可見分光光度法和紫外分光光度法課件

第十三章可見分光光度法和紫外分光光度法VisibleSpectrophotometryandUltravioletSpectrophotometry第十三章可見分光光度法和紫外分光光度法VisibleSp1內(nèi)容提要物質(zhì)的吸收光譜分光光度法基本原理透光率和吸光度Lambert-Beer定律可見分光光度法分光光度計測定方法提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法紫外分光光度法簡介內(nèi)容提要物質(zhì)的吸收光譜2教學(xué)基本要求了解光的基本性質(zhì)及物質(zhì)對光的選擇性吸收。了解吸收光譜的意義。掌握分光光度法的基本原理，Lambert-Berr定律以及透光率、吸光度、摩爾吸光系數(shù)、質(zhì)量吸光系數(shù)等基本概念及相互關(guān)系。了解光的加和性。了解分光光度計的基本構(gòu)造，熟悉可見分光光度法的測定方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對照法，了解比吸光系數(shù)比較法和差示分光光度法。了解提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法。了解紫外分光光度法的一般概念教學(xué)基本要求了解光的基本性質(zhì)及物質(zhì)對光的選擇性吸收。了解吸收3第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對光的選擇性吸收光照射某物質(zhì)，物質(zhì)能夠吸收光，使原有的基態(tài)轉(zhuǎn)為激發(fā)態(tài)，只有當(dāng)分子的能量(h)與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差(E)相等時才能被吸收。M(基態(tài))+hM*(激發(fā)態(tài))物質(zhì)對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對光的選擇性吸收4第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜5第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜二、物質(zhì)的吸收光譜將不同波長的單色光依次通過有色溶液，測量溶液的吸光度A(absorbance)。以波長為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，得吸收曲線，或稱吸收光譜。吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用max表示。一般，max是定性鑒別物質(zhì)的基礎(chǔ)。不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比，這是進(jìn)行定量分析的依據(jù)。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜二、物質(zhì)的吸收光譜6第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸收光譜圖max=510nm不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸收7第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度入射光強(qiáng)度I0，吸收光強(qiáng)度Ia，透過光強(qiáng)度It，反射光強(qiáng)度為IrI0

═Ia+It+Ir被測溶液和參比溶液的吸收池同樣材料和厚度，反射光強(qiáng)度影響相互抵消，上式簡化為I0═Ia+It第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度8第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度透射光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比稱為透光率(transmittance)，用T表示透光率的負(fù)對數(shù)稱為吸光度，用符號A表示。A愈大，溶液對光的吸收愈多。第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度9第二節(jié)分光光度法基本原理二、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律：A=bc

溶液厚度b，單位cm；濃度c，單位molL-1；摩爾吸光系數(shù)，單位Lmol-1cm-1

若用質(zhì)量濃度代替cA═ab

質(zhì)量吸光系數(shù)a的單位Lg-1cm-1

a和可通過下式相互換算

═aM

第二節(jié)分光光度法基本原理二、Lambert-Beer定律10第三節(jié)可見分光光度法一、分光光度計主要部件光源單色光器檢測器吸收池訊號處理及顯示器光源：鎢燈，發(fā)出320~3200nm的連續(xù)光譜，單色光器：以棱鏡或光柵分光，提供單色光。吸收池：分光光度計中用來盛放溶液的容器。檢測器：通過吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。第三節(jié)可見分光光度法一、分光光度計11第三節(jié)可見分光光度法(a)自準(zhǔn)式單色光器示意圖(b)棱鏡對光的色散作用第三節(jié)可見分光光度法(a)自準(zhǔn)式單色光器示意圖12第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度A，作吸光度A對溶液濃度c的圖，得過坐標(biāo)原點的直線。在相同條件下，測量被測溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得溶液濃度。維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線13第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法標(biāo)準(zhǔn)對照法預(yù)先配制一個與待測液濃度相接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其濃度用cs表示)，測得其吸光度為As，再測定待測液的吸光度Ax，則待測液濃度cs可從下式求得第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法14第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差溶液偏離Beer定律偏離Beer定律，A-c曲線彎曲。主要原因：化學(xué)因素吸光物質(zhì)發(fā)生解離、締合、溶劑化等現(xiàn)象；光學(xué)因素復(fù)色光引起對Beer定律的偏離。兩種不同吸光系數(shù)的混合光對Beer定律的偏離第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差兩種15第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差儀器測定誤差光電管靈敏性差、光源不穩(wěn)定及讀數(shù)不準(zhǔn)。透光率誤差T引起濃度誤差c：透光率20%~65%，A為0.2~0.7時，濃度相對誤差較小。測量誤差和透光率的關(guān)系第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差測量16第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法三、選擇合適的測定條件波長的選擇顯色劑的用量溶液的酸度顯色時間和溫度共存離子的干擾及其消除第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法三、選擇合適的測定條件17第五節(jié)紫外分光光度法簡介一、751-G型分光光度計紫外分光光度法適用測定在近紫外區(qū)(200~380nm)有特征吸收的物質(zhì)。751-G型分光光度計裝有可轉(zhuǎn)換的適用于可見分光光度法的鎢燈光源和適用于紫外分光光度法的氫(氘)燈光源(發(fā)射200~400nm)。紫外光不能透過玻璃，故紫外分光光度計中棱鏡、透鏡、氫燈和光電管以及吸收池等均須用石英制造。第五節(jié)紫外分光光度法簡介一、751-G型分光光度計18第五節(jié)紫外分光光度法簡介751-G分光光度計光學(xué)系統(tǒng)簡圖1.鎢燈2.氫燈3.凹面反射鏡4.平面鏡5.狹縫6.準(zhǔn)直鏡7.石英棱鏡8.透鏡9.吸收池10.藍(lán)敏光電管11.紅敏光電管第五節(jié)紫外分光光度法簡介751-G分光光度計光學(xué)系統(tǒng)簡圖19第五節(jié)紫外分光光度法簡介二、紫外分光光度法的應(yīng)用定性鑒別比較max、(max)或a(max)比較吸光度(或吸光系數(shù)的比值)定量測定有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)研究第五節(jié)紫外分光光度法簡介二、紫外分光光度法的應(yīng)用20第十三章可見分光光度法和紫外分光光度法VisibleSpectrophotometryandUltravioletSpectrophotometry第十三章可見分光光度法和紫外分光光度法VisibleSp21內(nèi)容提要物質(zhì)的吸收光譜分光光度法基本原理透光率和吸光度Lambert-Beer定律可見分光光度法分光光度計測定方法提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法紫外分光光度法簡介內(nèi)容提要物質(zhì)的吸收光譜22教學(xué)基本要求了解光的基本性質(zhì)及物質(zhì)對光的選擇性吸收。了解吸收光譜的意義。掌握分光光度法的基本原理，Lambert-Berr定律以及透光率、吸光度、摩爾吸光系數(shù)、質(zhì)量吸光系數(shù)等基本概念及相互關(guān)系。了解光的加和性。了解分光光度計的基本構(gòu)造，熟悉可見分光光度法的測定方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對照法，了解比吸光系數(shù)比較法和差示分光光度法。了解提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法。了解紫外分光光度法的一般概念教學(xué)基本要求了解光的基本性質(zhì)及物質(zhì)對光的選擇性吸收。了解吸收23第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對光的選擇性吸收光照射某物質(zhì)，物質(zhì)能夠吸收光，使原有的基態(tài)轉(zhuǎn)為激發(fā)態(tài)，只有當(dāng)分子的能量(h)與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差(E)相等時才能被吸收。M(基態(tài))+hM*(激發(fā)態(tài))物質(zhì)對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對光的選擇性吸收24第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜25第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜二、物質(zhì)的吸收光譜將不同波長的單色光依次通過有色溶液，測量溶液的吸光度A(absorbance)。以波長為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，得吸收曲線，或稱吸收光譜。吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用max表示。一般，max是定性鑒別物質(zhì)的基礎(chǔ)。不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比，這是進(jìn)行定量分析的依據(jù)。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜二、物質(zhì)的吸收光譜26第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸收光譜圖max=510nm不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比。第一節(jié)物質(zhì)的吸收光譜三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸收27第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度入射光強(qiáng)度I0，吸收光強(qiáng)度Ia，透過光強(qiáng)度It，反射光強(qiáng)度為IrI0

═Ia+It+Ir被測溶液和參比溶液的吸收池同樣材料和厚度，反射光強(qiáng)度影響相互抵消，上式簡化為I0═Ia+It第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度28第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度透射光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比稱為透光率(transmittance)，用T表示透光率的負(fù)對數(shù)稱為吸光度，用符號A表示。A愈大，溶液對光的吸收愈多。第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度29第二節(jié)分光光度法基本原理二、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律：A=bc

溶液厚度b，單位cm；濃度c，單位molL-1；摩爾吸光系數(shù)，單位Lmol-1cm-1

若用質(zhì)量濃度代替cA═ab

質(zhì)量吸光系數(shù)a的單位Lg-1cm-1

a和可通過下式相互換算

═aM

第二節(jié)分光光度法基本原理二、Lambert-Beer定律30第三節(jié)可見分光光度法一、分光光度計主要部件光源單色光器檢測器吸收池訊號處理及顯示器光源：鎢燈，發(fā)出320~3200nm的連續(xù)光譜，單色光器：以棱鏡或光柵分光，提供單色光。吸收池：分光光度計中用來盛放溶液的容器。檢測器：通過吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。第三節(jié)可見分光光度法一、分光光度計31第三節(jié)可見分光光度法(a)自準(zhǔn)式單色光器示意圖(b)棱鏡對光的色散作用第三節(jié)可見分光光度法(a)自準(zhǔn)式單色光器示意圖32第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度A，作吸光度A對溶液濃度c的圖，得過坐標(biāo)原點的直線。在相同條件下，測量被測溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得溶液濃度。維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線33第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法標(biāo)準(zhǔn)對照法預(yù)先配制一個與待測液濃度相接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其濃度用cs表示)，測得其吸光度為As，再測定待測液的吸光度Ax，則待測液濃度cs可從下式求得第三節(jié)可見分光光度法二、測定方法34第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差溶液偏離Beer定律偏離Beer定律，A-c曲線彎曲。主要原因：化學(xué)因素吸光物質(zhì)發(fā)生解離、締合、溶劑化等現(xiàn)象；光學(xué)因素復(fù)色光引起對Beer定律的偏離。兩種不同吸光系數(shù)的混合光對Beer定律的偏離第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差兩種35第四節(jié)提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差儀器測定誤差光電管靈敏性差、光源不穩(wěn)定及讀數(shù)不準(zhǔn)。透光率誤差T引起濃度誤差c：透光率20%~65%，A為0.2~0.7時，濃度相對誤差較小。測量誤差和透光率的關(guān)系第四節(jié)提高測量