細胞重組與細胞融合課件

第七章細胞重組與細胞融合生物科學與技術(shù)學院第七章細胞重組與細胞融合生物科學與技術(shù)學院細胞重組與細胞融合細胞重組：從活細胞中分離出細胞器及其組份，在體外進行重新裝配成為具有生物活性的細胞的一種技術(shù)。細胞融合：人工方法使2個或2個以上的細胞合并形成1個細胞的技術(shù)。細胞重組與細胞融合細胞重組：從活細胞中分離出細胞器及其組份，核體與胞質(zhì)體核體：與細胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細胞核，也成為小型細胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長分裂。胞質(zhì)體：除去細胞核后由質(zhì)膜包裹的無核細胞。細胞松弛素B處理細胞能誘發(fā)細胞排核反應，此時通過離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離。核體與胞質(zhì)體微細胞微細胞：又稱微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。秋水仙素和長春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，導致細胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運動，發(fā)散開的染色體各自裝配出自己的核膜，形成微細胞。秋水仙胺細胞松弛素B細胞松弛素B離心微細胞秋水仙胺細胞松弛素B細胞松弛素B離心胞質(zhì)體與完整細胞的重組形成胞質(zhì)雜種；微細胞與完整細胞的重組形成微細胞核異體；胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細胞。細胞重組的方式胞質(zhì)體與完整細胞的重組形成胞質(zhì)雜種；細胞重組的方式細胞重組技術(shù)將細胞融合技術(shù)與細胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)建不同類型的雜種細胞提供可能；細胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進行轉(zhuǎn)移，使重組細胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性。細胞重組的意義細胞重組技術(shù)將細胞融合技術(shù)與細胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)細胞質(zhì)工程細胞質(zhì)工程：是研究真核細胞的核-質(zhì)關系以及細胞器、細胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細胞質(zhì)工程是進行細胞重組的重要基礎。細胞質(zhì)工程涉及的技術(shù)有：1、細胞破碎2、細胞器及細胞組分分離3、細胞器轉(zhuǎn)移4、胞質(zhì)雜種細胞質(zhì)工程細胞質(zhì)工程：是研究真核細胞的核-質(zhì)關系以及細胞器、一、細胞破碎細胞破碎是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物釋放出來的技術(shù)。細胞破碎方法包含：1、超聲波破碎法2、反復凍融法3、高速組織搗碎法4、化學裂解法5、生物酶解法一、細胞破碎細胞破碎是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液，由發(fā)生器和換能器組成。反復凍融法將細胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。超聲波破碎法高速組織搗碎法借助高速組織搗碎機使細胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎?；瘜W裂解法通過化學藥品改變細胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法利用溶解細胞壁的酶處理細胞，破壞細胞壁，使細胞內(nèi)含組分釋放。高速組織搗碎法二、細胞器及細胞組分分離細胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不同，因此，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細胞內(nèi)各種組份分級分離出來。細胞器及細胞組份分離過程包括組織細胞勻漿、分級分離和分析三步。細胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液（等滲勻漿介質(zhì)，如0.25mol/L的蔗糖）中進行。細胞器及細胞組份分離方法包含：1、差速離心法2、密度梯度分離法二、細胞器及細胞組分分離細胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，第七章細胞重組與細胞融合課件沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時間表示的。蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實際上時常在10的-13次方秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，即10的-13方秒=1S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時離心方式離心運動是指物體有遠離中心運動的現(xiàn)象。根據(jù)離心機的類型分為水平離心、角離心（偏水平）和垂直離心三種。根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種。離心方式離心運動是指物體有遠離中心運動的現(xiàn)象。根據(jù)離心方式分差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉降差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：細胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復2～3次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：細胞核、線粒體、溶酶體與密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細胞或細胞器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2、等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細胞器，而不太適于分離和純化細胞。密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種速度沉降等密度沉降速度沉降等密度沉降三、細胞器轉(zhuǎn)移細胞器轉(zhuǎn)移是將一個物種的細胞器轉(zhuǎn)移到另一個物種細胞中的技術(shù)。細胞器轉(zhuǎn)移類似細胞核移植技術(shù)。不同的是操作對象為細胞器，不是細胞核。最常見的是線粒體和葉綠體的細胞器轉(zhuǎn)移。細胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式。三、細胞器轉(zhuǎn)移細胞器轉(zhuǎn)移是將一個物種的細胞器轉(zhuǎn)移到另一個物種四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉綠體）與一個特定的細胞核組合在一起得到的細胞稱為胞質(zhì)雜種。概念二：來自兩個原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細胞，其中一個細胞的細胞核消失后，兩個親代原生質(zhì)的細胞質(zhì)雜交得到的個體成為胞質(zhì)雜種。核心概念是細胞質(zhì)的雜交，不是細胞核，其中細胞質(zhì)中存在不同來源的細胞器，尤其是線粒體和葉綠體。四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉細胞融合細胞融合(Cellfusion)：又稱體細胞雜交，是指使用人工方法使兩個或兩個以上的體細胞合并形成一個細胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。細胞融合方法包含人工方法和無性方法1、人工方法：是指在外力使用誘導劑或促融劑、電場、磁場、超聲波、重力、激光等因素的作用。2、無性方式：是區(qū)別于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細胞卵子和精子相互接觸會發(fā)生細胞融合的現(xiàn)象。細胞融合細胞融合(Cellfusion)：又稱體細胞雜交，1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細胞；20世紀50年代：日本科學家發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可以引起細胞的融合；1965年：英國的科學家海利斯成功得到了融合細胞；1964年：HAT（次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)）選擇培養(yǎng)基應用于融合細胞的選擇；1974年：加拿大華裔科學家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）能夠促使植物的原生質(zhì)體融合；1982年：出現(xiàn)了電融合技術(shù)；近20年：從細胞融合的理論和實踐兩個方面進行了大量研究，細胞融合的方法不斷更新和完善，融合率逐步提高。細胞融合技術(shù)的發(fā)展史1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細胞；細胞融合技生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質(zhì)體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細胞融合成功的例子生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972幾種細胞細胞融合的類型異核體：來自兩個不同基因型的細胞融合成的融合細胞。同核體：基因型相同的細胞融合成的融合細胞。細胞融合包括對稱融合和不對稱融合。1、對稱融合：兩個完整的細胞間的融合。2、不對稱融合：其中一個細胞通過物理、化學或者生物的方法使該細胞的細胞核或者細胞質(zhì)失活后再與另一個完整的細胞進行的融合。細胞融合的類型異核體：來自兩個不同基因型的細胞融合成的融合細細胞融合的過程1、兩原生質(zhì)體或者細胞彼此靠近；2、質(zhì)膜融合形成細胞橋；3、胞質(zhì)滲透；4、細胞核融合。細胞融合的過程1、兩原生質(zhì)體或者細胞彼此靠近；細胞橋的形成過程細胞橋的形成過程植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖細胞融合的意義改造細胞遺傳物質(zhì)生產(chǎn)抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體用于基因定位用于動物育種有利于基礎理論研究細胞融合的意義改造細胞遺傳物質(zhì)細胞融合基本原理1、細胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白細胞融合的關鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無糖蛋白覆蓋的區(qū)域，使兩個細胞的脂雙層能緊密結(jié)合。細胞融合基本原理1、細胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白2、病毒促進細胞融合很多病毒都具有凝集細胞的能力，其原理大致如下：病毒的一邊黏接在一個細胞表面，病毒的另一邊黏接在另一個細胞表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺病毒促進細胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和細胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用，相互結(jié)合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細胞質(zhì)橋。2、病毒促進細胞融合3、化學誘導細胞融合（聚乙二醇PEG）PEG誘導細胞融合的兩種方式：PEG含有醚鍵、帶負電性可與細胞表面正的極性集團相連，引起細胞膜表面的蛋白起作用，使細胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細胞融合。PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中的自由水消失，導致細胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化，使細胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細胞融合。3、化學誘導細胞融合（聚乙二醇PEG）4、電場誘導細胞融合低壓交流電場中，細胞聚集成串珠狀緊密排列，相互接觸的細胞膜之間會出現(xiàn)無蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū)，當受到電擊時，這個區(qū)域就會被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導致細胞之間的細胞質(zhì)連通，發(fā)生細胞融合。細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。4、電場誘導細胞融合動物細胞融合1、細胞種類和性質(zhì)細胞表面性質(zhì)細胞種類2、環(huán)境條件的影響溫度：

pH：最適為7.4-7.8

氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20%3、離子強度及離子種類細胞融合時需要Ca2＋，最適為0.1mol/L細胞融合的影響因素動物細胞融合細胞融合的影響因素植物或微生物細胞融合1、PEG誘導融合的時間2、PEG純度3、融合密度一般為2x104－8x104個/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加組份植物或微生物細胞融合互補作用：親本細胞的性狀同時在雜種細胞中表現(xiàn)。激活作用：親本細胞的不活動基因在雜種細胞表達。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬細胞，與Hela細胞融合，融合后的細胞則可以合成兩種核酸。消失作用：親本細胞的性狀在雜種細胞中消失。如金黃倉鼠的黑色素瘤細胞可產(chǎn)生黑色素，小鼠的成纖維細胞不能產(chǎn)生黑色素，它們的雜種細胞不能產(chǎn)生黑色素。同時具有激活和消失作用如小鼠的胸腺細胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發(fā)育早期t12基因表達，h2基因不表達，在成年小鼠中h2基因表達，t12基因不表達，而在成年小鼠的胸腺細胞與小鼠胚胎性瘤細胞融合的雜種細胞中，h2基因不表達，卻激活了t12基因，使其表達。融合細胞特性的表現(xiàn)形式互補作用：親本細胞的性狀同時在雜種細胞中表現(xiàn)。融合細胞特性的融合細胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補選擇法；一類是根據(jù)可見標記形狀的機械選擇法?？顾幮院Y選系統(tǒng)如親本A對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏感，親本B對氨芐青霉素不敏感，對卡那霉素敏感，融合后的細胞對兩種抗生素都不敏感。營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)親本A為色氨酸缺陷型，親本B為蘇氨酸缺陷型，融合細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長。溫度敏感突變型融合細胞篩選親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長，親本B為高溫敏感突變型，不具備卡那霉素抗性，融合細胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長。融合細胞的篩選融合細胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補選擇物理特性篩選利用細胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細胞吸取挑選出來，也可以用離心的方式。熒光表記法

利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的堿性芯香紅熒光素分別標記兩個親本細胞，融合后的細胞內(nèi)存在兩種熒光標記物，利用流式細胞儀可進行分選。物理特性篩選細胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）：去除細胞壁后裸露的球型細胞。原生質(zhì)體主要是植物細胞，植物細胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。原生質(zhì)體雖然沒有細胞壁，但仍能進行基本的生命活動，在離體培養(yǎng)下可再生細胞壁。細胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）植物原生質(zhì)體的特點：1、吸收能力增強：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細胞器、細菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細胞壁再生并能進行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力；3、在一定條件下可誘導原生質(zhì)體融合，形成雜種細胞。4、分泌能力提高：去除了細胞壁的擴散障礙，使細胞膜的透過性增強，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5、穩(wěn)定性較差：失去了細胞壁的保護作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響。植物原生質(zhì)體的特點：原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換細胞壁合成機理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關系雜交或自交不親和的機理細胞間的相互作用植物激素的作用機理融合產(chǎn)生體細胞雜種分離各種細胞器引入各種細胞器導入外源基因誘發(fā)突變體原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換融合產(chǎn)生體細胞雜種原生質(zhì)體的制備*植物葉片取材容易比較容易用酶解法分離*植物根尖組織可由各種植物的種子萌發(fā)后取得*植物花粉產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體*愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞細胞壁容易解離材料來源原生質(zhì)體的制備*植物葉片材料來源原生質(zhì)體制備的前提是去除細胞壁，通常使用機械法和生物酶法。機械法：細胞放入高滲糖溶液中，質(zhì)壁分離，剪碎組織，在這個過程中，有些質(zhì)壁分離的細胞只被切去了細胞壁，從而釋放出完整的原生質(zhì)體。產(chǎn)量低；方法繁瑣費力；局限性大。分生組織和其他液泡化程度不高的細胞中分離原生質(zhì)體時不能用此法。原生質(zhì)體制備的前提是去除細胞壁，通常使用機械法和生物酶法。生物酶法：利用酶處理細胞壁，從而釋放出原生質(zhì)體。條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、收率高。纖維素酶類（Cellulase）：從綠色木霉中提取。果膠酶類（Pectolyase）：也叫離析酶，從根霉、黑曲霉中提取。半纖維素酶（Hemicellulase）：從黑曲霉中提取。常用于從愈傷組織中分離原生質(zhì)體。崩潰酶蝸牛酶生物酶法：利用酶處理細胞壁，從而釋放出原生質(zhì)體。條件溫和、原第七章細胞重組與細胞融合課件過濾、離心加果膠酶和纖維素酶原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）原生質(zhì)體純化的方法：去除破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細胞、細胞器及其他碎片等雜質(zhì)。(1)沉降法：利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進行過濾（44-169μm的篩網(wǎng)），然后低速離心（900-4500r/min)，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。比較簡單，但不易除盡一些完整的細胞，或引起原生質(zhì)的破碎。(2)漂浮法：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面?？梢缘玫捷^為純凈、完整的原生質(zhì)體，但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少。原生質(zhì)體純化的方法：500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇+原生質(zhì)體(3)界面法：采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中?？梢允盏綌?shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmo原生質(zhì)體的培養(yǎng)①液體培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)②固體平板法③固液雙層培養(yǎng)法

瓊脂糖珠培養(yǎng)原生質(zhì)體的培養(yǎng)原生質(zhì)體活力檢測染色法

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細胞質(zhì)膜，被活細胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。伊凡藍法：伊凡藍不能穿過質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴重損壞使細胞被染色。胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力；滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會隨著外界滲透壓的變化體積變化氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無光呼吸耗氧原生質(zhì)體活力檢測染色法第七章細胞重組與細胞融合生物科學與技術(shù)學院第七章細胞重組與細胞融合生物科學與技術(shù)學院細胞重組與細胞融合細胞重組：從活細胞中分離出細胞器及其組份，在體外進行重新裝配成為具有生物活性的細胞的一種技術(shù)。細胞融合：人工方法使2個或2個以上的細胞合并形成1個細胞的技術(shù)。細胞重組與細胞融合細胞重組：從活細胞中分離出細胞器及其組份，核體與胞質(zhì)體核體：與細胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細胞核，也成為小型細胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長分裂。胞質(zhì)體：除去細胞核后由質(zhì)膜包裹的無核細胞。細胞松弛素B處理細胞能誘發(fā)細胞排核反應，此時通過離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離。核體與胞質(zhì)體微細胞微細胞：又稱微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。秋水仙素和長春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，導致細胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運動，發(fā)散開的染色體各自裝配出自己的核膜，形成微細胞。秋水仙胺細胞松弛素B細胞松弛素B離心微細胞秋水仙胺細胞松弛素B細胞松弛素B離心胞質(zhì)體與完整細胞的重組形成胞質(zhì)雜種；微細胞與完整細胞的重組形成微細胞核異體；胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細胞。細胞重組的方式胞質(zhì)體與完整細胞的重組形成胞質(zhì)雜種；細胞重組的方式細胞重組技術(shù)將細胞融合技術(shù)與細胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)建不同類型的雜種細胞提供可能；細胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進行轉(zhuǎn)移，使重組細胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性。細胞重組的意義細胞重組技術(shù)將細胞融合技術(shù)與細胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)細胞質(zhì)工程細胞質(zhì)工程：是研究真核細胞的核-質(zhì)關系以及細胞器、細胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細胞質(zhì)工程是進行細胞重組的重要基礎。細胞質(zhì)工程涉及的技術(shù)有：1、細胞破碎2、細胞器及細胞組分分離3、細胞器轉(zhuǎn)移4、胞質(zhì)雜種細胞質(zhì)工程細胞質(zhì)工程：是研究真核細胞的核-質(zhì)關系以及細胞器、一、細胞破碎細胞破碎是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物釋放出來的技術(shù)。細胞破碎方法包含：1、超聲波破碎法2、反復凍融法3、高速組織搗碎法4、化學裂解法5、生物酶解法一、細胞破碎細胞破碎是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液，由發(fā)生器和換能器組成。反復凍融法將細胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。超聲波破碎法高速組織搗碎法借助高速組織搗碎機使細胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎?；瘜W裂解法通過化學藥品改變細胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法利用溶解細胞壁的酶處理細胞，破壞細胞壁，使細胞內(nèi)含組分釋放。高速組織搗碎法二、細胞器及細胞組分分離細胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不同，因此，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細胞內(nèi)各種組份分級分離出來。細胞器及細胞組份分離過程包括組織細胞勻漿、分級分離和分析三步。細胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液（等滲勻漿介質(zhì)，如0.25mol/L的蔗糖）中進行。細胞器及細胞組份分離方法包含：1、差速離心法2、密度梯度分離法二、細胞器及細胞組分分離細胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，第七章細胞重組與細胞融合課件沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時間表示的。蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實際上時常在10的-13次方秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，即10的-13方秒=1S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時離心方式離心運動是指物體有遠離中心運動的現(xiàn)象。根據(jù)離心機的類型分為水平離心、角離心（偏水平）和垂直離心三種。根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種。離心方式離心運動是指物體有遠離中心運動的現(xiàn)象。根據(jù)離心方式分差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉降差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：細胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復2～3次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：細胞核、線粒體、溶酶體與密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細胞或細胞器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2、等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細胞器，而不太適于分離和純化細胞。密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種速度沉降等密度沉降速度沉降等密度沉降三、細胞器轉(zhuǎn)移細胞器轉(zhuǎn)移是將一個物種的細胞器轉(zhuǎn)移到另一個物種細胞中的技術(shù)。細胞器轉(zhuǎn)移類似細胞核移植技術(shù)。不同的是操作對象為細胞器，不是細胞核。最常見的是線粒體和葉綠體的細胞器轉(zhuǎn)移。細胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式。三、細胞器轉(zhuǎn)移細胞器轉(zhuǎn)移是將一個物種的細胞器轉(zhuǎn)移到另一個物種四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉綠體）與一個特定的細胞核組合在一起得到的細胞稱為胞質(zhì)雜種。概念二：來自兩個原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細胞，其中一個細胞的細胞核消失后，兩個親代原生質(zhì)的細胞質(zhì)雜交得到的個體成為胞質(zhì)雜種。核心概念是細胞質(zhì)的雜交，不是細胞核，其中細胞質(zhì)中存在不同來源的細胞器，尤其是線粒體和葉綠體。四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉細胞融合細胞融合(Cellfusion)：又稱體細胞雜交，是指使用人工方法使兩個或兩個以上的體細胞合并形成一個細胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。細胞融合方法包含人工方法和無性方法1、人工方法：是指在外力使用誘導劑或促融劑、電場、磁場、超聲波、重力、激光等因素的作用。2、無性方式：是區(qū)別于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細胞卵子和精子相互接觸會發(fā)生細胞融合的現(xiàn)象。細胞融合細胞融合(Cellfusion)：又稱體細胞雜交，1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細胞；20世紀50年代：日本科學家發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可以引起細胞的融合；1965年：英國的科學家海利斯成功得到了融合細胞；1964年：HAT（次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)）選擇培養(yǎng)基應用于融合細胞的選擇；1974年：加拿大華裔科學家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）能夠促使植物的原生質(zhì)體融合；1982年：出現(xiàn)了電融合技術(shù)；近20年：從細胞融合的理論和實踐兩個方面進行了大量研究，細胞融合的方法不斷更新和完善，融合率逐步提高。細胞融合技術(shù)的發(fā)展史1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細胞；細胞融合技生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細胞葉——花瓣葉——懸浮細胞葉——懸浮細胞懸浮細胞——懸浮細胞葉——根懸浮細胞——葉原生質(zhì)體——血紅細胞懸浮細胞——葉懸浮細胞——葉腹水癌細胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細胞——畸胎瘤細胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細胞融合成功的例子生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972幾種細胞細胞融合的類型異核體：來自兩個不同基因型的細胞融合成的融合細胞。同核體：基因型相同的細胞融合成的融合細胞。細胞融合包括對稱融合和不對稱融合。1、對稱融合：兩個完整的細胞間的融合。2、不對稱融合：其中一個細胞通過物理、化學或者生物的方法使該細胞的細胞核或者細胞質(zhì)失活后再與另一個完整的細胞進行的融合。細胞融合的類型異核體：來自兩個不同基因型的細胞融合成的融合細細胞融合的過程1、兩原生質(zhì)體或者細胞彼此靠近；2、質(zhì)膜融合形成細胞橋；3、胞質(zhì)滲透；4、細胞核融合。細胞融合的過程1、兩原生質(zhì)體或者細胞彼此靠近；細胞橋的形成過程細胞橋的形成過程植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖細胞融合的意義改造細胞遺傳物質(zhì)生產(chǎn)抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體用于基因定位用于動物育種有利于基礎理論研究細胞融合的意義改造細胞遺傳物質(zhì)細胞融合基本原理1、細胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白細胞融合的關鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無糖蛋白覆蓋的區(qū)域，使兩個細胞的脂雙層能緊密結(jié)合。細胞融合基本原理1、細胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白2、病毒促進細胞融合很多病毒都具有凝集細胞的能力，其原理大致如下：病毒的一邊黏接在一個細胞表面，病毒的另一邊黏接在另一個細胞表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺病毒促進細胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和細胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用，相互結(jié)合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細胞質(zhì)橋。2、病毒促進細胞融合3、化學誘導細胞融合（聚乙二醇PEG）PEG誘導細胞融合的兩種方式：PEG含有醚鍵、帶負電性可與細胞表面正的極性集團相連，引起細胞膜表面的蛋白起作用，使細胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細胞融合。PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中的自由水消失，導致細胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化，使細胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細胞融合。3、化學誘導細胞融合（聚乙二醇PEG）4、電場誘導細胞融合低壓交流電場中，細胞聚集成串珠狀緊密排列，相互接觸的細胞膜之間會出現(xiàn)無蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū)，當受到電擊時，這個區(qū)域就會被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導致細胞之間的細胞質(zhì)連通，發(fā)生細胞融合。細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。4、電場誘導細胞融合動物細胞融合1、細胞種類和性質(zhì)細胞表面性質(zhì)細胞種類2、環(huán)境條件的影響溫度：

pH：最適為7.4-7.8

氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20%3、離子強度及離子種類細胞融合時需要Ca2＋，最適為0.1mol/L細胞融合的影響因素動物細胞融合細胞融合的影響因素植物或微生物細胞融合1、PEG誘導融合的時間2、PEG純度3、融合密度一般為2x104－8x104個/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加組份植物或微生物細胞融合互補作用：親本細胞的性狀同時在雜種細胞中表現(xiàn)。激活作用：親本細胞的不活動基因在雜種細胞表達。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬細胞，與Hela細胞融合，融合后的細胞則可以合成兩種核酸。消失作用：親本細胞的性狀在雜種細胞中消失。如金黃倉鼠的黑色素瘤細胞可產(chǎn)生黑色素，小鼠的成纖維細胞不能產(chǎn)生黑色素，它們的雜種細胞不能產(chǎn)生黑色素。同時具有激活和消失作用如小鼠的胸腺細胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發(fā)育早期t12基因表達，h2基因不表達，在成年小鼠中h2基因表達，t12基因不表達，而在成年小鼠的胸腺細胞與小鼠胚胎性瘤細胞融合的雜種細胞中，h2基因不表達，卻激活了t12基因，使其表達。融合細胞特性的表現(xiàn)形式互補作用：親本細胞的性狀同時在雜種細胞中表現(xiàn)。融合細胞特性的融合細胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補選擇法；一類是根據(jù)可見標記形狀的機械選擇法。抗藥性篩選系統(tǒng)如親本A對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏感，親本B對氨芐青霉素不敏感，對卡那霉素敏感，融合后的細胞對兩種抗生素都不敏感。營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)親本A為色氨酸缺陷型，親本B為蘇氨酸缺陷型，融合細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長。溫度敏感突變型融合細胞篩選親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長，親本B為高溫敏感突變型，不具備卡那霉素抗性，融合細胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長。融合細胞的篩選融合細胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補選擇物理特性篩選利用細胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細胞吸取挑選出來，也可以用離心的方式。熒光表記法

利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的堿性芯香紅熒光素分別標記兩個親本細胞，融合后的細胞內(nèi)存在兩種熒光標記物，利用流式細胞儀可進行分選。物理特性篩選細胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）：去除細胞壁后裸露的球型細胞。原生質(zhì)體主要是植物細胞，植物細胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。原生質(zhì)體雖然沒有細胞壁，但仍能進行基本的生命活動，在離體培養(yǎng)下可再生細胞壁。細胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）植物原生質(zhì)體的特點：1、吸收能力增強：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細胞器、細菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能