基因表達的定量檢測分析課件

基因表達的定量檢測分析基因表達的定量檢測方法1.蛋白表達水平的檢測：1）定量檢測分析：westernblotting、ELISA、HPLC2）蛋白質(zhì)功能分析：

蛋白質(zhì)亞細胞定位分析：免疫熒光技術(shù)

蛋白相互作用研究：酵母雙雜交、免疫共沉淀（IP）、

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

酶活性檢測：ELISA、HPLC2.mRNA表達水平檢測：1）半定量RT-PCR2）Northernblot

3）實時熒光定量PCR（RealtimePCR）

Northernblot雜交

是用來檢測真核生物RNA的表達量和大小，以估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息。其基本步驟包括：1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離3.將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物（尼龍膜）上，在轉(zhuǎn)移的過程中，

要保持RNA在凝膠中的相對分布4.將RNA固定到支持物上（UV交聯(lián)）5.固相RNA與探針分子（DNA或RNA）雜交6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子7.對特異結(jié)合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。實時熒光定量PCR原理

所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線或內(nèi)參基因的關(guān)系對起始模板進行定量分析的方法。與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測。一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：

熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。

在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。

而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。

只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和

CT值。

熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）2.熒光域值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-153.Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。絕對定量分析：

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系相對定量分析必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。管家基因：維持細胞基本代謝活動所必須的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等TaqmanProbeMolecularBeacon背景熒光更低qPCR一般使用二步PCR擴增，在退火