血栓止血的實驗室檢應(yīng)用,郭輝課件

血栓止血的實驗室檢查及臨床意義

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科

郭輝

血管內(nèi)皮細胞的促凝和抗栓功能

一、血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)二、血管內(nèi)皮細胞的止血和促凝作用

三、血管內(nèi)皮細胞的抗凝（抗栓）功能二、血管內(nèi)皮細胞的止血和促凝作用（一）EC所產(chǎn)生的黏附蛋白和其他蛋白1．EC之間的黏附蛋白及其他在EC表面上的表達蛋白2．膠原

分泌多種膠原（ⅢⅣⅤ

Ⅷ型）3．彈性蛋白及微纖維（二）EC所產(chǎn)生的血管收縮物質(zhì)---內(nèi)皮素（三）EC所產(chǎn)生的聚集和激活血小板的物質(zhì)

1．ⅴWF2．血小板活化因子（PAF）是最強的血小板誘導(dǎo)劑

（四）EC的促凝作用1．產(chǎn)生組織因子2．因子V由EC合成，也可由肝合成，25%存在血小板α顆粒中，75%存在于血漿中。3．FIX及XEC能結(jié)合激活的Ⅸ和Ⅹ4．FⅫEC通過裂解蛋白激活FⅫ5．FⅩⅢ

維生素A能使EC的FⅩⅢ明顯增強6．HMWK結(jié)合在EC上的意義可使PK、FⅫ、FⅪ在局部聚集和激活7．Fg和FIB8．EC抑制纖溶9．EC與白細胞相互作用三

血管內(nèi)皮細胞的抗凝（抗栓）功能

（一）生成釋放使血管松弛的物質(zhì)1．前列腺環(huán)素（PGI2）2．內(nèi)皮衍生松弛因子（四）促進纖溶功能1．t-PA2．u-PA三

血小板的細胞器和內(nèi)含物1．致密顆粒（δ顆粒）：ADP、ATP、5-HT、Ca2+、Anti-AL、焦磷酸鹽。2．α-顆粒：PF4、β-TG、PDGF（促血小板生長因子）、通透因子、趨化因子、TSP、FN、Fg、FV、FⅢⅤ/WF、白蛋白。3．溶酶體顆粒（λ顆粒）：酸性水解酶、組織蛋白酶。4．血小板的特殊膜系統(tǒng)

即開放管道系統(tǒng)（OCS）和致密管道系統(tǒng)（DTS）。五血小板的生理功能（一）血小板的初期止血功能1．血小板黏附反應(yīng)GPIb2．血小板聚集反應(yīng)：依賴于GPIb/Ⅱa3．血小板的釋放反應(yīng)：弱作用：ADP\腎上腺素、血管加壓素、5-HT中等作用：TXA2、PAF，強作用：凝血酶、胰酶、膠原、A23187。（二）血小板的二期止血功能1．血小板具有“內(nèi)源性凝血因子”。纖維蛋白原5-25mg表面結(jié)合的2-10mg/ptc11

參與ADP誘導(dǎo)的血小板聚集細胞內(nèi)的3-7mg/ptc11

釋放后參與凝血酶誘導(dǎo)的聚集FV600mol/血小板

釋放后組成FXα的受體FⅧ/VWF10-28u/血小板

釋放后參與血小板聚集FⅪ1.6-6.1u/ptc11

參與接觸活化反應(yīng)FⅩⅢ

全血的50%提供血漿因子亞單位

2．血小板膜表面的磷脂促凝活性雙層不對稱磷脂層排列。膜表面磷脂層：鞘磷脂、磷脂酰膽堿（PC）。膜內(nèi)側(cè)磷脂層：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰死氨酸(PS)及磷脂酰肌醇(PI)3．膠原誘導(dǎo)的凝血活性與膜結(jié)合的血小板因子Ⅺ相關(guān)。4．其他促凝活性與止血功能：血小板可通過其表面所帶負電荷使FⅫ易被PK水解活化：α顆粒釋放PF4中和肝素保護凝血酶免受肝素破壞。

血

液

凝

固

一

凝血因子㈠纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)IB)或FI凝血中心蛋白質(zhì)即凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。大分子糖蛋白由肝細胞合成。除作為FI直接參與凝血外，還有與PGⅡb∕Ⅲa結(jié)合介導(dǎo)血小板聚集、參與動脈粥樣硬化、腫瘤血行轉(zhuǎn)移、影響血液黏稠度。2.0~4.0g∕L。㈣

凝血因子V(FV)，也稱為易變因子(labilefactor)或前加速因子(Proaccelerin)正常血漿中的一種糖蛋白，不穩(wěn)定，可作為Xa的輔因子，由肝臟合成，也可在巨核細胞和血小板а—顆粒中。㈤凝血因子Ⅶ（FVII）也稱穩(wěn)定因子(Stablefactor)或血清凝血酶原轉(zhuǎn)化加速因子(SPCA)，血清高于血漿，NP0.5~2.0mg∕L。為Vitk依賴因子在肝臟合成，主要是和組織因子形成復(fù)合物而激活FX而參與外源性凝血。㈥凝血因子Ⅷ和vWF因子

血友病(hemophilia)也稱FVIII或抗血友病球蛋白、抗血友病因子。FVIII的血漿含量為0.1mg∕L。為Ixa的輔因子參與對FX的激活。合成部位未定。㈦凝血因子IX（FIX血友）(hemophilia)或PTC或Chrismas因子。屬于維生素K依賴因子，其作用激活FX。在肝臟合成。㈩凝血因子XII(FXII)或Hageman因子。參與內(nèi)源性凝血接觸相。正常以酶原形式存在，同時還可激活纖溶、誘導(dǎo)中性粒細胞聚集和脫顆粒，以增強血管壁通透性。被C1.a—m.ATⅢ抑制，由肝臟合成。(十一)前激肽釋放酶(PK或fletcher因子)為血漿中的糖蛋白。參與內(nèi)源性凝血、激活纖溶、激肽生成。血漿中NP1.5~5mg∕L.(十二)高分子量激肽源(HMWK)為多功能蛋白可生成激肽。HMWK無蛋白水解活性。其缺乏不導(dǎo)致臨床出血。

(十三)凝血因子XIII(FXIII或FibrinSta-bilzingFactor)存在于血漿、血小板和單核細胞的一種糖蛋白。FXIII血漿NP25mg∕L。以酶原形式存在被凝血酶(Ca2+存在下)激活。三.纖維蛋白溶解系統(tǒng)（一）

纖溶系統(tǒng)成分1纖溶酶原（PLG）

又名血漿素原，在各種活化劑如t-Pau-PA作用下形成纖溶酶2纖溶酶

⑴對纖維蛋白原的降解作用⑵對纖維蛋白的降解作用⑶分解各種凝血因子Ⅱ.V.VII.X.VIII.XI也可分解血漿蛋白和補體。⑷其他作用

①裂解XIIa為XIIf②將谷氨酸纖溶酶原變?yōu)橘嚢彼崂w溶酶原

③降解基質(zhì)蛋白如NF、層素TS④激活某些前激素如前胰島素、人胎盤促乳素

⑤激活某些蛋白前酶如前膠原酶

⑥激活轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)⑦降解血小板糖蛋白GPIb.GPⅡb∕Ⅲa和膜上纖維蛋白原及vWF受體

⑧將單鏈t-PA(sct-PA)、單鏈u-PA(sct-PA)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈t-PA(sct-PA)、和雙鏈t-PA(sct-PA).

3.組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)又名血管纖溶酶原活化劑(v-PA)

其主要功能將纖溶酶原精561-纈562處的肽鏈裂解成形成具有活性的纖溶酶，其次t-PA能與纖維連結(jié)蛋白(FN)結(jié)合。4.尿激酶型纖溶酶原活化劑(t-PA)主要來自泌尿生殖器的上皮細胞。其主要功能同t-PA并有協(xié)同作用。

6．α2-纖溶酶抑制物(α2-PI)主要功能抑制纖溶酶，也抑制胰蛋白酶，PK及

其他絲氨酸蛋白酶。α2-PI與纖維蛋白結(jié)合并與纖溶酶形成復(fù)合物。7．富（含）組氨酸糖蛋白(HRG)由肝臟產(chǎn)生對纖溶調(diào)節(jié)有雙重性，對凝血與纖原結(jié)合阻止纖維蛋白形成并可與激活的血小板結(jié)合調(diào)節(jié)血小板的凝血與纖溶。8．α-巨球蛋白(α-M)由肝細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，是一種糖蛋白。是一種廣譜的蛋白酶抑制物，能與PL.tcu-PA.t-PA.PK結(jié)合在抑制纖溶中起“二線”的作用。

9．補體T抑制物(Ci-INH)屬于絲氨酸蛋白酶抑制物家族。主要作用是抑制激活補體第一亞成分FXIIIa.FXIa.PK.PL。

抗

凝

機

制

一．抗凝血酶-Ⅲ(AT--Ⅲ):為生理性重要抗凝物質(zhì)，可滅活凝血酶70~80%，還可抑制Xa.Ixa.Xia.XIIa以及纖溶物、胰蛋白酶、激肽釋放酶。除肝臟外其他臟器如肺、脾、心、腸、腦也有合成AT-III能力，血管內(nèi)皮細胞和巨核細胞也合成AT-III.AT-III抗原正常血漿水平為80~300mg∕L，活性為70%~130%。AT-III缺乏是發(fā)生靜脈血栓和肺栓塞常見原因。

二．蛋白C系統(tǒng)1．蛋白C(PC)由肝臟合成，依賴維生素K。PC可被凝血酶、胰蛋白酶、蝰蛇毒及高濃度Va激活。PC通過蛋白水解滅活Va.VIIIa，需磷脂和CaPC阻礙FXa與血小板結(jié)合。PC促進纖溶：APC刺激內(nèi)皮釋放t-PA并滅活PAI。2．血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)與凝血酶結(jié)合抑制后者對FV及血小板的激活。

3．蛋白S(PS)

單鏈糖蛋白

肝臟依賴于Vitk，加速apc對Va的滅活，喪失結(jié)合Xa的能力，從而中斷血液凝固的“瀑布”

與輔體結(jié)合C4bP又失去抗凝活性。遺傳性PS缺乏可致血栓性疾病4．APC自血循環(huán)中被清除⑴蛋白C抑制物(PCI):肝素可使其加速。先天性PCI缺乏臨床類似于FV.VIII聯(lián)合缺乏出血嚴重。⑵α1抗胰蛋白酶(α1-AT)在沒有肝素的情況下(α1-AT)對APC的抑制作用強于PCI。5．APC耐受（抵抗）(APCresistance)亦稱FVLeiden，由于點突變使FV506位精氨酸被谷氨酸置換，而這一位點是FV被APC裂解點之一，F(xiàn)V失去調(diào)控，使凝血活性增高易于發(fā)生血栓,不僅發(fā)生靜脈血栓也可發(fā)生動脈血栓。三

組織因子途徑抑制物（TEPI）TF∕VIIa復(fù)合物增強凝血活性1000倍。TEPI針對TF∕VIIa的主要調(diào)節(jié)物，TEPI與Xa1:1抑制。四

其他抗凝物質(zhì)1．肝素：一種酸性粘多糖，由腸黏膜肥大細胞合成。加速AT-III,HC-II作用。2．肝素輔因子(HC-II)抑制凝血酶，靡蛋白酶，作用相當(dāng)1∕3AT-III。3．a(chǎn)2-巨球蛋白(a2-MG),a2-MG與Ci抑制物共同抑制90%PK活力。其中a2-MG占35~50%。4．α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)5．Ci抑制物：補體脂酶抑制物。能滅活已激活的補體Cir.CIs及內(nèi)源性FXIIa.XIa和PK對PLt-PA也有滅活作用。6．蛋白酶連結(jié)素I(ProteasenexinI)抑制血小板的進一步活化或凝血激活。

止凝血疾病的實驗室檢查一．血管及支撐組織異常所致的出血性疾病的實驗室檢查一般項目⑴毛細血管脆性

血管脆性、通透性⑵出血時間

血管收縮能力并內(nèi)皮細胞和血小板反應(yīng)能力⑶APC耐量

血管壁合成PGI2能力PGI2-TXA2平衡狀態(tài)血管壁結(jié)構(gòu)

⑴甲皺毛細血管鏡

形態(tài)數(shù)量結(jié)構(gòu)狀態(tài)及對刺激反應(yīng)

⑵內(nèi)鏡檢查

局部血管及血流狀態(tài)⑶病理學(xué)檢查

顯微超微及免疫組化結(jié)構(gòu)血管內(nèi)皮功能vWF測定a.抗原性vWF抗原含量

b.多聚體vWF結(jié)構(gòu)c.交叉免疫電泳vWF多聚化程度d.vWF瑞斯托霉素vWF功能輔因子(VW:RCOF)抗原e.TM抗原、活性及分子數(shù)

內(nèi)皮合成TM功能質(zhì)量f.6-K-PGFa抗原

內(nèi)皮合成PGI2能力g.內(nèi)皮素測定

內(nèi)皮合成釋放EC能力二.血小板量與質(zhì)異常所致出血性疾病實驗室檢查

㈠

與血小板數(shù)量相關(guān)的實驗室檢查一般項目

⑴毛細血管脆性

血小板數(shù)量或質(zhì)量

⑵出血時間

⑶血塊收縮

血小板數(shù)量⑴血小板計數(shù)⑵外周血巨核細胞測定

巨核細胞數(shù)量(二）血小板形態(tài)及生成

⑴外周血小板觀察

數(shù)量形態(tài)大小超縮結(jié)構(gòu)⑵骨髓涂片及病理

數(shù)量形態(tài)大小超縮結(jié)構(gòu)⑶血小板平均體積

大小年齡代謝狀態(tài)

⑷血小板抗體(PAIg)

免疫破壞情況⑸血小板生存時間

生成及代謝速率㈢血小板功能的實驗室檢查黏附功能

⑴

玻球法黏附

血小板黏附功能⑵玻柱法黏附

血小板黏附功能聚集功能

⑴常用誘導(dǎo)劑法(膠原ADP、腎上腺素,5-HT)⑵特殊誘導(dǎo)劑

（瑞斯托霉素、PAF血小板激活因子、刺參粘多糖

血小板聚集能力釋放功能

⑴釋放實驗血小板含量及釋放能力⑵血小板含量5-HT含量⑶血小板β-TG測定⑷PF4測定⑸血小板凝血酶敏感蛋白(TSP)⑹血小板顆粒膜蛋白(GMP-140)凝血功能

⑴有效性測定㈣

血小板活化及代謝產(chǎn)物的實驗室檢查⑴血栓烷B2(TXB2)的測定⑵丙二醛(MDA)測定⑶12羥17碳三烯酸(HHT)與12羥20碳四烯酸(12-HETE)代謝AA代謝⑷白三烯B4(LTB4)測定⑸血小板環(huán)腺苷酸測定(CAMP)㈤血小板膜糖蛋白(GP)測定如GPIb、GPIIb、GPIIIb、GPⅨ、GPV、GP140、GPIb-IX復(fù)合物、GPIIb∕Ⅲa復(fù)合物。

三

凝血因子所致出血性疾病實驗室檢查㈠凝血第一階段的實驗室檢查⑴內(nèi)源性：①凝血酶原消耗實驗(PCT);②活化部分凝血活酶時間(ATPP);③凝血活酶生成及糾正;④VIII.IX.XI抗原及活性測定;⑤FX活性測定。⑵外源性：①組織旁路抑制物（主要用于血栓）;②FVII活性③RVVT活性;④FX活性㈡凝血第二階段的實驗室檢查⑴PT及糾正⑵FII.V活性及抗原性及凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(TIT)，凝血酶原碎片1+2(F1+2)測定；⑶異常凝血酶原測定㈢凝血第三階段的實驗室檢查⑴纖維蛋白原定量測定⑵纖維蛋白原早期降解產(chǎn)物纖維蛋白肽A.B(FPA.B);⑶異常纖維蛋白原測定;⑷纖維蛋白（原）單體測定；血小板β-TG含量及釋放能力血小板PF4含量及活化程度血小板TSP含量及活化程度血小板活化程度血小板凝血活性⑸纖維蛋白原轉(zhuǎn)換率測定⑹因子XIII及其亞單位活性及抗原性測定

㈣凝血全過程異常的實驗室檢查⑴凝血時間(CT)⑵復(fù)鈣時間(RT)㈤纖溶亢進所致出血性疾病實驗室檢查⑴纖溶活性異常的實驗室檢查①優(yōu)球蛋白溶解時間②t-PA活性及抗原③PLG測定④纖溶活性及抗原性測定⑵纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物(FDP)檢測①凝血酶時間(TT)②3P實驗③乙醇膠(EGPT)④FDP測定⑤D-Dimer二聚體測定⑥纖維蛋白肽Bβ~42及Bβ15~42的測定⑶纖溶抑制物異常的實驗室檢查①PAI活性及抗原測定②a2活性及抗原測定⑷激肽系統(tǒng)活性異常的實驗室檢查①PKA(激肽釋放酶原活性)②PK(激肽釋放酶原活性)③組織激肽釋放酶測定四.病理性循環(huán)抗凝物質(zhì)所致出血性疾病實驗室檢查㈠生理性：①AT-III活性；②肝素輔因子II活性測定；③蛋白C(PC)及其活性測定；④活化蛋白C抗性（耐受）(APCR)測定；⑤蛋白S抗原測定；⑥a2-MG抗原測定；⑦a2-AT測定；⑧血漿肝素測定。㈡病理性：①交叉復(fù)鈣時間；②肝素及肝素樣物質(zhì)測定（TT及甲苯胺三糾正實驗、血漿肝素定量實驗、蝰蛇毒時間（肝素鑒別實驗）；③FVIII抗體測定④LAC測定；出血性疾病的診斷血栓性疾病、易栓癥、抗凝溶栓治療一

血栓形成的部位和發(fā)生率血栓性栓塞我國40歲以上人群中心梗39.7~64.0∕10萬，腦卒中發(fā)生率109.7∕10萬。1182腦卒中經(jīng)CT證實73.5%為腦梗死者。靜脈血栓高于動脈血栓為4:1，靜脈血栓可發(fā)生在下肢、肝臟、盆腔陰道旁組織的靜脈中，下肢盆腔占90%，上肢4%，2~4%為臟器內(nèi)靜脈。

二.血栓的種類㈠血小板血栓㈡白色血栓㈢紅色血栓㈣混合血栓㈤微血栓㈥感染性血栓三.血栓形成的機制㈠血管因素㈡血小板因素㈢白細胞、紅細胞因素；㈣凝血因子因素

㈤抗凝因子因素1:ATIII.HC-II.PC.PS.LAC;㈥纖溶因素：1.異常纖溶酶原血癥2.纖溶酶原活化劑釋放缺陷3.纖溶酶原活化物抑制物過多。四.血栓性疾病的血液學(xué)診斷㈠內(nèi)皮素I(endothelin-ET-1)檢測㈡凝血酶調(diào)節(jié)蛋白檢測(TM)㈢血小板激活后標志物檢測㈣凝血因子活性及抗原性測定㈤血漿抗凝系統(tǒng)檢測，尤其是對家族遺傳性血栓；㈥纖維蛋白分子標志物檢測㈦纖溶活性指標檢測五.易栓癥㈠遺傳性抗凝血酶-III缺陷癥:常染色體顯性遺傳。主要為靜脈血栓形成。I型為ATIII功能與抗原水平平行下降。II型為ATIII抗原水平正常，呈現(xiàn)不同的功能缺陷又分為II-RS型、II-HRS型和II-PE型3個亞型。

⑴II-RS型：反應(yīng)點功能異常：⑵II-HRS型：肝素結(jié)合位點功能異常；⑶II-PE型：多分子功能缺陷，包括對凝血酶、FXa的滅活下降，對肝素的親和力下降等。㈡遺傳性蛋白C缺陷癥為常染色體顯性遺傳，分為純合子型和雜合子型。其缺陷多形成靜脈血栓。I型：PC活性含量平行下降；II型：PC含量正常，活性明顯低下㈢遺傳性蛋白S缺陷癥為常染色體顯性遺傳，分為純合子型和雜合子型。I型：游離PS含量

總量

活性均下降；II型：游離PS含量，總量正常

活性均下降III型：游離PS含量，總量正常

活性下降㈣活化蛋白C輔因子-II缺陷癥為常染色體顯性遺傳,即APC抵抗(耐受)不能滅活FVa.VIIIa。㈤遺傳性肝素輔因子-Ⅱ缺陷癥為常染色體顯性遺傳，多形成靜脈血栓。㈥先天性異常纖溶酶原血癥為常染色體顯性遺傳，病人年齡較輕，多形成深部靜脈血栓，肺栓塞等。

㈦纖溶酶原活化物抑制物過多為常染色體顯性遺傳，靜脈血栓形成，PAI↑而t-PA↓㈧異常纖維蛋白原血癥為常染色體顯性遺傳。㈨家族性富含組氨酸糖蛋白增多癥。為常染色體顯性遺傳，多發(fā)生動脈血栓，如心梗、頸動脈血栓、腦梗等。㈩遺傳性高同型半胱氨酸血癥為常染色體隱性遺傳，，以動脈硬化和動脈血栓為主。

六抗凝溶栓治療的實驗室檢測臨床上常用抗凝藥、溶栓藥、抗血小板藥和去纖藥為預(yù)防血栓形成（防栓）和溶解已形成的血栓（溶栓）的藥物，這些療法統(tǒng)稱為抗栓治療，藥物過量便會造成出血并發(fā)癥，用量不足則達不到預(yù)期效果。因此在應(yīng)用這些藥物的過程中，必須區(qū)別不同的情況選擇相應(yīng)的指標作為實驗室監(jiān)測，指導(dǎo)和調(diào)整臨床合理用藥，使藥物既能達到防治血栓形成，又不至于引起出血并發(fā)癥是非常必要的。七抗凝治療

抗凝治療的目的在于降低凝血因子的血漿濃度或阻止凝血因子的激活，降低血液的凝固性或高凝狀態(tài)，以預(yù)防血栓的形成或阻止血栓的發(fā)展。

㈠普通肝素治療的監(jiān)測1．血漿肝素濃度2．APTT(活化的部分凝血活酶時間)為正常值1.5~2.0倍為佳3.ACT(活化凝血時間)在體外循環(huán)和血液透析過程中監(jiān)測（肝素量較大＞10U/ml），ACT在480~600s為宜，應(yīng)用硫酸魚精蛋白可中和至正常80~120S。4.AT-III：A（抗凝血酶III）不低于正常值為80~120%時肝素治療有效，當(dāng)AT-III：A＜70%肝素療效減低，＜50%時肝素幾乎失去抗凝作用，肝素治療過程中，務(wù)必使AT-III：A維持在正常水平。㈡低分子量肝素（LMW-H）的檢測