生物制藥專(zhuān)業(yè)綜合試驗(yàn)講解

生物技術(shù)制藥實(shí)驗(yàn)課程實(shí)習(xí) 講義人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF）在大腸桿菌中的表達(dá)與純化生物與制藥工程學(xué)院 制2016年6月2日目錄TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"第一節(jié)引言 2\o"CurrentDocument"表皮生長(zhǎng)因子（EGF）概述 2\o"CurrentDocument"表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 2\o"CurrentDocument"EGF的生物學(xué)效應(yīng)及應(yīng)用 3\o"CurrentDocument"本實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)的目的與內(nèi)容 4\o"CurrentDocument"第二節(jié)EGF基因的合成與轉(zhuǎn)化表達(dá) 5.實(shí)驗(yàn)原理 5.實(shí)驗(yàn)材料與方法 5實(shí)驗(yàn)材料及儀器 5試劑材料及試劑 5\o"CurrentDocument"儀器設(shè)備 6實(shí)驗(yàn)方法 6試劑及培養(yǎng)基配制方法 6\o"CurrentDocument"目的基因hEGF的設(shè)計(jì)與合成 7\o"CurrentDocument"電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA 8\o"CurrentDocument"大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 8\o"CurrentDocument"轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌 BL21（DE3） 9\o"CurrentDocument"檢測(cè)轉(zhuǎn)化是否成功 9\o"CurrentDocument"雙酶切并檢測(cè) 9\o"CurrentDocument"EGF基因的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 9\o"CurrentDocument"目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)及基因表達(dá)產(chǎn)物的 SDS檢測(cè) 10\o"CurrentDocument"第三節(jié) EGF表達(dá)蛋白的純化與檢測(cè) 15實(shí)驗(yàn)原理 15可溶性6xHis重組蛋白純化實(shí)驗(yàn)方法 156xHis重組蛋白包涵體純化與復(fù)性 17第一節(jié)引言表皮生長(zhǎng)因子（EGF）概述生長(zhǎng)因子在人體中的信號(hào)傳導(dǎo)部分起著關(guān)鍵的作用，它可通過(guò)與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)受體結(jié)合，參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)。生長(zhǎng)因子可以是維生素，堿基，多肽等。所研究的表皮生長(zhǎng)因子（Epidemalgrowthfactor,EGF）,就是一種人機(jī)體細(xì)胞合成的一種多肽。在生物體內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)不同，在不同組織中的細(xì)胞的表皮生長(zhǎng)因子參與生長(zhǎng)、增值、死亡等過(guò)程。目前，表皮生長(zhǎng)因子已得到廣泛應(yīng)用。在許多公司已經(jīng)開(kāi)始研發(fā)甚至是生產(chǎn)出EGF,多種疾病的誘發(fā)原因很多，我們可以用EGF來(lái)進(jìn)行詳細(xì)的診斷。之后致病的查出原因，給病人減少心理的壓力，帶來(lái)一線生機(jī)。在經(jīng)過(guò)強(qiáng)烈的光刺激后，尤其是激光，人們的眼部會(huì)有很大的損傷，最嚴(yán)重的就是眼角膜損傷，無(wú)法修復(fù)。人體在經(jīng)過(guò)紫外線的照射下皮膚的損傷以及高溫、蒸氣、火等造成的皮膚大面積與原來(lái)的不一樣的皮膚。對(duì)于這些傷害，我們可使用含有可促進(jìn)人體表皮細(xì)胞的新陳代謝EGF的藥膏或者是化妝品，使皮膚變得如初［1］。在最早研究表皮生長(zhǎng)因子的時(shí)候就只是證明是多肽，還沒(méi)有命名。是由Cohen在1960年，在提取神經(jīng)生長(zhǎng)因子時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)除此種物質(zhì)以外的一種多肽［2］。多個(gè)科學(xué)家對(duì)其充滿(mǎn)好奇心，在之后的十年內(nèi)，Savage真正的研究清楚，命名此種多肽為表皮生長(zhǎng)因子［3］。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同的生物中，表皮生長(zhǎng)因子的蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)不同。研究表明家族成員一般在多于50個(gè)氨基酸，而少于80個(gè)氨基酸，與我們所熟悉的胰島素一樣，表皮生長(zhǎng)因子是由前體加工成的成熟的多肽，在具有生物活性［4］o如人體中的表皮生長(zhǎng)因子是由53個(gè)氨基酸組成［5］。整個(gè)hEGF分子由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。殘基1?33,形成N一端結(jié)構(gòu)域；34?53為C一端結(jié)構(gòu)域；成熟hEGF的序列位于單鏈多肽的C一末端附近，由53個(gè)氨基酸殘基組成，并且其C一端和N一端分別由Arg/Asp/Arg/His鄰接，故成熟的EGF分子，可以經(jīng)專(zhuān)一性Arg內(nèi)肽酶的作用，從前體釋放［6］。二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在著反平行B片層結(jié)構(gòu)是EGF骨架的常見(jiàn)結(jié)構(gòu)，N一端和C一端在整個(gè)三維結(jié)構(gòu)中不會(huì)發(fā)生什么變動(dòng)，維持此結(jié)構(gòu)的是由三個(gè)二硫鍵 [7]（由于6個(gè)半胱氨酸的存在），因此分子在一定的條件下生物活性表現(xiàn)頑強(qiáng)”網(wǎng)。我們知道同一種酶在不同的生物中有不同的生物效應(yīng)，同時(shí)不同的酶在不同的生物中會(huì)有相同的生物效應(yīng)，hEGF也會(huì)有此種現(xiàn)象。hEGF-B和hEGF-丫是hEGF的兩種形式，在分子結(jié)構(gòu)和同源性中相似度高，在蛋白中一級(jí)結(jié)構(gòu)中即使是在 C末端的某個(gè)位置上僅僅只有一個(gè)Arg的差別，當(dāng)它們作用于不同細(xì)胞中的同一個(gè)受體，在生物體中的作用是一樣的[9]。與許多古細(xì)菌中的酶一樣如生活在溫泉中古細(xì)菌，人體表皮生長(zhǎng)因子在 100c煮沸達(dá)到30min,仍然能保持結(jié)構(gòu)、活性等穩(wěn)定性；許多蛋白質(zhì)在具有強(qiáng)列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽鏈被斷掉，而表皮生長(zhǎng)因子耐它的消化 [10]0EGF在狹小的活性微環(huán)境中，由于常見(jiàn)的丙氨酸、苯丙氨酸和賴(lài)氨酸 [11]會(huì)提供作用基團(tuán)，表皮生長(zhǎng)因子才能與受體結(jié)合反應(yīng)。多肽具有 N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，據(jù)研究表明，表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)的兩端在細(xì)胞的生長(zhǎng)中都很重要。EGF的生物學(xué)效應(yīng)及應(yīng)用細(xì)胞通過(guò)在信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中有多種方式包括直接或間接的接觸。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物體內(nèi)它亦可以與其他的因子結(jié)合作用于細(xì)胞。EGF生物效應(yīng)很多，如下所述：.來(lái)源于人體的不同種組織的上皮細(xì)胞為了適應(yīng)人體的需要， 從基因上賦予它很高分裂效率。EGF在其中起著關(guān)鍵性的作用。首先人體的皮膚表層會(huì)產(chǎn)生脫皮現(xiàn)象，證明有大量的細(xì)胞死亡。同樣，皮膚的表面受到傷害在愈合的過(guò)程會(huì)結(jié)痂，新的皮膚又長(zhǎng)出來(lái)了。EGF在創(chuàng)傷修復(fù)中起著功不可沒(méi)的作用，在肝臟、腸道、角膜、胃等多種組織創(chuàng)傷的恢復(fù)的試驗(yàn)研究 [12]取得重大的突破，在臨床上已經(jīng)運(yùn)用于燒傷、燙傷、創(chuàng)傷及外科手術(shù)傷口的愈合，使病人的痛苦少一點(diǎn)。.眼睛是我們重要的部分，眼睛的部分受到傷害特別是眼角膜，是我們最擔(dān)心的。在現(xiàn)實(shí)生活中，很多病人由于眼角膜的傷害再加上眼角膜的捐獻(xiàn)者少之又少無(wú)法得到修復(fù)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，適宜濃度的 hEGF滴眼液，能通過(guò)刺激角膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生與遷移和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)與膠原纖維增生，使損傷修復(fù)速度加快，從而輔助修復(fù)角膜［13］o.研究表明，多數(shù)月中瘤的發(fā)生、發(fā)展，與EGF之間存在一定的關(guān)系。細(xì)胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌變可能由于這些基因的突變細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)不受控制。月中瘤細(xì)胞表面的EGF受體屬于多聚體受體，多個(gè)EGF的表達(dá)之后與受體結(jié)合，使細(xì)胞不停的生長(zhǎng)，這樣，與胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的惡性程度增加叫.是藥三分毒，我們吃的要中有些藥對(duì)人的胃刺激很大。實(shí)驗(yàn)表明：在人的胃潰瘍中受損傷的細(xì)胞與保護(hù)藥硫酸鋁相結(jié)合，可以使?jié)冇休^高濃度的內(nèi)源性EGF表達(dá)，從而促進(jìn)潰瘍愈合［15］。1.4本實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)的目的與內(nèi)容.實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)目的：本實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)重在學(xué)生自己動(dòng)手設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，老師起輔助指導(dǎo)作用，旨在訓(xùn)練學(xué)生對(duì)專(zhuān)業(yè)綜合知識(shí)的運(yùn)用。學(xué)生需查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)與理解設(shè)計(jì)方案，主要考察學(xué)生對(duì)基因分子克隆、表達(dá)、發(fā)酵和蛋白分離知識(shí)的理解與應(yīng)用，以培養(yǎng)學(xué)生的專(zhuān)業(yè)綜合知識(shí)應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)動(dòng)手操作能力。2.實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)內(nèi)容：以表皮生長(zhǎng)因子(EGF)為例，讓學(xué)生從基因的設(shè)計(jì)入手，合成出完整的EGF基因，然后表達(dá)并純化出該EGF蛋白。主要內(nèi)容簡(jiǎn)述如下：(1)通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站設(shè)計(jì)出完整的EGF基因，并設(shè)計(jì)出引物；(2)pET-28a衍生質(zhì)粒為載體、將EGF基因轉(zhuǎn)化如大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中,并通過(guò)雙酶切和PCR挑選驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子；(3)誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)hEGF蛋白；(4)經(jīng)超聲破碎提取、SDS電泳檢測(cè)(5)采用鍥柱純化，進(jìn)而獲取hEGF蛋白純品。

第二節(jié)EGF基因的合成與轉(zhuǎn)化表達(dá)1.實(shí)驗(yàn)原理人源表皮生長(zhǎng)因子（hEGF）來(lái)源大致有三個(gè)方向：一是來(lái)源于人體代謝物的提??；二是來(lái)源于化學(xué)合成；三是來(lái)源于基因工程生產(chǎn)技術(shù)，這也是近些年來(lái)可以大量生產(chǎn)獲得hEGF的方法。前兩種方式得到的產(chǎn)品都只有很低的純度，并不能在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮很大的價(jià)值o0目前已知的研究中，hEGF基因在大腸桿菌、枯草芽抱桿菌和酵母以及動(dòng)植物等宿主系統(tǒng)中已經(jīng)成功克隆表達(dá)。以pET等衍生質(zhì)粒為載體、以BL21（DE3）為表達(dá)宿主菌的表達(dá)系統(tǒng)是發(fā)展較成熟的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)之一 ，它采用T7強(qiáng)啟動(dòng)子，在IPTG誘導(dǎo)下，啟動(dòng)外源基因的高轉(zhuǎn)錄。pET載體有pET32a（力母液、PET-28a菌種、E.coliDE3菌種、酒精、含質(zhì)粒載體的PET-28a菌液、小型質(zhì)?？焖偬崛≡圐RI」盒（離心柱型）、Goldview、BIOWESTAGAROSE、loadingbuffer（6的、HindmDNAMarker、TAE電泳緩沖液（1X）、0.1mol/LCaCl2溶液、ZdeI酶（10U/4及其10XBuffer、Xhol酶（10U/。及其BufferD10X、GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、5U/lTaqDNA聚合酶、PCR緩沖液（10X,含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、無(wú)菌雙蒸水、1mol/l的異內(nèi)基硫代半乳糖甘（TPTG）、PBS（1X）、SDS蛋白凝膠配制試劑盒：30%Acr-Bis（29:1）、1.5MTris-Hcl,pH8.8、10%SDS、10%過(guò)硫酸俊（AP）溶液、TEMED、1MTris-Hcl,pH6.8;2>±樣緩沖液、1XTris-甘氨酸電泳緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色液、脫色液I（45%甲醇：10%乙酸：45%蒸儲(chǔ)水）、脫色液II（5%甲醇：7%乙酸：88%蒸儲(chǔ)水），雙蒸水和pET28a和pET28a（力等系列。下圖1為PET28a質(zhì)粒載體的物理圖譜。MlH)MiOEIIBff-I4ndIlir^3)盾8Ml￡i?EiMinHI41M)□eiiliB?3-處所RpulltK2l|M)J--KM143331BUII4QIRSq-A.I442^\_-Spll110HMhehteh-國(guó)工卬MlH)MiOEIIBff-I4ndIlir^3)盾8Ml￡i?EiMinHI41M)□eiiliB?3-處所RpulltK2l|M)J--KM143331BUII4QIRSq-A.I442^\_-Spll110HMhehteh-國(guó)工卬H?聯(lián)制*///cClfiiJI:、IUlH3-|I1前EM'€?fr7??？r\￡]pB.vaflII1A.UMpaHiAMiJI]貨■孫二3SSSICMJTi--廣BUILU11hmi-- .工SpWC0￥，-..BernnJTEilllg的10||)下■ReiIi2?hi叱mH凹i圖1PET28a質(zhì)粒載體2.實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料及儀器試劑材料及試劑瓊脂粉、NaCl、蛋白月東、酵母浸粉、1mol/LNaOH溶液、雙蒸水、10mg/mlKana2.1.2儀器設(shè)備試管、量筒、天平、藥匙、稱(chēng)量紙、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫生化培養(yǎng)箱、涂棒、接種環(huán)、酒精燈、pH試紙、記號(hào)筆、麻純、棉花、報(bào)紙、銀子、滴管、10ml移液管、恒溫?fù)u床、Eppendorf管、微量移液器、槍頭、高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、水平凝膠電泳槽和梳子以及其制膠模塊、250ml錐形瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)、分光光度計(jì)、制冰機(jī)、冰盒、恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、水漂、0.2mlPCR微量管、雙面微量離心管架、PCR儀、紫外檢測(cè)儀、脫色搖床、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、垂直電泳槽及配套的玻璃和密封條、梳子、1.5ml微量離心管、搪瓷盤(pán)2.2實(shí)驗(yàn)方法試劑及培養(yǎng)基配制方法.卡那霉素母液（10mg/mL）的配制：稱(chēng)取10mg卡那霉素溶解于1ml無(wú)菌水中，然后采用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后分裝于 Eppendorf小管中。.培養(yǎng)基的配制LB培養(yǎng)基:配方（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉）1000ml 150ml蛋白陳10g1.5g酵母浸粉5g0.75gNaCl10g1.5g瓊脂粉18g2.7g(2)去離子水950mL142.5mL含卡那霉素(Kana)LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60C左右，加入Kana儲(chǔ)存液，使終濃度為50聞/ml,搖勻后鋪板。(3)含Kana的LB液體培養(yǎng)基：每15mLLB液體培養(yǎng)基分裝至試管中，高壓滅菌后冷卻至60C左右，加入Kana母液，使終濃度為50聞/ml)目的基因hEGF的設(shè)計(jì)與合成hEGF的cDNA序列自NCBI上查閱文獻(xiàn)得到其編號(hào)(NM_001963.2)[21],在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中查獲其序列為：5'-aatagtgactctgaatgtcccctgtcccacgatgggtactgcctccatgatggtgtgtgcatgtataTtgaagcattggacaagtatgcatgcaactgtgttgttggcracatcggggagcgatgtcagtaccgagacctgaagtggtgggaactgcgc-3J根據(jù)其序列和限制性酶切位點(diǎn)XhoI和NdeI引入其上下游引物分別為：F:5'-AGTGACTCTCAATGTCCC-3';R:5'-TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3'。委托上海捷瑞生物工程有限責(zé)任公司合成目的基因hEGF序列，并將其插入到質(zhì)粒載體PET28a的限制性酶切位點(diǎn)XhoI和NdeI之間。公司將含有目的基因序列的重組質(zhì)粒PET28a-hEGF保存在穿刺菌細(xì)胞XL10中寄回。提取重組質(zhì)粒(1)在滅菌后的無(wú)菌操作臺(tái)中，取15ml分裝至試管中的、滅菌后的LB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素母液150山，保證它在培養(yǎng)基中為50聞/mL。(2)將含目的基因的重組質(zhì)粒的穿刺菌 XL10接種無(wú)菌LB培養(yǎng)基(含50(J/mL卡那霉素)，37C搖床過(guò)夜培養(yǎng)(不能超過(guò)15h)。(3)取收取的2ml的菌液于2mlEp管中，用于提取質(zhì)粒。(4)提取質(zhì)粒，按質(zhì)粒小量制備試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作。電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA(1)稱(chēng)取0.3g瓊脂粉BIOWESTAGAROSE,放入三角瓶中，加入30mlTAE電泳緩沖液(1X),制成1%的膠，在微波爐中燒開(kāi)。(2)待徹底熔化后，停止加熱。(3)取出三角瓶，自然冷卻至不燙手，加入1.7&oldview染液。(4)插入梳子后緩緩倒入膠液，至模具的矮邊緣即可，平放等待徹底凝固。(5)在電泳槽里加滿(mǎn)1>TAE緩沖液，調(diào)電壓至140V(10V/cm)。(6)膠全凝固后，小心拔出梳子，放入電泳槽中，凝膠要沒(méi)入緩沖液中。⑺在塑料片上，點(diǎn)5d(6X)loadingbuffer,再加入1d上述質(zhì)粒DNA提取產(chǎn)物，混合均勻。(8)在凝膠上選擇相鄰的加樣孔，用吸液頭分別將管中的樣品和 DNAMarker加入凝膠的加樣孔中。(9)打開(kāi)電源，樣品以藍(lán)色的橫帶泳動(dòng)，電泳約30min。(10)當(dāng)藍(lán)色泳動(dòng)到凝膠邊緣1cm時(shí)，關(guān)掉電源。取出模具和凝膠放入成像系統(tǒng)中，觀察結(jié)果圖，并保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)宿主菌的培養(yǎng)挑取新活化的E.coliBL21(DE3)單菌落，接種于4mlLB液體培養(yǎng)基中,37C下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液1ml接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37C搖床培養(yǎng)3?4小時(shí)至OD590=0.4?0.5左右。(2)制備感受態(tài)細(xì)胞(CaCl2法)I、將發(fā)酵后的菌液轉(zhuǎn)入2mL預(yù)冷、無(wú)菌的離心管中，冰置10分鐘4c5000rmp離心10分鐘。H、棄去上清，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰置30分鐘后,4C,5000rmp,10分鐘離心。田、棄去上清，加入1ml預(yù)冷0.1mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30分鐘。IV、在離心機(jī)中4c下5000rmp離心10分鐘，保留沉淀，200仙L預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重新懸浮，無(wú)菌操作臺(tái)中將其分裝成 100艮L的小份，在冰上放置2小時(shí)以上，便可直接用作宿主菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)I、在超凈工作臺(tái)上，取上述感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌液，加入PET28a質(zhì)粒DNA溶液5仙l輕輕搖勻，置于冰上放30分鐘.H、在42c水浴鍋中熱擊90s迅速在冰上冷卻5分鐘。田、往試管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含kan),37c搖床發(fā)酵1小時(shí)。IV、將上述菌液搖勻后取100pL涂布于含Kan的固體LB平板上，正面朝上上放置半小時(shí)到一個(gè)小時(shí)待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37C條件恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)。設(shè)置對(duì)照：以相同體積的無(wú)菌雙蒸水代替質(zhì)粒樣品溶液，其它操作與上述相同。此對(duì)照正常情況下應(yīng)無(wú)菌落出現(xiàn)。檢測(cè)轉(zhuǎn)化是否成功提取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌的質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)： 參見(jiàn)前面質(zhì)粒提取以及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的方法。將兩次提取的質(zhì)粒在同一塊凝膠中電泳，對(duì)比其電泳條帶。雙酶切弁檢測(cè)(1)先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。從-20C冰柜中取出限制性?xún)?nèi)切酶，立即插入冰塊中。(2)用20d的反應(yīng)體系進(jìn)行雙酶切： 無(wú)菌雙蒸水14小10XHBuffer2l、pBSA1pl質(zhì)粒1M混勻，限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、NdeI各1d。(3)混勻離心管使管中的溶液。在離心機(jī)中5000rpm離心30秒。取出后插到水漂的孔中，37.C水浴酶切2h0(4)酶切后取酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(方法參照上述)，制1.5%的瓊脂糖凝膠，電泳以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。EGF基因的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證取無(wú)菌的0.2mlPCR管，置于冰中，在其中添加如下成分如表3:表3PCR反應(yīng)體系TOC\o"1-5"\h\z無(wú)菌水 17pl10XPCR緩沖液（含Mgcl2 2.5jldNTP混合物 2pl上游引物 1M下游引物 1M待擴(kuò)增DNA模板 1MTaqDNA聚合酶（5U/ ”） 0.50終體積 25M混勻后，稍作離心（如果利用非熱蓋型PCR儀器，應(yīng)添加30d石蠟油于反應(yīng)管中，防止樣品水分的蒸發(fā)）[17]o將反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件設(shè)定反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR反應(yīng)，如表4:表4PCR反應(yīng)過(guò)程94c預(yù)變性5min變性94C30s丁退火55C30s>循環(huán)25次延伸72C30s-最后在72C保溫10minPCR反應(yīng)結(jié)束后，取5-10d反應(yīng)液做電泳檢測(cè)，鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物是否存在，及其大小。電泳確認(rèn)后，PCR產(chǎn)物即可用于下一步操作或冰箱保存。目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)及基因表達(dá)產(chǎn)物的 SDS檢測(cè)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)重組菌的擴(kuò)增：接種轉(zhuǎn)化了pET-28a-hEGF的EcoliDE3于含Kana（50g/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37C,200rpm,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)接100L過(guò)夜培養(yǎng)物，于100mL的LB液體培養(yǎng)基，于37C,200rpm,振蕩培養(yǎng)至OD600值在0.7-1.0。從中取出1.0ml菌液，離心，棄去上清，40LPBS懸浮，備用于后面SDS電泳操作。重組菌外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)：向擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入1000L0.1mol/LIPTG（至終濃度1mmol/L）,于37c振蕩培養(yǎng)3-4h。蛋白樣品的抽提：將誘導(dǎo)后菌液，4.0C,5000rpm/min,離心10min,棄去上清。將所得的菌體沉淀，用PBS溶液懸浮，并轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，向管中繼續(xù)加入PBS至適宜采用超聲破碎儀破碎為止，大約5ml。用移液器吹打，充分懸浮細(xì)胞后，將離心管放到盛有的冰塊的燒杯中。清洗并擦拭超聲破碎儀的金屬桿，然后將超聲破碎儀的金屬桿插入到離心管中，調(diào)整好位置，關(guān)上超聲破碎儀的門(mén)，打開(kāi)電源，設(shè)置程序，開(kāi)始對(duì)細(xì)菌經(jīng)行超聲破碎［17］。破碎設(shè)置：功率400W左右；工作2s；間隔8s；破碎時(shí)間10min。破碎處理后的細(xì)菌細(xì)胞，10000rpm/min離心10min。取出離心管，吸取上清液至新的離心管中，止匕即為所抽提的蛋白樣品，可用于后續(xù)操作［17］。把離心的沉淀用40山PBS懸浮，亦備用于后續(xù)SDS電泳操作。SDS電泳檢測(cè).分別將未誘導(dǎo)前的菌體懸液、誘導(dǎo)破碎后的菌體上清和誘導(dǎo)破碎后的沉淀懸浮液分別和一部分過(guò)柱純化洗脫好的蛋白與 5>±樣緩沖液按4:1混勻于微量離心管中。.將上述四個(gè)微量離心管插入水漂，沸水中煮 5min。然后立即插入冰中。樣品冷卻到室溫，5000rmp離心5min。.按要求組裝電泳裝置，并驗(yàn)漏。.配制分離膠及濃縮膠：根據(jù)目的蛋白的分子量大小，選擇合適的凝膠濃度。不同濃度的SDS分離膠的最佳分離范圍，如表5:SDS分離膠，如表6:配制12%分離膠，按順序和量（注意體積單位！）取下列溶液，在50ml的小燒杯中混合（注意Tris為pH8.8）。蛋白質(zhì)分子量范圍（KD）適宜的凝膠濃度（%）TOC\o"1-5"\h\z>100 830-100 1010-30 12<10 15表5SDS分離膠的最佳分離范圍體系組成 體積雙蒸水 3.330%Acr-Bis(29:1)(ml) 4.01.5MTris-Hcl,pH8.8(ml) 2.510%SDS(ml) 0.110%過(guò)硫酸俊(AP)溶液(ml) 0.1TEMED(山) 4總體積(山) 10表6SDS分離膠反應(yīng)體系體系組成 體積TOC\o"1-5"\h\z雙蒸水 230%Acr-Bis(29:1)(ml) 0.51.0MTris-Hcl,pH6.8(ml) 0.510%SDS(山) 4010%過(guò)硫酸俊(AP)溶液(山) 30TEMED(山) 4總體積(山) 3表7SDS濃縮膠體系加完試劑后，拿起燒杯輕輕晃動(dòng)底部，將溶液混勻后，立即用1000小移液器，緩緩把膠液注入玻璃夾縫，每次余部分膠液于槍頭內(nèi)，以免產(chǎn)生氣泡。然后在上界面用200L移液器輕輕地沿玻璃壁均勻地加蒸儲(chǔ)水，從左到右，以免造成膠面不平整，兩液面的交界處呈波浪形，然后靜置30min。倒出蒸儲(chǔ)水，并倒置玻璃裝置，盡可能把水倒盡，然后用濾紙吸去殘留的水。（2）SDS濃縮膠：見(jiàn)表7。配制5%分離膠，按順序和量（注意體積單位！）取下列溶液，在一個(gè)50ml的小燒杯中混勻（注意Tris為pH6.8）。加完后，拿起燒杯輕輕晃動(dòng)，將溶液混勻后，立刻用1000人移液器緩緩注入玻璃夾縫中，液面與玻璃上邊緣齊平。然后再慢慢插入梳子，靜置約20min。5.小心地垂直拔出梳子，用蒸儲(chǔ)水沖洗加樣孔2次，然后用濾紙吸干。電泳槽的上部倒?jié)M電泳緩沖液（約250ml,淹沒(méi)過(guò)加樣槽的液面），電泳槽的下部倒入一半電泳緩沖液（約180ml）“9】。.選取形態(tài)好的加樣孔，在一張空白紙上做好對(duì)應(yīng)的標(biāo)記，用微量移液器在靠邊緣的一個(gè)加樣槽中加入5L蛋白Marker,其它槽中加入30L自己制作的樣品。.接好電極，將電壓調(diào)至80V,待澳酚藍(lán)移到分離膠后，再調(diào)電壓至120V,電泳約2h0期間注意觀察電泳槽上部的電泳液是否有泄漏（泄漏導(dǎo)致液面下降，電流中斷）。當(dāng)澳酚藍(lán)移到距底部<0.5cniM,切斷電源。8.在一個(gè)大的培養(yǎng)皿里，準(zhǔn)備適量的考馬斯亮藍(lán)染液。 9.倒掉電泳槽中的電泳液，取下玻璃板,用刀片輕輕撬開(kāi)，用刀片沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，并在分離膠的左上角切掉一小角，以標(biāo)記樣品順序1191o然后用水稍微沖一下玻璃板，戴手套用梳子小心地把分離膠從玻璃板上剝離到培養(yǎng)皿中，蓋上蓋，在脫色搖床上染色45min。10.染色后，將染液回收，以備重復(fù)使用。在培養(yǎng)皿中加脫色液I,搖床上脫色45min。倒掉脫色液I,更換為脫色液H，搖床上脫色45min<更換新的脫色液脫色搖床上脫色過(guò)夜，至大部分藍(lán)色褪盡。 11.觀察脫色后電泳膠中的藍(lán)色帶紋。對(duì)照、尋找異常粗的帶紋，并比較其分子量，判斷是否為預(yù)期目的基因的產(chǎn)物。第三節(jié)EGF表達(dá)蛋白的純化與檢測(cè) 鍥離子金屬螯合親和層析實(shí)驗(yàn)原理金屬螯合親和層析(ImmobilizedMetal-ionAffinityChromatography),其純化原理是：組氨酸(His)的側(cè)鏈帶有1個(gè)咪晚基團(tuán)，咪晚基團(tuán)pKa值在6左右，在pH>7的條件下，咪晚基團(tuán)帶負(fù)電，容易與Ni2+離子結(jié)合，尤其是帶有6個(gè)組氨酸(6xHis)標(biāo)簽的重組蛋白對(duì)Ni2+離子具有極好的親和力。通過(guò)介質(zhì)固定Ni離子能夠選擇性地純化含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及多肽；吸附在Ni2+離子上的蛋白可以使用咪唾進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗脫分離。常用于Ni2+離子金屬螯合親和層析的介質(zhì)為NTA(Nitilotriaceticacid)。鍥離子有六個(gè)螯合價(jià)位，NTA螯合了四價(jià)，剩余兩價(jià)與蛋白質(zhì)上的組氨酸結(jié)合(如下圖所示)?？扇苄?xHis重組蛋白純化實(shí)驗(yàn)方法緩沖液配制（使用0.45小睡器過(guò)濾）.緩沖液A（平衡緩沖液）：1L20mMNa2HPO4.2H2O 3.56g500mMNaCl 29.2g20mMImidazole 2.04g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至1L。.緩沖液B（洗脫緩沖液）：0.5L20mMNa2HPO4.2H2O 1.78g500mMNaCl 14.6g500mMImidazole 17.02g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至0.5L。樣品制備.菌體收集：5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體，棄上精液；.菌體重懸：加入10-20ml的緩沖液A（每升培養(yǎng)液約加15ml）,通過(guò)震蕩充分懸浮細(xì)胞；.超聲波破碎：將細(xì)胞混懸液置于一個(gè)合適的小燒杯（也可用其它合適的器皿）中，在冰上超聲波破碎（約500W,破2s停2s,總時(shí)長(zhǎng)15分鐘）；.菌體破碎后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上精液（棄沉淀），使用0.45仙m濾器過(guò)濾后用于鍥柱純化（取10'樣品用千之后的SDS檢測(cè)）。Ni-NTA預(yù)裝柱純化6xHis重組蛋白.取一根Ni-NTA預(yù)裝柱（1ml）,分別用10ml三蒸水和10ml緩沖液A洗滌柱子，流速為1-2ml/min；.將過(guò)濾好的細(xì)胞上精液以0.5ml/min流速上樣到鍥柱中（期間，取10口穿柱液樣品用于之后的SDS檢測(cè)）;.用15ml緩沖液A洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min；.用5ml緩沖液B洗脫重組蛋白，流速1ml/min,1ml/管收集洗脫液（將每個(gè)收集管編管并每管取10I樣品用干之后的SDS檢測(cè)）；

.用5ml緩沖液A再次洗滌柱子.用5ml三蒸水洗滌柱子；.用2ml20%乙醇洗滌柱子，封閉，以備下次使用。注：此方法是通用的方法，但是未必能得到較好的純化效果，可選擇使用咪唾濃度梯度進(jìn)行洗脫（如分別含有50mM,100mM,300mM,500mM咪唾的緩沖液B）或者使用？KTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行更為精確的梯度洗脫。SDS檢測(cè)純化效果配制10-15%的SDS對(duì)上述收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將重組蛋白純度和濃度較高的收集管中的樣品標(biāo)記保存。6xHis重組蛋白包涵體純化與復(fù)性某些重組蛋白在表達(dá)的過(guò)程中由于缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵（一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，高級(jí)結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤），從而水不溶性且致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，這種形式稱(chēng)為包涵體（InclusionBodies,IB）。包涵體主要含有重組蛋白，但同時(shí)含有一些細(xì)菌成分，如核糖體元件、 RNA聚合酶、外膜蛋白、質(zhì)粒DNA、以及脂體、脂多糖等。較強(qiáng)的變性劑如尿素（8M）、鹽酸月瓜（GdnHCl6M）通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種次級(jí)鍵， 使多肽伸展而溶于水中。如果重組蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，則將包涵體變性溶解后（加入>=6M鹽酸月瓜或>=8M尿素）進(jìn)行鍥離子金屬螯合親和純化。此純化過(guò)程與可溶性6xHis重組蛋白的純化方法相同，只是在緩沖液A和B中都加入同樣濃度的變性劑（6M鹽酸月瓜或8M尿素）。要得到有活性的重組蛋白，必須對(duì)純化得到的變性重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，但復(fù)性過(guò)程的收率往往很低。一般說(shuō)來(lái)，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。包涵體的純化通常包括包涵體的分離、洗滌、溶解、鍥柱親和純化以及蛋白質(zhì)復(fù)性等步驟（注：也可在變復(fù)性之后進(jìn)行親和純化）。緩沖液配制（使用0.45小屣器過(guò)濾）①.包涵體洗滌緩沖液:100ml20mMNa20mMNa2HPO4.2H2O0.356g500mMNaCl500mMNaClTOC\o"1-5"\h\z2M尿素 12g1mMEDTA 0.03gTritonX-100（2%） 2ml用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至100ml。②.變性緩沖液A（平衡緩沖液，也作為包涵體溶解緩沖液）：100ml20mMNa2HPO4.2H2O 0.356g500mMNaCl 2.92 g20mMImidazole 0.2 g8M尿素 48g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至100ml③.變性緩沖液B（洗脫緩沖液）：50ml20mMNa2HPO42H2O 0.178g500mMNaCl 1.46g500mMImidazole 1.7g8M尿素 24g用HCl（6M）調(diào)節(jié)pH至7.4,定容至50ml。包涵體的分離、洗滌、溶解.菌體收集：5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集細(xì)胞，棄上清；.菌體重懸：加入10-20ml的包涵體洗滌緩沖液（每升培養(yǎng)液約加15ml）,通過(guò)震蕩充分懸浮細(xì)胞；.超聲波破碎：將細(xì)胞混懸液置于一個(gè)合適的小燒杯（也可用其它器皿）中，在冰上超聲波破碎（約500W,破2s停2s,總時(shí)長(zhǎng)15分鐘）；.菌體破碎后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集沉淀（棄上清液，沉淀為包涵體）；.包涵體的洗滌：加入10-20ml的包涵體洗滌緩沖液震蕩重懸包涵體，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集沉淀（棄上