PCR技術(shù)教程學(xué)習(xí)教案課件

會(huì)計(jì)學(xué)1PCR技術(shù)教程會(huì)計(jì)學(xué)1PCR技術(shù)教程一、PCR技術(shù)二、定量PCR技術(shù)三、數(shù)字PCR技術(shù)第1頁(yè)/共71頁(yè)一、PCR技術(shù)二、定量PCR技術(shù)三、數(shù)字PCR技術(shù)第1頁(yè)/共一、PCR原理PolymeraseChainReaction(PCR)：在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。1、歷史

1971年，Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。

1985年Cetus公司科學(xué)家使設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)，采用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37℃），并獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1988年R.K.Saiki應(yīng)用Taq

DNA聚合酶（水生棲熱菌）

于PCR反應(yīng)；同年，Cetus公司發(fā)明自動(dòng)熱循環(huán)儀。第2頁(yè)/共71頁(yè)一、PCR原理PolymeraseChainReacti2、原理預(yù)變性－變性－退火－延伸－保存循環(huán)（30次）95℃預(yù)變性1min95℃變性1min目的：DNA雙鏈成單鏈56℃

退火目的：引物先與模板匹配72℃延伸1-2

min目的：聚合酶在引物3’端加核苷酸，合成新鏈12℃保存循環(huán)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便第3頁(yè)/共71頁(yè)2、原理預(yù)變性－變性－退火－延伸－保存循環(huán)（30次）95℃循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201048576301073741824第4頁(yè)/共71頁(yè)循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201048576301073

1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，無3’→5’外切酶活性，不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)，因此必須測(cè)序。需激活劑：Mg2+

2、pfuDNA聚合酶：有5’→3’和3’→5外切酶活性，出錯(cuò)率最低，但

PCR產(chǎn)物平端。

3、TaqPlusDNA聚合酶：是Taq和pfu的混合物，TaqPCR產(chǎn)物3’端帶－

A。

4、引物：互補(bǔ)；引物長(zhǎng)度；3’堿基序列必須與模板配對(duì)；盡量提高

GC含量；避免連續(xù)相同堿基排列或開成回紋結(jié)構(gòu)；避免形成引物二聚體。

5、Tm=(G+C)×4+(A+C)×2

6、primer5.0

7、模板純度：不一定要純，但要確定不含蛋白變性劑、DNA酶、

Mg2+螯合劑等。模板量（100ng/100μl）

8、dNTP濃度

2.5

mM

each特殊說明：第5頁(yè)/共71頁(yè)1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，無3’→5普通PCRRT-PCRTAIL-PCR

Real-time

PCR數(shù)字PCRPCR類型：第6頁(yè)/共71頁(yè)普通PCRPCR類型：第6頁(yè)/共71頁(yè)普通PCR儀梯度PCR儀原位PCR儀定量PCR儀數(shù)字PCR儀第7頁(yè)/共71頁(yè)普通PCR儀梯度PCR儀原位PCR儀定量PCR儀數(shù)字PCR儀二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timequantification

PCR）1、歷史實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied

Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它的特異性更強(qiáng)、更能有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度更高等特點(diǎn)。第8頁(yè)/共71頁(yè)二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timequantifi第9頁(yè)/共71頁(yè)第9頁(yè)/共71頁(yè)原理：在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如

SYBR

GREEN1）或特異性的熒光探針（如Taqman探針），利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過程，再

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因?qū)ξ粗蜻M(jìn)行定量分析的方法。也就是通過熒光的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定熒光信號(hào)（閾值）所需要的循環(huán)次數(shù)Ct（CycleThreshold）。

Ct值的含義：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。第10頁(yè)/共71頁(yè)原理：在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如第10頁(yè)/1、熒光探針和熒光染料：分別用探針或熒光染料與特異序列結(jié)合來指示擴(kuò)增產(chǎn)物，前者特異性高，后者操作簡(jiǎn)單。SYBR

GREEN1：結(jié)合雙鏈DNA小溝后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但也會(huì)結(jié)合引物二聚體或單鏈引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)。變性時(shí)，雙鏈分開，熒光消失。特別說明：TaqMan探針：寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在5’端，淬滅基因連在3’端。5’端熒光基團(tuán)吸收能量后轉(zhuǎn)移給臨近的3’端淬滅基團(tuán)，發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），只要探針完整，能量就會(huì)被淬滅。第11頁(yè)/共71頁(yè)1、熒光探針和熒光染料：SYBRGREEN1：結(jié)合雙鏈D熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)時(shí)反映DNA的擴(kuò)增；靈敏度極高，用于準(zhǔn)確定量初始模板數(shù)量；既能用于定性，判斷一段DNA序列的有無，也可用于定量，確定起始DNA拷貝數(shù)。第12頁(yè)/共71頁(yè)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)時(shí)反映DNA的擴(kuò)增；第一對(duì)引物引物之間一條寡核苷酸，即探針報(bào)告基因與淬滅基團(tuán)完整探針，不發(fā)光；水解后，發(fā)光。FRET第13頁(yè)/共71頁(yè)一對(duì)引物引物之間一條寡核苷酸，即探針報(bào)告基因與淬滅基團(tuán)完整探變性（95℃）退火（60℃）第14頁(yè)/共71頁(yè)變性（95℃）退火（60℃）第14頁(yè)/共71頁(yè)DNA聚合酶第15頁(yè)/共71頁(yè)DNA聚合酶第15頁(yè)/共71頁(yè)5’→3’外切酶活性；可將探針5’端的熒光基團(tuán)切割下來。第16頁(yè)/共71頁(yè)5’→3’外切酶活性；可將探針5’端的熒光基團(tuán)切割下來。第1熒光基團(tuán)游離下來后發(fā)光了！第17頁(yè)/共71頁(yè)熒光基團(tuán)游離下來后發(fā)光了！第17頁(yè)/共71頁(yè)第18頁(yè)/共71頁(yè)第18頁(yè)/共71頁(yè)因?yàn)樘结樖峭耆c目的基因互補(bǔ)，當(dāng)它被水解后就發(fā)光，因此發(fā)光的強(qiáng)度與目標(biāo)基因量成正比。第19頁(yè)/共71頁(yè)因?yàn)樘结樖峭耆c目的基因互補(bǔ)，當(dāng)它被水解后就發(fā)光，因此發(fā)光的只與雙鏈結(jié)合，發(fā)光；不與單鏈結(jié)合，不發(fā)光。第20頁(yè)/共71頁(yè)只與雙鏈結(jié)合，發(fā)光；不與單鏈結(jié)合，不發(fā)光。第20頁(yè)/共71頁(yè)第21頁(yè)/共71頁(yè)第21頁(yè)/共71頁(yè)隨溫度升高，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線即熔解曲線，可用對(duì)數(shù)圖和線性圖表示。在擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50％的溫度），用這個(gè)特征峰就可以將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌臏囟热芙狻?/p>

染料法做，探針法不做第22頁(yè)/共71頁(yè)隨溫度升高，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線即熔解曲線，可不適合染料法第23頁(yè)/共71頁(yè)不適合染料法第23頁(yè)/共71頁(yè)第24頁(yè)/共71頁(yè)第24頁(yè)/共71頁(yè)鹵素?zé)簦ò坠猓┑?5頁(yè)/共71頁(yè)鹵素?zé)簦ò坠猓┑?5頁(yè)/共71頁(yè)定量線性圖與對(duì)數(shù)圖正好相反，基線期在對(duì)數(shù)圖中增高。第26頁(yè)/共71頁(yè)定量線性圖與對(duì)數(shù)圖正好相反，基線期在對(duì)數(shù)圖中增高。第26頁(yè)/第27頁(yè)/共71頁(yè)第27頁(yè)/共71頁(yè)基線熒光閾值Ct值［DNA］0基線：擴(kuò)增線中的水平部分，由環(huán)境的噪音產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)束軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，基線取默認(rèn)值3-15（循環(huán)數(shù)）。如果最小的Ct值>18，保持默認(rèn)；

如果最小的Ct值<18，基線終點(diǎn)改成［最小的Ct值減3］，重新分析。

第28頁(yè)/共71頁(yè)基線熒光閾值Ct值［DNA］0基線：擴(kuò)增線中的水平部分，由環(huán)熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段的任意位置上。默認(rèn)閾值＝基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。第29頁(yè)/共71頁(yè)熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光Ct值的含義：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。［DNA］0：樣本起始DNA濃度。第30頁(yè)/共71頁(yè)Ct值的含義：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的第31頁(yè)/共71頁(yè)第31頁(yè)/共71頁(yè)理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR因素逐漸不滿足要求，PCR效率越來越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度逐漸減緩。第32頁(yè)/共71頁(yè)理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線第33頁(yè)/共71頁(yè)第33頁(yè)/共71頁(yè)第34頁(yè)/共71頁(yè)第34頁(yè)/共71頁(yè)絕對(duì)第35頁(yè)/共71頁(yè)絕對(duì)第35頁(yè)/共71頁(yè)第36頁(yè)/共71頁(yè)第36頁(yè)/共71頁(yè)處理與對(duì)照第37頁(yè)/共71頁(yè)處理與對(duì)照第37頁(yè)/共71頁(yè)第38頁(yè)/共71頁(yè)第38頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR儀特點(diǎn)，污染機(jī)會(huì)少第39頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR儀特點(diǎn)，污染機(jī)會(huì)少第39頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR的實(shí)驗(yàn)因素DNA純度：OD260/OD280=1.8,

1.6-2.0之間DNA用量：0.05-100ngRNA純度：OD260/OD280=2.0cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1μl樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都需要重復(fù)，重復(fù)次數(shù)遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。第40頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR的實(shí)驗(yàn)因素DNA純度：OD260/OD280=1.定量PCR實(shí)驗(yàn)要素：目標(biāo)基因：未知樣品生成標(biāo)準(zhǔn)：曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度監(jiān)控系統(tǒng)：陽(yáng)性對(duì)照監(jiān)控污染：陰性對(duì)照校準(zhǔn)生物學(xué)誤差：管家基因校準(zhǔn)物理誤差：參比熒光（ROX）降低其它誤差：重復(fù)實(shí)驗(yàn)第41頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR實(shí)驗(yàn)要素：第41頁(yè)/共71頁(yè)ABI

750096孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀。ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性）儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度波動(dòng)）第42頁(yè)/共71頁(yè)ABI750096孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀。第43頁(yè)/共71頁(yè)第43頁(yè)/共71頁(yè)Real-time

PCR方法的應(yīng)用絕對(duì)定量（Absolute

Quantification）：拷貝數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)是已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA。相對(duì)定量（Relative

Quantification）：相對(duì)變化量；內(nèi)標(biāo)定量。前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100%且偏差在5%以內(nèi)。第44頁(yè)/共71頁(yè)Real-timePCR方法的應(yīng)用絕對(duì)定量（Absol第45頁(yè)/共71頁(yè)第45頁(yè)/共71頁(yè)第46頁(yè)/共71頁(yè)第46頁(yè)/共71頁(yè)蛋白互作第47頁(yè)/共71頁(yè)蛋白互作第47頁(yè)/共71頁(yè)第48頁(yè)/共71頁(yè)第48頁(yè)/共71頁(yè)第49頁(yè)/共71頁(yè)第49頁(yè)/共71頁(yè)第50頁(yè)/共71頁(yè)第50頁(yè)/共71頁(yè)第51頁(yè)/共71頁(yè)第51頁(yè)/共71頁(yè)第52頁(yè)/共71頁(yè)第52頁(yè)/共71頁(yè)三、第53頁(yè)/共71頁(yè)三、第53頁(yè)/共71頁(yè)第54頁(yè)/共71頁(yè)第54頁(yè)/共71頁(yè)第55頁(yè)/共71頁(yè)第55頁(yè)/共71頁(yè)第56頁(yè)/共71頁(yè)第56頁(yè)/共71頁(yè)第57頁(yè)/共71頁(yè)第57頁(yè)/共71頁(yè)第58頁(yè)/共71頁(yè)第58頁(yè)/共71頁(yè)第59頁(yè)/共71頁(yè)第59頁(yè)/共71頁(yè)第60頁(yè)/共71頁(yè)第60頁(yè)/共71頁(yè)操作流程第61頁(yè)/共71頁(yè)操作流程第61頁(yè)/共71頁(yè)第62頁(yè)/共71頁(yè)第62頁(yè)/共71頁(yè)第63頁(yè)/共71頁(yè)第63頁(yè)/共71頁(yè)第64頁(yè)/共71頁(yè)第64頁(yè)/共71頁(yè)第65頁(yè)/共71頁(yè)第65頁(yè)/共71頁(yè)第66頁(yè)/共71頁(yè)第66頁(yè)/共71頁(yè)第67頁(yè)/共71頁(yè)第67頁(yè)/共71頁(yè)第68頁(yè)/共71頁(yè)第68頁(yè)/共71頁(yè)第69頁(yè)/共71頁(yè)第69頁(yè)/共71頁(yè)我們班上的劉磊同學(xué)所拍第70頁(yè)/共71頁(yè)我們班上的劉磊同學(xué)所拍第70頁(yè)/共71頁(yè)會(huì)計(jì)學(xué)72PCR技術(shù)教程會(huì)計(jì)學(xué)1PCR技術(shù)教程一、PCR技術(shù)二、定量PCR技術(shù)三、數(shù)字PCR技術(shù)第1頁(yè)/共71頁(yè)一、PCR技術(shù)二、定量PCR技術(shù)三、數(shù)字PCR技術(shù)第1頁(yè)/共一、PCR原理PolymeraseChainReaction(PCR)：在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。1、歷史

1971年，Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。

1985年Cetus公司科學(xué)家使設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)，采用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37℃），并獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1988年R.K.Saiki應(yīng)用Taq

DNA聚合酶（水生棲熱菌）

于PCR反應(yīng)；同年，Cetus公司發(fā)明自動(dòng)熱循環(huán)儀。第2頁(yè)/共71頁(yè)一、PCR原理PolymeraseChainReacti2、原理預(yù)變性－變性－退火－延伸－保存循環(huán)（30次）95℃預(yù)變性1min95℃變性1min目的：DNA雙鏈成單鏈56℃

退火目的：引物先與模板匹配72℃延伸1-2

min目的：聚合酶在引物3’端加核苷酸，合成新鏈12℃保存循環(huán)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便第3頁(yè)/共71頁(yè)2、原理預(yù)變性－變性－退火－延伸－保存循環(huán)（30次）95℃循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201048576301073741824第4頁(yè)/共71頁(yè)循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201048576301073

1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，無3’→5’外切酶活性，不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)，因此必須測(cè)序。需激活劑：Mg2+

2、pfuDNA聚合酶：有5’→3’和3’→5外切酶活性，出錯(cuò)率最低，但

PCR產(chǎn)物平端。

3、TaqPlusDNA聚合酶：是Taq和pfu的混合物，TaqPCR產(chǎn)物3’端帶－

A。

4、引物：互補(bǔ)；引物長(zhǎng)度；3’堿基序列必須與模板配對(duì)；盡量提高

GC含量；避免連續(xù)相同堿基排列或開成回紋結(jié)構(gòu)；避免形成引物二聚體。

5、Tm=(G+C)×4+(A+C)×2

6、primer5.0

7、模板純度：不一定要純，但要確定不含蛋白變性劑、DNA酶、

Mg2+螯合劑等。模板量（100ng/100μl）

8、dNTP濃度

2.5

mM

each特殊說明：第5頁(yè)/共71頁(yè)1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，無3’→5普通PCRRT-PCRTAIL-PCR

Real-time

PCR數(shù)字PCRPCR類型：第6頁(yè)/共71頁(yè)普通PCRPCR類型：第6頁(yè)/共71頁(yè)普通PCR儀梯度PCR儀原位PCR儀定量PCR儀數(shù)字PCR儀第7頁(yè)/共71頁(yè)普通PCR儀梯度PCR儀原位PCR儀定量PCR儀數(shù)字PCR儀二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timequantification

PCR）1、歷史實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied

Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它的特異性更強(qiáng)、更能有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度更高等特點(diǎn)。第8頁(yè)/共71頁(yè)二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timequantifi第9頁(yè)/共71頁(yè)第9頁(yè)/共71頁(yè)原理：在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如

SYBR

GREEN1）或特異性的熒光探針（如Taqman探針），利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過程，再

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或內(nèi)參基因?qū)ξ粗蜻M(jìn)行定量分析的方法。也就是通過熒光的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定熒光信號(hào)（閾值）所需要的循環(huán)次數(shù)Ct（CycleThreshold）。

Ct值的含義：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。第10頁(yè)/共71頁(yè)原理：在PCR反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如第10頁(yè)/1、熒光探針和熒光染料：分別用探針或熒光染料與特異序列結(jié)合來指示擴(kuò)增產(chǎn)物，前者特異性高，后者操作簡(jiǎn)單。SYBR

GREEN1：結(jié)合雙鏈DNA小溝后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但也會(huì)結(jié)合引物二聚體或單鏈引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)。變性時(shí)，雙鏈分開，熒光消失。特別說明：TaqMan探針：寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在5’端，淬滅基因連在3’端。5’端熒光基團(tuán)吸收能量后轉(zhuǎn)移給臨近的3’端淬滅基團(tuán)，發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），只要探針完整，能量就會(huì)被淬滅。第11頁(yè)/共71頁(yè)1、熒光探針和熒光染料：SYBRGREEN1：結(jié)合雙鏈D熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)時(shí)反映DNA的擴(kuò)增；靈敏度極高，用于準(zhǔn)確定量初始模板數(shù)量；既能用于定性，判斷一段DNA序列的有無，也可用于定量，確定起始DNA拷貝數(shù)。第12頁(yè)/共71頁(yè)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)時(shí)反映DNA的擴(kuò)增；第一對(duì)引物引物之間一條寡核苷酸，即探針報(bào)告基因與淬滅基團(tuán)完整探針，不發(fā)光；水解后，發(fā)光。FRET第13頁(yè)/共71頁(yè)一對(duì)引物引物之間一條寡核苷酸，即探針報(bào)告基因與淬滅基團(tuán)完整探變性（95℃）退火（60℃）第14頁(yè)/共71頁(yè)變性（95℃）退火（60℃）第14頁(yè)/共71頁(yè)DNA聚合酶第15頁(yè)/共71頁(yè)DNA聚合酶第15頁(yè)/共71頁(yè)5’→3’外切酶活性；可將探針5’端的熒光基團(tuán)切割下來。第16頁(yè)/共71頁(yè)5’→3’外切酶活性；可將探針5’端的熒光基團(tuán)切割下來。第1熒光基團(tuán)游離下來后發(fā)光了！第17頁(yè)/共71頁(yè)熒光基團(tuán)游離下來后發(fā)光了！第17頁(yè)/共71頁(yè)第18頁(yè)/共71頁(yè)第18頁(yè)/共71頁(yè)因?yàn)樘结樖峭耆c目的基因互補(bǔ)，當(dāng)它被水解后就發(fā)光，因此發(fā)光的強(qiáng)度與目標(biāo)基因量成正比。第19頁(yè)/共71頁(yè)因?yàn)樘结樖峭耆c目的基因互補(bǔ)，當(dāng)它被水解后就發(fā)光，因此發(fā)光的只與雙鏈結(jié)合，發(fā)光；不與單鏈結(jié)合，不發(fā)光。第20頁(yè)/共71頁(yè)只與雙鏈結(jié)合，發(fā)光；不與單鏈結(jié)合，不發(fā)光。第20頁(yè)/共71頁(yè)第21頁(yè)/共71頁(yè)第21頁(yè)/共71頁(yè)隨溫度升高，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線即熔解曲線，可用對(duì)數(shù)圖和線性圖表示。在擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50％的溫度），用這個(gè)特征峰就可以將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌臏囟热芙狻?/p>

染料法做，探針法不做第22頁(yè)/共71頁(yè)隨溫度升高，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線即熔解曲線，可不適合染料法第23頁(yè)/共71頁(yè)不適合染料法第23頁(yè)/共71頁(yè)第24頁(yè)/共71頁(yè)第24頁(yè)/共71頁(yè)鹵素?zé)簦ò坠猓┑?5頁(yè)/共71頁(yè)鹵素?zé)簦ò坠猓┑?5頁(yè)/共71頁(yè)定量線性圖與對(duì)數(shù)圖正好相反，基線期在對(duì)數(shù)圖中增高。第26頁(yè)/共71頁(yè)定量線性圖與對(duì)數(shù)圖正好相反，基線期在對(duì)數(shù)圖中增高。第26頁(yè)/第27頁(yè)/共71頁(yè)第27頁(yè)/共71頁(yè)基線熒光閾值Ct值［DNA］0基線：擴(kuò)增線中的水平部分，由環(huán)境的噪音產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)束軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，基線取默認(rèn)值3-15（循環(huán)數(shù)）。如果最小的Ct值>18，保持默認(rèn)；

如果最小的Ct值<18，基線終點(diǎn)改成［最小的Ct值減3］，重新分析。

第28頁(yè)/共71頁(yè)基線熒光閾值Ct值［DNA］0基線：擴(kuò)增線中的水平部分，由環(huán)熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段的任意位置上。默認(rèn)閾值＝基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。第29頁(yè)/共71頁(yè)熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光Ct值的含義：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。［DNA］0：樣本起始DNA濃度。第30頁(yè)/共71頁(yè)Ct值的含義：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的第31頁(yè)/共71頁(yè)第31頁(yè)/共71頁(yè)理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR因素逐漸不滿足要求，PCR效率越來越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度逐漸減緩。第32頁(yè)/共71頁(yè)理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線第33頁(yè)/共71頁(yè)第33頁(yè)/共71頁(yè)第34頁(yè)/共71頁(yè)第34頁(yè)/共71頁(yè)絕對(duì)第35頁(yè)/共71頁(yè)絕對(duì)第35頁(yè)/共71頁(yè)第36頁(yè)/共71頁(yè)第36頁(yè)/共71頁(yè)處理與對(duì)照第37頁(yè)/共71頁(yè)處理與對(duì)照第37頁(yè)/共71頁(yè)第38頁(yè)/共71頁(yè)第38頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR儀特點(diǎn)，污染機(jī)會(huì)少第39頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR儀特點(diǎn)，污染機(jī)會(huì)少第39頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR的實(shí)驗(yàn)因素DNA純度：OD260/OD280=1.8,

1.6-2.0之間DNA用量：0.05-100ngRNA純度：OD260/OD280=2.0cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1μl樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都需要重復(fù)，重復(fù)次數(shù)遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。第40頁(yè)/共71頁(yè)定量PCR的實(shí)驗(yàn)因素DNA純度：OD260/OD280=1.定量PCR實(shí)驗(yàn)要素：目標(biāo)基因：未知樣品生成標(biāo)準(zhǔn)：曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度監(jiān)控系統(tǒng)：陽(yáng)性對(duì)照監(jiān)控污染：陰性對(duì)照校準(zhǔn)生物學(xué)誤差：管家基因校準(zhǔn)物理誤差：參比熒光（ROX