豬瘟防治技術(shù)規(guī)范

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本規(guī)范規(guī)定了豬瘟的診斷、疫情報(bào)告、疫情處置、疫情監(jiān)測(cè)、預(yù)防措施、控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)、控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)等。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事豬（含馴養(yǎng)的野豬）的飼養(yǎng)、經(jīng)營及其產(chǎn)品生產(chǎn)、經(jīng)營，以及從事動(dòng)物防疫活動(dòng)的單位和個(gè)人。2診斷依據(jù)本病流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化可作出初步診斷，確診需做病原分離與鑒定。2.1流行特點(diǎn)豬是本病唯一的自然宿主，發(fā)病豬和帶毒豬是本病的傳染源，不同年齡、性別、品種的豬均易感。一年四季均可發(fā)生。感染豬在發(fā)病前即能通過分泌物和排泄物排毒，并持續(xù)整個(gè)病程。與感染豬直接接觸是本病傳播的主要方式，病毒也可通過精液、胚胎、豬肉和泔水等傳播，人、其它動(dòng)物如鼠類和昆蟲、器具等均可成為重要傳播媒介。感染和帶毒母豬在懷孕期可通過胎盤將病毒傳播給胎兒，導(dǎo)致新生仔豬發(fā)病或產(chǎn)生免疫耐受。2.2臨床癥狀2.2.1本規(guī)范規(guī)定本病潛伏期為3-10天，隱性感染可長(zhǎng)期帶毒。根據(jù)臨床癥狀可將本病分為急性、亞急性、慢性和隱性感染四種類型。2.2.2典型癥狀2.2.2.1發(fā)病急、死亡率高；2.2.2.2體溫通常升至41℃2.2.2.3先便秘后腹瀉，或便秘和腹瀉交替出現(xiàn)；2.2.2.4腹部皮下、鼻鏡、耳尖、四肢內(nèi)側(cè)均可出現(xiàn)紫色出血斑點(diǎn)，指壓不褪色，眼結(jié)膜和口腔黏膜可見出血點(diǎn)。2.3病理變化2.3.1淋巴結(jié)水腫、出血，呈現(xiàn)大理石樣變；2.3.2腎臟呈土黃色，表面可見針尖狀出血點(diǎn)；2.3.3全身漿膜、黏膜和心臟、膀胱、膽囊、扁桃體均可見出血點(diǎn)和出血斑，脾臟邊緣出現(xiàn)梗死灶；2.3.4脾不腫大，邊緣有暗紫色突出表面的出血性梗死；2.3.52.4實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷必須在相應(yīng)級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2.4.1病原分離與鑒定2.4.1.1病原分離、鑒定可用細(xì)胞培養(yǎng)法（見附件1）；2.4.1.2病原鑒定也可采用豬瘟熒光抗體染色法，細(xì)胞漿出現(xiàn)特異性的熒光（見附件2）；2.4.1.3兔體交互免疫試驗(yàn)（附件3）；2.4.1.4豬瘟病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：主要用于臨床診斷與病原監(jiān)測(cè)（見附件4）。2.4.1.5豬瘟抗原雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法：主要用于臨床診斷與病原監(jiān)測(cè)（見附件5）。2.4.2血清學(xué)檢測(cè)2.4.2.1豬瘟病毒抗體阻斷ELISA檢測(cè)法（見附件6）；2.4.2.2豬瘟熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（見附件7）：2.4.2.3豬瘟中和試驗(yàn)方法（見附件8）。2.5結(jié)果判定2.5.1疑似豬瘟符合2．2．2．1，2．2．2．2，2．2．2．3，2．2．2．4，2．3．1，2．3．2，2．3．3，2．3．4之一的。豬瘟流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀和病理變化。2.5.2確診非免疫豬符合結(jié)果判定2.5.1，且符合血清學(xué)診斷2.4.2.1，、2.4.2.2，、2.4.2.3，之一；，或符合病原學(xué)診斷2.4.1.1，、2.4.1.2，、2.4.1.3，、2.4.1.4，、2.4.1.5之一的；免疫豬符合結(jié)果2.5.1，且符合病原學(xué)診斷2.4.1.1，、2.4.1.2，、2.4.1.3，、2.4.1.4，、2.4.1.5之一的。3疫情報(bào)告3.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)患有本病或疑似本病的豬，都應(yīng)當(dāng)立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。3.2當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)告后，按國家動(dòng)物疫情報(bào)告管理的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4疫情處理根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、剖檢病變，結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)做出的臨床診斷結(jié)果可作為疫情處理的依據(jù)。4.1當(dāng)?shù)乜h級(jí)以上動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到可疑豬瘟疫情報(bào)告后，應(yīng)及時(shí)派員到現(xiàn)場(chǎng)診斷，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理變化等初步診斷為疑似豬瘟?xí)r，應(yīng)立即對(duì)病豬及同群豬采取隔離、消毒、限制移動(dòng)等臨時(shí)性措施。同時(shí)采集病料送省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室確診，必要時(shí)將樣品送國家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室確診。4.2確診為豬瘟后，當(dāng)?shù)乜h級(jí)以上人民政府獸醫(yī)主管部門應(yīng)當(dāng)立即劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)，并采取相應(yīng)措施；同時(shí)，及時(shí)報(bào)請(qǐng)同級(jí)人民政府對(duì)疫區(qū)實(shí)行封鎖，逐級(jí)上報(bào)至國務(wù)院獸醫(yī)主管部門，并通報(bào)毗鄰地區(qū)。國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門根據(jù)確診結(jié)果，確認(rèn)豬瘟疫情。4.2.1劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)和受威脅區(qū)疫點(diǎn)：為病豬和帶毒豬所在的地點(diǎn)。一般指病豬或帶毒豬所在的豬場(chǎng)、屠宰廠或經(jīng)營單位，如為農(nóng)村散養(yǎng)，應(yīng)將自然村劃為疫點(diǎn)。疫區(qū)：是指疫點(diǎn)邊緣外延3公里受威脅區(qū)：是指疫區(qū)外延5公里4.2.2封鎖由縣級(jí)以上獸醫(yī)行政管理部門向本級(jí)人民政府提出啟動(dòng)重大動(dòng)物疫情應(yīng)急指揮系統(tǒng)、應(yīng)急預(yù)案和對(duì)疫區(qū)實(shí)行封鎖的建議，有關(guān)人民政府應(yīng)當(dāng)立即做出決定。4.2.3對(duì)疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)采取的措施疫點(diǎn)：撲殺所有的病豬和帶毒豬，并對(duì)所有病死豬、被撲殺豬及其產(chǎn)品按照GB16548規(guī)定進(jìn)行無害化處理；對(duì)排泄物、被污染或可能污染飼料和墊料、污水等均需進(jìn)行無害化處理；對(duì)被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒（見附件9）；限制人員出入，嚴(yán)禁車輛進(jìn)出，嚴(yán)禁豬只及其產(chǎn)品及可能污染的物品運(yùn)出。疫區(qū)：對(duì)疫區(qū)進(jìn)行封鎖，在疫區(qū)周圍設(shè)置警示標(biāo)志，在出入疫區(qū)的交通路口設(shè)置動(dòng)物檢疫消毒站(臨時(shí)動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站)，對(duì)出入的人員和車輛進(jìn)行消毒；對(duì)易感豬只實(shí)施緊急強(qiáng)制免疫，確保達(dá)到免疫保護(hù)水平；停止疫區(qū)內(nèi)豬及其產(chǎn)品的交易活動(dòng)，禁止易感豬只及其產(chǎn)品運(yùn)出；對(duì)豬只排泄物、被污染飼料、墊料、污水等按國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行無害化處理；對(duì)被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒。受威脅區(qū)：對(duì)易感豬只(未免或免疫未達(dá)到免疫保護(hù)水平)實(shí)施緊急強(qiáng)制免疫，確保達(dá)到免疫保護(hù)水平；對(duì)豬只實(shí)行疫情監(jiān)測(cè)和免疫效果監(jiān)測(cè)。4.2.4緊急監(jiān)測(cè)對(duì)疫區(qū)、受威脅區(qū)內(nèi)的豬群必須進(jìn)行臨床檢查和病原學(xué)監(jiān)測(cè)。4.2.5疫源分析與追蹤調(diào)查根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，分析疫源及其可能擴(kuò)散、流行的情況。對(duì)可能存在的傳染源，以及在疫情潛伏期和發(fā)病期間售(／運(yùn))出的豬只及其產(chǎn)品、可疑污染物（包括糞便、墊料、飼料等）等應(yīng)當(dāng)立即開展追蹤調(diào)查，一經(jīng)查明立即按照GB16548規(guī)定進(jìn)行無害化處理。4.2.6封鎖令的解除疫點(diǎn)內(nèi)所有病死豬、被撲殺的豬按規(guī)定進(jìn)行處理，疫區(qū)內(nèi)沒有新的病例發(fā)生，徹底消毒10天后，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)審驗(yàn)合格，當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門提出申請(qǐng)，由原封鎖令發(fā)布機(jī)關(guān)解除封鎖。4.2.7疫情處理記錄對(duì)處理疫情的全過程必須做好詳細(xì)的記錄（包括文字、圖片和影像等），并歸檔。5預(yù)防與控制以免疫為主，采取“撲殺和免疫相結(jié)合”的綜合性防治措施。5.1飼養(yǎng)管理與環(huán)境控制飼養(yǎng)、生產(chǎn)、經(jīng)營等場(chǎng)所必須符合《動(dòng)物防疫條件審核管理辦法》（農(nóng)業(yè)部[2002]15號(hào)令）規(guī)定的動(dòng)物防疫條件，并加強(qiáng)種豬調(diào)運(yùn)檢疫管理。5.2消毒各飼養(yǎng)場(chǎng)、屠宰廠（場(chǎng)）、動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站等要建立嚴(yán)格的衛(wèi)生（消毒）管理制度，做好；豬圈、加工廠、用具、車輛、糞便、道路和人員等應(yīng)進(jìn)行定期的嚴(yán)格消毒、殺蟲、滅鼠工作（見附件9）。5.3免疫和凈化5.3.1免疫國家對(duì)豬瘟實(shí)行全面免疫政策。預(yù)防免疫按農(nóng)業(yè)部制定的免疫方案規(guī)定的免疫程序進(jìn)行。所用疫苗必須是經(jīng)國務(wù)院獸醫(yī)主管部門批準(zhǔn)使用的豬瘟疫苗。5.3.2凈化對(duì)種豬場(chǎng)和規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的種豬定期采樣進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)陽性豬及時(shí)進(jìn)行撲殺和無害化處理，以逐步凈化豬瘟。5.4監(jiān)測(cè)和預(yù)警5.4.1監(jiān)測(cè)方法非免疫區(qū)域：以流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)監(jiān)測(cè)為主，結(jié)合病原鑒定。免疫區(qū)域：以病原監(jiān)測(cè)為主，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)監(jiān)測(cè)。5.4.2監(jiān)測(cè)范圍、數(shù)量和時(shí)間對(duì)于各類種豬場(chǎng)每年要逐頭監(jiān)測(cè)兩次；商品豬場(chǎng)每年監(jiān)測(cè)兩次，抽查比例不低于0.1%，最低不少于20頭；散養(yǎng)豬不定期抽查?；虬凑辙r(nóng)業(yè)部年度監(jiān)測(cè)計(jì)劃執(zhí)行。5.4.3監(jiān)測(cè)報(bào)告監(jiān)測(cè)結(jié)果要及時(shí)匯總，由省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)定期上報(bào)中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。5.4.4預(yù)警各級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果及相關(guān)信息進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，做好預(yù)警預(yù)報(bào)。5.5消毒飼養(yǎng)場(chǎng)、屠宰廠（場(chǎng)）、交易市場(chǎng)、運(yùn)輸工具等要建立并實(shí)施嚴(yán)格的消毒制度。5.6檢疫5.6.1產(chǎn)地檢疫生豬在離開飼養(yǎng)地之前，養(yǎng)殖場(chǎng)/戶必須向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)檢。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)檢后必須及時(shí)派員到場(chǎng)/戶實(shí)施檢疫。檢疫合格后，出具合格證明；對(duì)運(yùn)載工具進(jìn)行消毒，出具消毒證明，對(duì)檢疫不合格的按照有關(guān)規(guī)定處理。5.6.2屠宰檢疫動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的檢疫人員對(duì)生豬進(jìn)行驗(yàn)證查物，合格后方可入廠/場(chǎng)屠宰。檢疫合格并加蓋（封）檢疫標(biāo)志后方可出廠/場(chǎng)，不合格的按有關(guān)規(guī)定處理。5.6.3種豬異地調(diào)運(yùn)檢疫跨省調(diào)運(yùn)種豬時(shí)，應(yīng)先到調(diào)入地省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)辦理檢疫審批手續(xù)，調(diào)出地按照進(jìn)行檢疫，檢疫合格方可調(diào)運(yùn)。到達(dá)后須隔離飼養(yǎng)10天以上，由當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫合格后方可投入使用。6控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)6.1免疫無豬瘟區(qū)6.1.1該區(qū)域首先要達(dá)到國家無規(guī)定疫病區(qū)基本條件。6.1.2有定期、快速的動(dòng)物疫情報(bào)告記錄。6.1.3該區(qū)域在過去3年內(nèi)未發(fā)生過豬瘟。6.1.4該區(qū)域和緩沖帶實(shí)施強(qiáng)制免疫，免疫密度100%，所用疫苗必須符合國家獸醫(yī)主管部門規(guī)定。6.1.5該區(qū)域和緩沖帶須具有運(yùn)行有效的監(jiān)測(cè)體系，過去2年內(nèi)實(shí)施疫病和免疫效果監(jiān)測(cè)，未檢出病原，免疫效果確實(shí)。6.1.6所有的報(bào)告，免疫、監(jiān)測(cè)記錄等有關(guān)材料詳實(shí)、準(zhǔn)確、齊全。若免疫無豬瘟區(qū)內(nèi)發(fā)生豬瘟?xí)r，最后一例病豬撲殺后12個(gè)月，經(jīng)實(shí)施有效的疫情監(jiān)測(cè)，確認(rèn)后方可重新申請(qǐng)免疫無豬瘟區(qū)。6.2非免疫無豬瘟區(qū)6.2.1該區(qū)域首先要達(dá)到國家無規(guī)定疫病區(qū)基本條件。6.2.2有定期、快速的動(dòng)物疫情報(bào)告記錄。6.2.3在過去2年內(nèi)沒有發(fā)生過豬瘟，并且在過去12個(gè)月內(nèi)，沒有進(jìn)行過免疫接種；另外，該地區(qū)在停止免疫接種后，沒有引進(jìn)免疫接種過的豬。6.2.4在該區(qū)具有有效的監(jiān)測(cè)體系和監(jiān)測(cè)區(qū)，過去2年內(nèi)實(shí)施疫病監(jiān)測(cè)，未檢出病原。6.2.5所有的報(bào)告、監(jiān)測(cè)記錄等有關(guān)材料詳實(shí)、準(zhǔn)確、齊全。若非免疫無豬瘟區(qū)發(fā)生豬瘟后，在采取撲殺措施及血清學(xué)監(jiān)測(cè)的情況下，最后一例病豬撲殺后6個(gè)月；或在采取撲殺措施、血清學(xué)監(jiān)測(cè)及緊急免疫的情況下，最后一例免疫豬被屠宰后6個(gè)月，經(jīng)實(shí)施有效的疫情監(jiān)測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)確認(rèn)后，方可重新申請(qǐng)非免疫無豬瘟區(qū)。

附件1病毒分離鑒定采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離病毒是診斷豬瘟的一種靈敏方法。通常使用對(duì)豬瘟病毒敏感的細(xì)胞系如PK-15細(xì)胞等，加入2%扁桃體、腎臟、脾臟或淋巴結(jié)等待檢組織懸液于培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)48～72步驟如下：1.制備抗生素濃縮液（青霉素10000IU/mL、鏈霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL），小瓶分裝，-20℃2.取1～2g待檢病料組織放入滅菌研缽中，剪刀剪碎，加入少量無菌生理鹽水，將其研磨勻漿；再加入Hank’’Ss平衡鹽溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液，制成20%(w/v)組織懸液；最后按1/10的比例加入抗生素濃縮液，混勻后室溫作用1小時(shí)；以1000g離心15分鐘，取上清液備用。3.用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15細(xì)胞單層，將所得細(xì)胞懸液以1000g離心10分鐘，再用一定量EMEM生長(zhǎng)液[含5%胎牛血清(無BVDV抗體)，56℃滅活30分鐘]、0.3％谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)懸浮，使細(xì)胞濃度為2×106/mL4.9份細(xì)胞懸液與1份上清液混合，接種6～8支含細(xì)胞玻片的萊頓氏管(leighton’s)(或其它適宜的細(xì)胞培養(yǎng)瓶),每管0.2mL；同時(shí)設(shè)3支萊頓氏管接種細(xì)胞懸液作陰性對(duì)照；另設(shè)3支萊頓氏管接種豬瘟病毒作陽性對(duì)照。5.經(jīng)培養(yǎng)24、48、72小時(shí)，分別取2管組織上清培養(yǎng)物及1管陰性對(duì)照培養(yǎng)物、1管陽性對(duì)照培養(yǎng)物，取出細(xì)胞玻片，以磷酸緩沖鹽水（PBS液，pH7.2，0.01M）或生理鹽水洗滌2次，每次5分鐘，用冷丙酮(分析純)固定10分鐘，晾干，采用豬瘟病毒熒光抗體染色法進(jìn)行檢測(cè)（見附件2）。6.根據(jù)細(xì)胞玻片豬瘟熒光抗體染色強(qiáng)度，判定病毒在細(xì)胞中的增殖情況，若熒光較弱或?yàn)殛幮裕瑧?yīng)按步驟4將組織上清細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行病毒盲傳。臨床發(fā)病豬或疑似病豬的全血樣是豬瘟早期診斷樣品。接種細(xì)胞時(shí)操作程序如下：取-20℃凍存全血樣品置37℃水浴融化；向24孔板每孔加300微升血樣以覆蓋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15單層細(xì)胞；37℃吸附2小時(shí)。棄去接種液，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞二次，然后加入EMEM維持液，37℃培養(yǎng)24至

附件2豬瘟熒光抗體染色法熒光抗體染色法快速、特異，可用于檢測(cè)扁桃體等組織樣品以及細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒抗原。操作程序如下：1樣品的采集和選擇1.1活體采樣：利用扁桃體采樣器（鼻捻子、開口器和采樣槍）。采樣器使用前均須用3%氫氧化鈉溶液消毒后經(jīng)清水沖洗。首先固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采取扁桃體樣品，用滅菌牙簽挑至滅菌離心管并作標(biāo)記。1.2其它樣品：剖檢時(shí)采取的病死豬臟器，如扁桃體、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)、肝臟和肺等臟器，或病毒分離時(shí)待檢的細(xì)胞玻片。1.3樣品采集、包裝與運(yùn)輸按農(nóng)業(yè)部相關(guān)要求執(zhí)行。2檢測(cè)方法與判定2.1方法：將上述組織制成冰凍切片，或待檢的細(xì)胞培養(yǎng)片（見附件1），將液體吸干后經(jīng)冷丙酮固定5～10分鐘，晾干。滴加豬瘟熒光抗體覆蓋于切片或細(xì)胞片表面，置濕盒中37℃作用30分鐘。然后用PBS液洗滌，自然干燥。用碳酸緩沖甘油（pH9.0～9.5，0.5M2.2判定：在熒光顯微鏡下，見切片或細(xì)胞培養(yǎng)物（細(xì)胞蓋片）中有胞漿熒光，并由抑制試驗(yàn)證明為特異的熒光，判豬瘟陽性；無熒光判為陰性。2.3熒光抑制試驗(yàn)：將兩組豬瘟病毒感染豬的扁桃體冰凍切片，分別滴加豬瘟高免血清和健康豬血清（豬瘟中和抗體陰性），在濕盒中37℃作用30分鐘，用生理鹽水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然后進(jìn)行熒光抗體染色。經(jīng)用豬瘟高免血清處理的扁桃體切片，隱窩上皮細(xì)胞不應(yīng)出現(xiàn)熒光，或熒光顯著減弱；而用陰性血清處理的切片，隱窩上皮細(xì)胞仍出現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。

附件兔體交互免疫試驗(yàn)本方法用于檢測(cè)疑似豬瘟病料中的豬瘟病毒。1試驗(yàn)動(dòng)物家兔1.5～2kg、體溫波動(dòng)不大的大耳白兔，并在試驗(yàn)前1天測(cè)基礎(chǔ)體溫。2試驗(yàn)操作方法將病豬的淋巴結(jié)和脾臟，磨碎后用生理鹽水作1：10稀釋，對(duì)3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另設(shè)3只不注射病料的對(duì)照兔，間隔5天對(duì)所有家兔靜脈注射1:20的豬瘟兔化病毒（淋巴脾臟毒），1mL/只，24h后，每隔6小時(shí)測(cè)體溫一次，連續(xù)測(cè)96小時(shí)，對(duì)照組2/3出現(xiàn)定型熱或輕型熱，試驗(yàn)成立。3兔體交互免疫試驗(yàn)結(jié)果判定接種病料后體溫反應(yīng)接種豬瘟兔化弱毒后體溫反應(yīng)結(jié)果判定--含豬瘟病毒-+不含豬瘟病毒+-含豬瘟兔化病毒++含非豬瘟病毒熱原性物質(zhì)注：“+”表示多于或等于三分之二的動(dòng)物有反應(yīng)。附件4豬瘟病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）RT-PCR方法通過檢測(cè)病毒核酸而確定病毒存在，是一種特異、敏感、快速的方法。在RT-PCR擴(kuò)增的特定基因片段的基礎(chǔ)上，進(jìn)行基因序列測(cè)定，將獲得的基因信息與我國豬瘟分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析，可進(jìn)一步鑒定流行毒株的基因型，從而追蹤流行毒株的傳播來源或預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)新的流行毒株。材料與樣品準(zhǔn)備1.1材料準(zhǔn)備：本試驗(yàn)所用試劑需用無RNA酶污染的容器分裝；各種離心管和帶濾芯吸頭需無RNA酶污染；剪刀、鑷子和研缽器須經(jīng)干烤滅菌。1.2樣品制備：按1：5（W/V）比例，取待檢組織和PBS液于研缽中充分研磨，4℃，1000g離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)入無RNA酶污染的離心管中，備用；全血采用脫纖抗凝備用；細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次備用；其它樣品酌情處理。制備的樣品在2～8℃保存不應(yīng)超過24小時(shí)，長(zhǎng)期保存應(yīng)小分裝后置RNA提取2.1取1.5mL離心管，每管加入800μLRNA提取液（通用Trizol）和被檢樣品200μL，充分混勻，靜置5分鐘。同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照管，每份樣品換一個(gè)吸頭。2.2加入200μL氯仿，充分混勻，靜置5分鐘，4℃、12000g離心152.3取上清約500μL（注意不要吸出中間層）移至新離心管中，加等量異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000g離心102.4小心棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入1000μL75%乙醇，顛倒洗滌，4℃、12000g離心102.5小心棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；4000g離心10分鐘，將管壁上殘余液體甩到管底部，小心吸干上清，吸頭不要碰到有沉淀的一面，每份樣品換一個(gè)吸頭，室溫干燥。2.6加入10μLDEPC水和10URNasin,輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，4000g離心10分鐘，盡快進(jìn)行試驗(yàn)。長(zhǎng)期保存應(yīng)置-70℃cDNA合成取200μLPCR專用管，連同陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管，每管加10μLRNA和50pM下游引物P2(P25’-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）AAGTCATC-3’PCR4.1取200μLPCR專用管，連同陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管，每管加上述10μLcDNA和適量水，95℃預(yù)變性54.2每管加入10倍稀釋緩沖液5μL，上游引物P1（5’-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3’）和下游引物P2各50pM，10mol/LdNTP2μL，Taq酶2.5U，補(bǔ)水至50μ4.3置PCR儀，循環(huán)條件為95C50sec，58C60sec，72C35sec，共40個(gè)循環(huán)，72結(jié)果判定取RT-PCR產(chǎn)物5μL，于1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含0.5μL/mL溴化乙錠，電泳緩沖液為0.5×TBE，80V30分鐘，電泳完后于長(zhǎng)波紫外燈下觀察拍照。陽性對(duì)照管和樣品檢測(cè)管出現(xiàn)251nt的特異條帶判為陽性；陰性管和樣品檢測(cè)管未出現(xiàn)特異條帶判為陰性。

附件5豬瘟抗原雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法本方法通過形成的多克隆抗體-樣品-單克隆抗體夾心，并采用辣根過氧化物酶標(biāo)記物檢測(cè)，對(duì)外周血白細(xì)胞、全血、細(xì)胞培養(yǎng)物以及組織樣本中的豬瘟病毒抗原進(jìn)行檢測(cè)的一種雙抗體夾心ELISA方法。具體如下：1試劑盒組成1.1多克隆羊抗血清包被板條8孔×12條（96孔）1.2CSFV陽性對(duì)照，含有防腐劑1.5mL1.3CSFV陰性對(duì)照，含有防腐劑1.5mL1.4100倍濃縮辣根過氧化物酶標(biāo)記物（100×）辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG，含防腐劑200uL1.510倍濃縮樣品稀釋液（10×）55mL1.6底物液，TMB/H2O2溶液12mL1.7終止液，1MHCL（小心，強(qiáng)酸）12mL1.810倍濃縮洗滌液（10×）125mL1.9CSFV單克隆抗體，含防腐劑4mL1.10酶標(biāo)抗體稀釋液15mL2樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷凍保存6個(gè)月以上。但這些樣品在應(yīng)用前應(yīng)該再次以1500g離心10分鐘或10000g離心2～52.1外周血白細(xì)胞2.1.1取10mL肝素或EDTA抗凝血樣品，1500g離心15～20分鐘。2.1.2再用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入500uL樣品稀釋液（1×）,在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時(shí)，期間不時(shí)旋渦混合。然后直接進(jìn)行步驟2.1.6操作。2.1.3假如樣品的棕黃層壓積細(xì)胞體積非常少，那么就用整個(gè)細(xì)胞團(tuán)（包括紅細(xì)胞）。將細(xì)胞加進(jìn)10mL的離心管，并加入5mL預(yù)冷（2～7℃，下同）的0.17MNH4Cl。混勻，靜置102.1.4用冷（2～7℃）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1500g離心52.1.5棄去上清，向細(xì)胞團(tuán)中加入500uL樣品稀釋液（1×）,用潔凈的吸頭懸起細(xì)胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)旋渦混合。2.1.61500g離心5分鐘,取上清液按操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。注意：處理好的的樣品可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷凍保存62.2外周血白細(xì)胞（簡(jiǎn)化方法）2.2.1取0.5～2mL肝素或EDTA抗凝血與等體積冷0.17MNH4Cl加入離心管混合。室溫放置102.2.21500g離心10分鐘（或10000g離心2－3分鐘），棄上清。2.2.3用冷（2～7℃）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1500g離心52.2.4棄去上清，向細(xì)胞團(tuán)加入500ul樣本稀釋液（1×）。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時(shí)。期間不時(shí)旋渦混勻。取75ul按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。2.3全血（肝素或EDTA抗凝）2.3.1取25uL10倍濃縮樣品稀釋液（10×）和475uL全血加入微量離心管，在旋渦振蕩器上混勻。2.3.2室溫下孵育1小時(shí)，期間不時(shí)旋渦混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)?；颍褐苯訉?5uL全血加入酶標(biāo)板孔中，再加入10uL5倍濃縮樣品稀釋液（5×）?；蝿?dòng)酶標(biāo)板／板條，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。2.4細(xì)胞培養(yǎng)物2.4.1移去細(xì)胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞加入離心管中。2.4.22500g離心5分鐘，棄上清。2.4.3向細(xì)胞團(tuán)中加入500uL樣品稀釋液（1×）。旋渦振蕩充分混勻，室溫孵育1小時(shí)。期間不時(shí)旋渦混合。取此樣品75uL按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。2.5組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于2～7℃冷藏保存1個(gè)月。每只動(dòng)物檢測(cè)1～2種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。2.5.1取1～2g組織用剪刀剪成小碎塊（2～5mm大?。?。2.5.2將組織碎塊加入10mL離心管，加入5mL樣品稀釋液（1×）,旋渦振蕩混勻，室溫下孵育1～21小時(shí)，期間不時(shí)旋渦混合。2.5.31500g離心5分鐘，取75uL上清液按照“操作步驟”進(jìn)行檢測(cè)。3操作步驟注意：所有試劑在使用前應(yīng)該恢復(fù)至室溫18～22℃；使用前試劑應(yīng)在室溫條件下至少放置1小時(shí)。3.1每孔加入25uLCSFV特異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器操作。3.2在相應(yīng)孔中分別加入75uL陽性對(duì)照、陰性對(duì)照，各加2孔。注意更換吸頭。3.3在其余孔中分別加入75uL制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標(biāo)板，使樣品混合均勻。3.4置濕盒中或用膠條密封后室溫（18～22℃）孵育過夜。也可以孵育43.5甩掉孔中液體，用洗滌液（1×）洗滌5次，每次洗滌都要將孔中的所有液體倒空，用力拍打酶標(biāo)板，以使所有液體拍出?；蛘?，每孔加入洗滌液250～300uL用自動(dòng)洗板機(jī)洗滌5次。注意:，洗滌酶標(biāo)板要仔細(xì)。3.6每孔加入100uL稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記物，在濕盒或密封后置室溫孵育1小時(shí)。3.7重復(fù)操作步驟3.5；每孔加入100uL底物液，在暗處室溫孵育10分鐘。第1孔加入底物液開始計(jì)時(shí)。3.8每孔加入100uL終止液終止反應(yīng)。加入終止液的順序與上述加入底物液的順序一致。3.9在酶標(biāo)儀上測(cè)量樣品與對(duì)照孔在450nm處的吸光值，或測(cè)量在450nm和620nm雙波長(zhǎng)的吸光值（空氣調(diào)零）。3.10計(jì)算每個(gè)樣品和陽性對(duì)照孔的矯正OD值的平均值（參見“計(jì)算方法”）。4計(jì)算方法首先計(jì)算樣品和對(duì)照孔的OD平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽性對(duì)照孔的OD平均值必須進(jìn)行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽性對(duì)照值減去陰性對(duì)照值。矯正OD值＝樣本OD值－陰性對(duì)照OD值5試驗(yàn)有效性判定陽性對(duì)照OD平均值應(yīng)該大于0.500，陰性對(duì)照OD平均值應(yīng)小于陽性對(duì)照平均值的20％，試驗(yàn)結(jié)果方能有效。否則，應(yīng)仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)操作并進(jìn)行重測(cè)。如果陰性對(duì)照的OD值始終很高，將陰性對(duì)照在微量離心機(jī)中10000g離心3～5分鐘，重新檢測(cè)。6結(jié)果判定被檢樣品的矯正OD值大于或等于0.300，則為陽性；被檢樣品的矯正OD值小于0.200，則為陰性；被檢樣品的矯正OD值大于0.200，小于0.300，則為可疑。附件6豬瘟病毒抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法本方法是用于檢測(cè)豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的一種阻斷ELISA方法，通過待測(cè)抗體和單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，采用辣根過氧化物酶與底物的顯色程度來進(jìn)行判定。1操作步驟在使用時(shí)，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫18～25℃。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫至少1小時(shí)。1.1分別將50uL樣品稀釋液加入每個(gè)檢測(cè)孔和對(duì)照孔中。1.2分別將50uL的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照加入相應(yīng)的對(duì)照孔中，注意不同對(duì)照的吸頭要更換，以防污染。1.3分別將50uL的被檢樣品加入剩下的檢測(cè)孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防污染。1.4輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，使將反應(yīng)板中的溶液混勻。1.5將微量反應(yīng)板用封條封閉置或于濕箱中（18～25℃）孵育2小時(shí)，也可以將微量反應(yīng)板用封條置或1.6吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3次，注意每次洗滌時(shí)都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔。1.7分別將100uL的抗CSFV酶標(biāo)二抗（即取即用）加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板并于室溫下或濕箱中孵育30分鐘。1.8洗板（見1.6）后，分別將100uL的底物溶液加入反應(yīng)孔中，于避光、室溫條件下放置10分鐘。加完第一孔后即可計(jì)時(shí)。1.9在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100uL終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止液。1.10在450nm處測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光值，也可用雙波長(zhǎng)(450nm和620nm)測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光度值，空氣調(diào)零。1.11計(jì)算樣本和對(duì)照的平均吸光度值。計(jì)算方法如下：計(jì)算被檢樣本的平均值OD450（＝ODTEST）、陽性對(duì)照的平均值（＝ODPOS）、陰性對(duì)照的平均值（＝ODNEG）。根據(jù)以下公式計(jì)算被檢樣本和陽性對(duì)照的阻斷率；ODNEG-ODTEST阻斷率＝———————×100%ODNEG2試驗(yàn)有效性陰性對(duì)照的平均OD450應(yīng)大于0.50。陽性對(duì)照的阻斷率應(yīng)大于50%％。3結(jié)果判定如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40％，該樣本被判定為陽性（有CSFV抗體存在）。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30％，該樣本被判定為陰性（無CSFV抗體存在）。如果被檢樣本阻斷率在30～40％之間，應(yīng)在數(shù)日后再對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行重測(cè)。附件7熒光抗體病毒中和試驗(yàn)本方法是國際貿(mào)易指定的豬瘟抗體檢測(cè)方法。該試驗(yàn)是采用固定病毒稀釋血清的方法。測(cè)定的結(jié)果表示待檢血清中抗體的中和效價(jià)。具體操作如下：將濃度為2×105細(xì)胞/mL的PK-15細(xì)胞懸液接種到帶有細(xì)胞玻片的5cm平皿或萊頓氏管（leighton’s），也可接種到平底微量培養(yǎng)板中；細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至匯合率為70%～80%的細(xì)胞單層（1～2將待檢血清56℃滅活30分鐘，用無血清EMEM培養(yǎng)液作