠檢測出的zui低濃度或量。一般以信噪比3∶1或2∶1時的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限也可采用標(biāo)準(zhǔn)差法：空白值＝0時；

①定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差σ。②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對應(yīng)的濃度X，即為方法的檢出值；空白值不等于0；

定量限：

指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求。

常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定方法的實(shí)際測定下限。

4、檢測限和定量限的解決方案

因?yàn)闄z測限和定量限常用測量方法的局限性，因此我們并不需要限定信噪比=3或10，而只需要驗(yàn)證方法的靈敏度符合要求。如通常檢測限應(yīng)低于限度的1/30，定量限應(yīng)低于限度的1/10，但當(dāng)達(dá)不到該要求時，只要規(guī)定定量限比ICH規(guī)定的雜質(zhì)報告限低即可（如50%報告限）。

在檢測限的驗(yàn)證中，可以通過加標(biāo)的方法進(jìn)行信噪比的確認(rèn)，并可參考USP對于可檢測性的定義和確認(rèn)步驟：

-1：配置一個在限度濃度的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

-2：配置一個添加了限度濃度的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的樣品標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

-3：配置一個添加了（限度濃度100%-由Horwitz方程估算%RSD）的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的樣品標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

如果1≤2且3＜2，則差異可以被檢出；否則該方法不能勝任限度檢測。

定量限可考慮設(shè)置一個低于限度數(shù)倍的低濃度樣品（如5倍），在響應(yīng)最差的儀器中信噪比仍然遠(yuǎn)大于10（如100），其回收率驗(yàn)證與精密度驗(yàn)證均符合規(guī)定，則可以認(rèn)為該數(shù)字可以適用于今后的日常檢測，如果檢測結(jié)果小于該值，則直接報告“小于該值”即可[3]。如在采用熒光染色法測定外源性DNA殘留量中，ChP規(guī)定DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內(nèi)，本法線性較好，因此供試品DNA殘留量在該范圍內(nèi)可定量測定；當(dāng)DNA殘留量低于1.25ng/ml時應(yīng)為限量測定，表示為小于1.25ng/ml。

設(shè)計(jì)合理的定量下限對于方法的靈敏度有著很好的保證，在實(shí)際操作中只需要驗(yàn)證定量下限的準(zhǔn)確度和精密度符合要求即可。如在復(fù)雜基質(zhì)樣品中，通常以標(biāo)曲下限作為定量下限，且定量下限的準(zhǔn)確度和精密度要求可適當(dāng)放寬，要求校正標(biāo)樣回算的濃度一般應(yīng)該在標(biāo)示值的±15%以內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在±20%內(nèi)，質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的±15%之內(nèi)，定量下限準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。

信噪比作為容易獲得的參數(shù)，在檢測限和定量限的測定中使用非常方便。主要需要考慮的是由于受儀器、色譜柱、試劑、泵系統(tǒng)、檢測器等的影響很大，方法的靈敏度存在著很大的風(fēng)險。因此，可以分析方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)