DB37-T 3997-2020 細(xì)菌耐藥基因blaNDM常見亞型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)-（高清版）

ICS11.220B41

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3997—2020Loop-mediatedisothermalamplificationdetectiontechniqueforcommonsubtypesofbacterialresistancegeneblaNDM20200608Loop-mediatedisothermalamplificationdetectiontechniqueforcommonsubtypesofbacterialresistancegeneblaNDM2020060820200708山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、山東潤達(dá)檢測技術(shù)有限公司。細(xì)菌耐藥基因baM常見亞型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了細(xì)菌耐藥基因blaNDM常見亞型（blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9）的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP（Loop-MediatedIsothermalAmplification）檢測技術(shù)的操作步驟。blaNDM-4blaNDM-5blaNDM-9）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T16489水質(zhì)硫化物的測定亞甲基藍(lán)分光光度法BstDNADNA除非特別規(guī)定所用試劑均用分析純水：符合國標(biāo)GB/T6682一級水的規(guī)定。BstDNA0.5×TBEA.22A.3DNAMarker2000DNA引物：blaNDMLAMP——外引物F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’；——外引物B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’；——內(nèi)引物FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’；——內(nèi)引物BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’；——環(huán)引物L(fēng)F：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’；——環(huán)引物L(fēng)B：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’。5.110μL、20μL、100μL1000。20000g0.001g樣品（3712h～18hBHI12h～18hDNA心2min，徹底棄上清，取沉淀用商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，最后溶于50μL滅菌水中，測定DNA的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表1。表1心2min，徹底棄上清，取沉淀用商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，最后溶于50μL滅菌水中，測定DNA的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表1。表1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMPRM[40mMpH為8.8的Tris-HCl20mMKCl16mMMgSO4202SO4、0.2wt%Tween20、1.6M甜菜堿、2.8mMdNTP]。6.4擴(kuò)增檢測blaNDMLAMPLAMP（25μL/LAMPLAMPLAMP1.0μLDNA（300ng/μL）；設(shè)置1管為陰性對照，加入1.0μL的滅菌水取代細(xì)菌基因組DNA。12×等溫緩沖液(RM)12.5μL2外引物B3/F3(100μM)0.1μL×23內(nèi)引物BIP/FIP(100μM)0.4μL×24環(huán)引物L(fēng)F/LB(100μM)0.2μL×25BstDNA聚合酶1.0μL6細(xì)菌基因組DNA2.0μL7滅菌水8.1μLLAMPLAMP1.0μL25μL1.0μLDNA2表2LAMP步驟溫度時間功能165℃40min恒溫?cái)U(kuò)增280℃5min滅活酶處理試驗(yàn)過程注意事項(xiàng)：LAMPLAMP2LAMPBstDNA（參見附錄B1A1）（B1A2）1.0μL（1A（1A2A.3）稱取2.0g100mL0.5×TBE（A.2）55℃后加入1加樣將LAMP5μL與μL6×LoadingBuffer2DNAMarker2000180V，電泳20minblaNDM1B和（B：圖1B泳道和。附錄A（規(guī)范性附錄）試劑的配制10×TBE三羥甲基氨基甲烷（Tris）108乙二胺四乙酸（Na2EDTA.2H2O） 7.44硼酸（Boricacid）55滅菌水1pH8.30.5×TBE取10×TBE緩沖液25mL，加滅菌水475mL，制成0.5×TBE的工作液。2瓊脂糖瓊脂糖 2.00.5×TBE緩沖液100mL附錄B（資料性附錄）LAMP反應(yīng)管陽性和陰性擴(kuò)增