分子生物學(xué)技術(shù)第五章 核酸擴(kuò)增技術(shù)

2022/11/61核酸擴(kuò)增技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)?第五章2022/11/62主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第二節(jié)熒光定量PCR技術(shù)第三節(jié)其他核酸擴(kuò)增技術(shù)第四節(jié)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理與質(zhì)量控制2022/11/63

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。由于通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬(wàn)倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測(cè)的靈敏度，理論上其檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到一個(gè)細(xì)胞、甚至一個(gè)分子的水平。

第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)2022/11/64一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理Watson、Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Meselson、Stahl:半保留復(fù)制模型。Khorana：最早提出體外擴(kuò)增核酸的設(shè)想Kary.B.Mullis：發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)Saiki：發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶（一）PCR技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史2022/11/65KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎(jiǎng)，Mullis是其中之一2022/11/66KaryB.Mullis（1944－）2022/11/67Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來(lái)的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA，……2022/11/68引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年2022/11/6994℃55℃37℃2022/11/61094℃變性50-65℃退火XX℃延伸2022/11/611Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來(lái)解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。2022/11/612PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營(yíng)中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。2022/11/613生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無(wú)處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測(cè)定基因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測(cè)，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-timePCR）/基因表達(dá)譜研究（DNAchip,SAGE）2022/11/614PCR儀器的變遷三個(gè)水浴鍋，用手移動(dòng)（Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊＋自來(lái)水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個(gè)加熱塊＋機(jī)械手（Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(cè)(如Roche的Lightcycler)風(fēng)加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國(guó)的狀況1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）2022/11/615PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，由變性——退火——延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

（二）PCR技術(shù)基本原理2022/11/616PCR循環(huán)–

第一步–加熱變性2022/11/617PCR循環(huán)-

第二步–引物與模板DNA分子退火Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’2022/11/618PCR循環(huán)-

第三步-引物延伸Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase2022/11/619第1個(gè)PCR循環(huán)完成后

－－得到兩個(gè)拷貝的靶序列2022/11/62030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量循環(huán)數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,8242022/11/621模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7PCR原理示意圖2022/11/6221234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/11/623PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃2022/11/624PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃55℃引物1引物2DNA引物2022/11/625PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)55℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2022/11/626PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開始2022/11/627PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)94℃55℃72℃TaqTaqTaqTaq2022/11/628PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束2022/11/629PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增2022/11/630在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴(kuò)增效率為100%)。如此反復(fù)循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2022/11/631nyny圖6-2-1

圖6-2-2PCR擴(kuò)增效率圖（三）PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

到達(dá)平臺(tái)期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。2022/11/632反應(yīng)組成（五要素）：模板（template）引物（primer）DNA聚合酶（DNApolymerase）dNTPPCRbuffer

二、PCR反應(yīng)體系及其優(yōu)化（一）PCR反應(yīng)動(dòng)體系2022/11/6331.模板（template）DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA模板就是待擴(kuò)增的目的基因或其特異片段（靶序列）2022/11/634預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異。偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。量：0.1-0.5umol/L2.引物（primers)引物（primers）是人工合成的一對(duì)可以分別與兩條模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸序列2022/11/635引物設(shè)計(jì)要求：引物長(zhǎng)度分布的均衡性引物二聚體及二級(jí)結(jié)構(gòu)引物3’端、5’端的特異性引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的特異性擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)2022/11/636引物的長(zhǎng)度：15～30核苷酸，引物過短會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性，引物過長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，增加退火難度。引物的均衡性：引物中堿基組成應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，兩條引物應(yīng)該有匹配的GC含量，G﹢C含量一般40%~60%。引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)：應(yīng)避免由于引物分子之間存在較多的互補(bǔ)堿基而形成引物二聚體。

引物設(shè)計(jì)原則2022/11/637引物的末端：引物的延伸從3′端開始，因此3′端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸。引物的5′末端堿基無(wú)嚴(yán)格限制，5′末端可以被修飾。

引物的特異性：引物與非目的基因序列的同源性不超過70%，3′末端不要有連續(xù)8個(gè)堿基與非目的基因序列同源。

2022/11/638量：0.5-5u/100ul

偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量降低特性：(耐高熱)熱穩(wěn)定性:92.5℃、95℃、97.5℃時(shí)，半衰期分別為130min、40min、5-6min延伸效率:75-80℃時(shí)，150個(gè)核苷酸/s校正功能:TaqDNA聚合酶沒有3’-5’外切酶活性，

Vent、pfu等具有3’-5’外切酶活性3.DNA聚合酶(DNApolymerase)2022/11/639

dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：50-200umol/L過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和室驗(yàn)成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性

dNTP會(huì)絡(luò)合Mg2+，當(dāng)PCR需要較高濃度的dNTP時(shí)，應(yīng)在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加Mg2+濃度。。4.dNTP2022/11/640一般組成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室溫pH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl促進(jìn)引物退火，濃度過高抑制TaqDNA聚合酶的活性。Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH，使反應(yīng)體系偏堿性，發(fā)揮TaqDNA聚合酶活性。Mg2+濃度：影響TaqDNA聚合酶活性Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

PCR促進(jìn)劑：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）5.PCR緩沖液（PCRbuffer）2022/11/64150ulPCR反應(yīng)體系的組成①樣品DNA0.1～1ug；②正鏈引物（25umol/L）1.0ul；③負(fù)鏈引物（25umol/L）1.0ul；④脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；⑤10×PCR緩沖液5.0ul；⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul；⑦TaqDNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照分別以陽(yáng)性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。6.PCR一般方案2022/11/642PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置

94℃30～60sec，

55℃30～60sec，

72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物的保存與檢測(cè)

PCR產(chǎn)物于4℃保存，PCR產(chǎn)物檢測(cè)。2022/11/643模板引物緩沖液Mg2+三磷酸脫氧核苷酸耐熱DNA聚合酶溫度循環(huán)參數(shù)變性、復(fù)性、延伸的溫度與時(shí)間循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增效率：循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增程度。（二）PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化2022/11/644起始模板數(shù)量與足量產(chǎn)物的熱循環(huán)次數(shù)起始模板DNA分子數(shù)循環(huán)次數(shù)5040-451.0×10335-401.5×10430-353.0×105

25-302022/11/645剃度PCR（TDPCR

Touch-downPCR）

根據(jù)引物Tm值，選定一個(gè)退火溫度范圍（跨越10~20℃的溫度范圍，引物Tm值在這個(gè)范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時(shí)，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1~5℃），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個(gè)退火溫度上循環(huán)2~5次。熱啟動(dòng)PCR（hotstartPCR）由于TaqDNA聚合酶在低溫時(shí)仍有一定的聚合酶活性，第一輪PCR反應(yīng)前的升溫過程中會(huì)出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，而降低了PCR反應(yīng)的特異性?？梢酝ㄟ^所謂的“熱啟動(dòng)”方式克服這一問題。兩種優(yōu)化參數(shù)的PCR技術(shù)2022/11/646(一)

凝膠電泳

1．瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電操作方法簡(jiǎn)單，能對(duì)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行粗略的鑒定，是應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)PCR產(chǎn)物的方法。在電泳過程中，凝膠中的溴化乙錠(EB)嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復(fù)合物發(fā)出橙紅色熒光。該法缺點(diǎn)是不能鑒定PCR產(chǎn)物的序列，而且存在溴乙錠污染。

三、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與分析PCR產(chǎn)物是否為目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，還是非特異擴(kuò)增？2022/11/647

瓊脂糖濃度與分離線狀DNA的有效范圍瓊脂糖含量(%)分離線狀DNA的有效范圍(kb)

0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-22022/11/6482．聚丙烯酰胺凝膠電泳法特點(diǎn)：分辨力高，長(zhǎng)度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2022/11/649

丙烯酰胺濃度與分離DNA分子的有效范圍丙烯酰胺(%)

有效分離范圍(bp)溴酚藍(lán)位置(bp)二甲苯藍(lán)位置(bp)3.51000-20001004605.080-500652608.060-4004510012.040-200207015.025-150156020.05-10012452022/11/650不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有特異的DNA識(shí)別序列，突變堿基的出現(xiàn)有可能會(huì)改變限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，使切點(diǎn)增多或減少，導(dǎo)致酶切片段的數(shù)量或大小發(fā)生改變。

PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）（二）PCR產(chǎn)物的酶切分析2022/11/651PCR-RFLP法：

惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因限制性內(nèi)切酶突變限制性內(nèi)切酶2022/11/6521．點(diǎn)雜交（dotblot）2．反向點(diǎn)雜交（reversedotblot）3．微孔板雜交（microplatehybridization）4．PCR-EIA：（RNAprobehybridizationenzymeimmunoassay,RPEIA）5．Southern印跡雜交（Southernblot）（三）核酸探針雜交分析2022/11/6531．假陽(yáng)性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。③陽(yáng)性對(duì)照的污染。④標(biāo)本之間的交叉污染。⑤在采集標(biāo)本時(shí)，其他污染源帶來(lái)的污染。⑥Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA，當(dāng)PCR擴(kuò)增片段為保守的rRNA序列時(shí)，易造成假陽(yáng)性。四、常見問題原因分析與處理2022/11/6542．假陰性(1)標(biāo)本處理的原因①處理標(biāo)本時(shí)，靶DNA丟失。②處理標(biāo)本時(shí)，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。③標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。2022/11/655(2)PCR試劑問題

①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+濃度過低或是沒有加。(3)PCR擴(kuò)增過程中的問題①PCR擴(kuò)增儀故障。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。(4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時(shí)沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。2022/11/6563．引物二聚體⑴兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)。⑵引物模板比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。2022/11/6574．非特異性PCR產(chǎn)物造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因提高PCR反應(yīng)特異性的辦法

5．PCR污染及預(yù)防措施標(biāo)本、操作人員、實(shí)驗(yàn)室的一切試劑、器材及儀器

6．RNA酶的污染與預(yù)防（RT-PCR）（1）去除外源RNase污染（2）抑制內(nèi)源性RNase的活性2022/11/658巢式PCR（nestedPCR）

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）

多重PCR（multiplexPCR）重組PCR（recombinantPCR）

錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)定量PCR

五、PCR衍生技術(shù)2022/11/659巢式PCR外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR2022/11/660逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增2022/11/661用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物多重PCRPCR產(chǎn)物2022/11/662引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復(fù)性延伸異源部分雙鏈DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d

再次PCR5'5'3'3'重組PCR2022/11/663Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復(fù)合物DNA-連接分子復(fù)合物連接分子檢測(cè)PCR＋Ag-Ab-連接分子-DNA-復(fù)合物免疫PCR2022/11/664原位PCR（insituPCR）原位PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物?；具^程是，先用合適的固定劑（通常為甲醛固定劑如中性甲醛）對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以確保PCR試劑進(jìn)入細(xì)胞并同靶序列接觸，最后對(duì)DNA和RNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位擴(kuò)增。然后進(jìn)行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結(jié)果。2022/11/665定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）廣義概念上的定量PCR是指通過對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測(cè)，對(duì)PCR起始模板進(jìn)行定量的技術(shù)。指數(shù)擴(kuò)增期2022/11/666第二節(jié)熒光定量PCR技術(shù)2022/11/667實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法2022/11/668常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析2022/11/6692022/11/670定量原理介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析2022/11/671擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件2022/11/6722022/11/673熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。2022/11/674Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value2022/11/675實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量2022/11/676確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理絕對(duì)定量252022/11/677熒光定量PCR（FQ-PCR）基于熒光能量傳遞技術(shù)（FluorescenceresonanceenergytransferFRET）,通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán),轉(zhuǎn)移效率與兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號(hào)強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測(cè)PCR過程的熒光訊號(hào)便可得知靶序列初始濃度。在PCR反應(yīng)體系中，F(xiàn)Q-PCR的熒光標(biāo)記物可分為兩種：熒光染料標(biāo)記和熒光探針標(biāo)記。2022/11/678一、熒光染料法SYBR熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)出任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法未使用目的特異性探針，其特異性完全由引物決定。在有非特異雙鏈DNA產(chǎn)生時(shí)，其熒光也同樣增強(qiáng)，此法與常規(guī)PCR的特異性差別不大。2022/11/679SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen2022/11/680圖6-10SYBR-GreenI熒光染料原理示意圖5’3’激發(fā)5’3’SG發(fā)射SGSGSGSG5’3’5’3’激發(fā)SGSGSG發(fā)射SGSG不摻入雙鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)出任何熒光信號(hào)SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈,發(fā)出熒光信號(hào)2022/11/681SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

---不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點(diǎn)

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性,但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)引物特異性要求較高缺點(diǎn)2022/11/6821．Taqman技術(shù)

二、熒光探針法與目標(biāo)序列互補(bǔ)5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無(wú)熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針2022/11/683TaqMan技術(shù)原理示意圖3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號(hào)

探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來(lái)

熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例5’3’5’3’QRQ5’3’R5’3’激發(fā)5’3’5’3’激發(fā)RQ引物Taq酶2022/11/684TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)目標(biāo)序列的高特異性

----陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單

---與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點(diǎn)

只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)2022/11/685在Taqman探針的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了一系列的技術(shù)進(jìn)展。雙探針技術(shù)的特點(diǎn)是將熒光分子和淬滅分子分別標(biāo)記在兩個(gè)不同的探針上，產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針。雜交時(shí)兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發(fā)生FRET使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成正比，以此可進(jìn)行PCR定量分析。最近廣泛應(yīng)用的另外一個(gè)新技術(shù)就是TaqMan-小溝結(jié)合物（minorgroovebinder，MGB）探針。

Taqman技術(shù)的延伸2022/11/686雙探針技術(shù)原理示意圖熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比RQXQ淬滅探針R發(fā)光探針2022/11/687TaqMan-MGB探針示意圖MGB:MinorGrooveBinder(Tmenhancer)MGBQRMGB探針的3‘端采用了非熒光性的淬滅基因——淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾。MGB探針的3‘端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm值——而短探針的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低。2022/11/688亦稱分子燈塔法，是一段熒光標(biāo)記的單鏈寡核苷酸探針，其鏈由兩部分組成，一部分是能與靶基因堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列，是檢測(cè)靶基因的部分，位于探針的中間位置，探針形成后構(gòu)成探針的環(huán)部，另一部分是分別在5′和3′端的熒光標(biāo)記物質(zhì)和熒光淬滅劑。5′和3′端有幾個(gè)互補(bǔ)的堿基存在，因而可形成兩端反轉(zhuǎn)配對(duì)，構(gòu)成探針的莖部。在游離狀態(tài)下，分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導(dǎo)致熒光淬滅，此時(shí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子燈塔發(fā)出的熒光檢測(cè)不到。2．Molecularbeacon技術(shù)2022/11/689RQX激發(fā)RQQR激發(fā)發(fā)射分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導(dǎo)致熒光淬滅單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補(bǔ)而與之雜交探針5’和3’端分離,淬滅劑對(duì)熒光劑的淬滅作用消失,產(chǎn)生熒光Molecularbeacon技術(shù)原理示意圖2022/11/690該法的基本原理是首先合成兩個(gè)探針，一是熒光探針（25bp），5′端接一熒光分子，另一為淬滅探針（15bp），3′端接一淬滅分子，淬滅探針能與熒光探針5′端雜交。當(dāng)兩探針結(jié)合時(shí)，熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸收，溶液中沒有熒光產(chǎn)生，但兩探針分離時(shí)，熒光探針發(fā)出的熒光不再被淬滅探針吸收，溶液中即可檢測(cè)到熒光。當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)溶液中無(wú)模板時(shí)，兩種探針特異性結(jié)合，溶液中無(wú)熒光產(chǎn)生；當(dāng)溶液中有模板時(shí)，在較高溫度下熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合，從而使兩探針分離產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與溶液中模板數(shù)量成正比，因此，可進(jìn)行PCR定量。3．復(fù)合探針法2022/11/691Q淬滅

XQ淬滅探針R發(fā)光探針RR復(fù)合探針法原理示意圖2022/11/692四、FQ-PCR的應(yīng)用前景三、FQ-PCR測(cè)定的數(shù)據(jù)處理2022/11/693第三節(jié)、其他核酸擴(kuò)增技術(shù)（一）核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）核酸序列依賴性擴(kuò)增，又稱自主序列復(fù)制（self-sustainedsequencereplication，SSR），主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序。反應(yīng)體系包括：逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶H（RNaseH）、T7RNA聚