chapter4細(xì)胞破碎課件

Chapter4CellDisruption

第四章細(xì)胞破碎※

4.0Summary概述細(xì)胞破碎的目的細(xì)胞破碎的原因由于有許多生物代謝產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)部，必須在純化以前將細(xì)胞破碎，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到液相中，然后方可進(jìn)行提取尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)不會(huì)被分泌到發(fā)酵液中，而是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素也是包含在生物體中。破碎細(xì)胞的目的就是破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，增加其通透性，盡可能釋放胞內(nèi)的目標(biāo)產(chǎn)物。細(xì)胞破碎多用于小規(guī)模生產(chǎn)，在大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用極少。4.1細(xì)胞壁細(xì)胞壁：細(xì)胞膜強(qiáng)度差，易破碎，細(xì)胞壁堅(jiān)韌，是主要的破碎阻力，植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，破碎難度大，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，破碎難度小。不同微生物細(xì)胞壁具有不同的特性生物類型G+細(xì)菌G-細(xì)菌酵母菌霉菌植物細(xì)胞主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（幾丁質(zhì)）（80-90%）脂類蛋白質(zhì)初生壁次生壁微生物細(xì)胞壁：細(xì)菌：革蘭氏陽(yáng)性菌：肽聚糖層厚，難破碎革蘭氏陰性菌：肽聚糖層外還具有脂多糖，磷脂，脂蛋白，容易破碎革蘭氏陰性菌革蘭氏陽(yáng)性菌方法技術(shù)原理效果成本舉例化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞溫和便宜血紅細(xì)胞的破壞酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和高酶解酵母增溶法表面活性劑溶解細(xì)胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜甲苯破碎酵母細(xì)胞堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解劇烈便宜表4.0-1.細(xì)胞化學(xué)破碎法4.2化學(xué)破碎法利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。1.酶消化法破碎細(xì)胞中常用的酶常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶酶消化法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶消化法的缺點(diǎn)：酶價(jià)格高，該法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。酶法廣泛應(yīng)用于酵母細(xì)胞的水解,獲取酵母抽提物作為調(diào)味品或獲取核酸用于制備核苷酸植物細(xì)胞的水解,水解纖維素獲取葡萄糖堿處理法和酶消化法相反，反應(yīng)激烈，不具選擇性，但成本低廉。堿加入細(xì)胞懸浮液中后和細(xì)胞壁進(jìn)行了多種反應(yīng)，包括使磷脂皂化，使細(xì)胞壁的成分溶于表面活性劑，也使蛋白質(zhì)變性。該法不僅破壞了細(xì)胞壁也破壞了產(chǎn)物。該法多用于細(xì)胞破碎獲取粗提物2.堿處理法三種主要細(xì)胞破碎化學(xué)方法中最簡(jiǎn)單的是滲透沖擊法。此法將一定體積的細(xì)胞液加到2倍體積的水中，細(xì)胞中溶質(zhì)濃度高，水不斷進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，最后導(dǎo)致破裂。3.滲透沖擊法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。

滲透流的動(dòng)力來(lái)自滲透壓，滲透壓可能很大?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)平衡來(lái)估算，水的化學(xué)電勢(shì)是常數(shù)，即：μH2O(外)=μH2O(內(nèi))(4.2-1)細(xì)胞外純水的化學(xué)電勢(shì)包括標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)電勢(shì)和壓力修正項(xiàng)；與之平衡的胞內(nèi)的化學(xué)電勢(shì)包括三項(xiàng)，即標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)電勢(shì)、壓力修正相和濃度修正項(xiàng)。對(duì)于理想的不可壓縮溶液，這些修正相和式（4.2-1）可改寫(xiě)為：

μθH2O+VH2OP外=μθH2O+VH2OP內(nèi)+RTln(1-x1)(4.2-2)μθH2O——標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)電勢(shì)VH2O——水的偏摩爾體積x1——細(xì)胞內(nèi)所有溶質(zhì)的總摩爾分?jǐn)?shù)若胞內(nèi)物為稀溶液，其偏摩爾體積等于純水的摩爾體積。且x1很小時(shí)：Pout-Pin=(RT/--VH2o)×ln(1-x1)=(RT/--VH2o)×(-x1-x2/2-x3/3)=-RTc1+…(4.3)該式稱為范特霍夫定律。由該方程知細(xì)胞內(nèi)壓力必須小于細(xì)胞外壓力，否者，水會(huì)流入細(xì)胞內(nèi)，溶破細(xì)胞?？梢圆捎玫仁?.3估算出滲透壓的大小。許多細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度大約相當(dāng)于0.1M或0.2MNaCl。由此可見(jiàn)滲透壓必須很大，才能導(dǎo)致細(xì)胞的破碎4、增溶法

該法是利用表面活性劑。最典型的是將體積為細(xì)胞體積兩倍的某濃度的表面活性劑加入到細(xì)胞中。表面活性劑能將細(xì)胞壁破碎，制成的懸浮液可用離心分離除去細(xì)胞碎片，再用吸附柱或萃取劑分離制得產(chǎn)品。該法關(guān)鍵在于表面活性劑的化學(xué)性質(zhì)，由圖4.2-1所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)表示。結(jié)構(gòu)中有一個(gè)親水基團(tuán)，通常是離子；一個(gè)疏水基團(tuán)，通常是烴基。?；悄懰徕c：溶解脂肪十二烷基磺酸鈉：增加脂類的親水性表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的。SDS（十二烷基磺酸鈉）是典型的陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑還包括肥皂（脂肪酸鹽）。陽(yáng)離子表面活性劑主要是烷基胺鹽。圖4.2-1中的十二烷基溴胺是典型的例子。它有一個(gè)長(zhǎng)烷烴鏈（十六烷基）和三個(gè)甲基，都連接在一個(gè)帶正電的氮原子上，負(fù)離子通常是鹵素。細(xì)胞破碎時(shí)條件較溫和。

4.3物理破碎法物理破碎法主要是利用高壓、研磨或超聲波等手段在細(xì)胞壁上產(chǎn)生的剪切力達(dá)到破碎目的.包括高壓勻漿法,珠磨法和超聲破碎法方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)胞研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過(guò)的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理表4.0-1.細(xì)胞物理破碎法1.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用

Time,minFumaraseActivityAlcoholDehydrogenaseAdtivityApparentParticleSize圖4.3-1勻漿破碎細(xì)胞過(guò)程高壓勻漿器的排出閥易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽(yáng)性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)

大、中、小型高壓勻漿器細(xì)胞的勻漿破碎過(guò)程可用下述一級(jí)反應(yīng)方程式來(lái)描述：Ct/Cm＝1－e－t/?Ct－破碎細(xì)胞經(jīng)t時(shí)間后的產(chǎn)物濃度，mol/LCm－破碎細(xì)胞經(jīng)可達(dá)的最高產(chǎn)物濃度，mol/L?－細(xì)胞破碎的時(shí)間常數(shù)，隨剪切強(qiáng)度和壓力而改變，min進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。2.珠磨法（Beadmill）原理：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠體磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國(guó)西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。在珠磨法中，細(xì)胞的破碎率也能用一級(jí)速率方程式表示：ln[1/(1-R)]=KtK－破碎速率常數(shù)t－停留時(shí)間R－破碎率破碎速率常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如攪拌轉(zhuǎn)速、料液的循環(huán)流速、細(xì)胞懸浮液的濃度、玻璃小珠的裝置和珠體的直徑以及溫度等。高速珠磨機(jī)(highspcedbeadmill)研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中常采用高速珠磨機(jī)膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)

利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）影響超聲波的細(xì)胞破碎效率因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時(shí)間等。超聲波破碎法是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。該法在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。超聲波處理細(xì)胞懸浮液時(shí)，破碎作用受許多因素的影響，通常聲強(qiáng)和振幅影響很大，但強(qiáng)度太高易使蛋白質(zhì)變性，頻率的變化影響不明顯：此外介質(zhì)的離子強(qiáng)度、pH值、菌體的種類和濃度也有很大的影響.超聲波振蕩過(guò)程中遇到的最大問(wèn)題就是產(chǎn)生的熱量不容易驅(qū)散，所以影響了它在大規(guī)模工業(yè)上的應(yīng)用，但在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中是一種很好的方法4.4其他破碎方法凍結(jié)－融化法干燥法自溶法X-press法將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次。

1.反復(fù)凍結(jié)-融化法此法使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。

2.干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、