淋球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

淋球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷A.1標(biāo)本的采集取材部位正確與否以及采集的標(biāo)本質(zhì)量的好壞對(duì)病原學(xué)檢測(cè)的可靠性十分重要。淋球菌的易感細(xì)胞是柱狀上皮細(xì)胞。男性尿道舟狀窩及女性宮頸外膜和陰道壁為復(fù)層扁平上皮，不是淋球菌的易感部位。A.1.1取材拭子藻酸鈣拭子、普通棉拭子及滌綸拭子均可采用。A.1.2取材部位應(yīng)根據(jù)患者的年齡、性別、性接觸方式及臨床表現(xiàn)決定標(biāo)本采集的適合部位。同一患者行多部位取材可增加檢出陽性率。對(duì)男性異性戀患者，一般僅采集尿道標(biāo)本，有口交史者加取咽部標(biāo)本；對(duì)男男性接觸患者應(yīng)采集尿道、直腸及咽部標(biāo)本；對(duì)女性患者常規(guī)采集宮頸標(biāo)本，必要時(shí)從尿道、直腸、咽部、前庭大腺和尿道旁腺取材；對(duì)幼女采集陰道分泌物；對(duì)播散性淋球菌感染者，除泌尿生殖道標(biāo)本外，還可采集血液、關(guān)節(jié)液或皮損標(biāo)本。對(duì)新生兒眼炎患者采集眼結(jié)膜分泌物，對(duì)其母親采集宮頸、尿道或直腸標(biāo)本。A.1.3取材方法從不同的解剖部位取材，有一些特殊的注意事項(xiàng)及方法：（1）尿道：對(duì)男性患者，先用生理鹽水清洗尿道口，將男用取材拭子插入尿道內(nèi)2cm-3cm，稍用力轉(zhuǎn)動(dòng)，保留數(shù)秒鐘再取出，以采集到黏膜上皮細(xì)胞。對(duì)女性患者，可抵著恥骨聯(lián)合輕輕按摩尿道后，用同男性相似的方法取材。（2）宮頸：取材前用溫水或生理鹽水濕潤擴(kuò)陰器，應(yīng)避免使用防腐劑和潤滑劑，因?yàn)檫@些物質(zhì)對(duì)淋球菌的生長有抑制作用。如果宮頸口外面的分泌物較多，先用無菌棉拭子清除過多的分泌物。將女用取材拭子插入宮頸管內(nèi)1cm～2cm，稍用力轉(zhuǎn)動(dòng)，保留10s～30s后取出。（3）直腸：將取材拭子插入肛管2cm～3cm，向側(cè)方用力，避免接觸糞團(tuán)，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中取出分泌物。如果拭子碰到糞團(tuán)，應(yīng)更換拭子重新取材。（4）陰道：對(duì)子宮切除的婦女和青春期前女孩可采集陰道標(biāo)本。將取材拭子置于陰道后穹隆10s~15s，采集陰道分泌物。如果處女膜完整，則從陰道口取材。（5）咽部：從咽后壁或扁桃體隱窩采集分泌物。（6）其他部位：血液標(biāo)本抽取后可立即接種于不含多茴香腦磺酸鈉（SPS）的血液培養(yǎng)基上，或?qū)⒔?jīng)肝素抗凝的血液離心，取白細(xì)胞層接種于淋球菌選擇性固體培養(yǎng)基上。皮損標(biāo)本可用針吸、鉆孔或刀片刮取的方法采集。關(guān)節(jié)液可用針吸方法采集并作肝素化處理，以防凝結(jié)成塊。A.1.4標(biāo)本的運(yùn)送淋球菌的抵抗力弱，對(duì)熱敏感，不耐干燥。取材后標(biāo)本若不能立即接種，需采用運(yùn)送系統(tǒng)。Amies培養(yǎng)基及Stuart培養(yǎng)基為常用的兩種非營養(yǎng)型運(yùn)送培養(yǎng)基。置于非營養(yǎng)型運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在12h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，接種于選擇性培養(yǎng)基，分離陽性率可達(dá)90%以上。超過24h則分離陽性率下降。A.2實(shí)驗(yàn)室診斷方法淋球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要有：=1\*GB3①涂片染色直接顯微鏡檢查，觀察淋球菌的形態(tài)特征；=2\*GB3②分離培養(yǎng)淋球菌；=3\*GB3③直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中淋球菌細(xì)胞成分如抗原或DNA。A.2.1直接顯微鏡檢查最常用的方法是分泌物涂片作革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察淋球菌細(xì)胞形態(tài)。A.2.1.1涂片固定：取材后將拭子在玻片上稍用力滾動(dòng)一下，制成薄而均勻的涂片，自然干燥后將涂片（涂膜面向上）迅速通過火焰2～3次，加熱固定。應(yīng)避免加熱過度使細(xì)胞形態(tài)扭曲。A.2.1.2革蘭染色：包括以下四個(gè)步驟：=1\*GB2⑴將結(jié)晶紫溶液鋪滿在涂片的涂膜面上，染色1min，流水輕輕沖洗。=2\*GB2⑵將碘液鋪滿涂膜面上，染色1min，流水輕輕沖洗。=3\*GB2⑶用乙醇或丙酮脫色，至涂膜無藍(lán)色脫下為止。一般需10s～20s（時(shí)間長短取決于涂片的厚薄，應(yīng)避免過度脫色），流水輕輕沖洗。=4\*GB2⑷用堿性復(fù)紅或沙黃染液復(fù)染1min，流水沖洗后用吸水紙輕輕吸干。A.2.1.3結(jié)果觀察：在光學(xué)顯微鏡（1000×油鏡下）下檢查涂片。檢查時(shí)注意觀察細(xì)胞類型（如上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞），病原體的染色特性（革蘭陽性或陰性）、形狀（球狀或桿狀）及位置（細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外）等。淋球菌為革蘭陰性菌，常成對(duì)排列，菌體呈腎形，兩菌長軸平行，接觸面平坦或稍凹，位于中性粒細(xì)胞內(nèi)。A.2.1.4結(jié)果報(bào)告：中性粒細(xì)胞內(nèi)見到形態(tài)典型的成對(duì)的革蘭陰性雙球菌為陽性；中性粒細(xì)胞外見到形態(tài)典型的革蘭陰性雙球菌為可疑；有或無中性粒細(xì)胞但無革蘭陰性雙球菌為陰性（可僅報(bào)告中性粒細(xì)胞數(shù)）。A.2.1.5臨床意義：革蘭染色的敏感性和特異性取決于標(biāo)本的類型。對(duì)來自男性淋菌性尿道炎患者的尿道分泌物標(biāo)本，其敏感性及特異性可高達(dá)95%～99%，具診斷價(jià)值。但檢測(cè)宮頸標(biāo)本、無癥狀男性尿拭子及取自直腸的涂片時(shí)，其敏感性僅40%～70%。革蘭染色的特異性較高，宮頸標(biāo)本如取材正確，沒有陰道分泌物污染，檢查見到形態(tài)典型的細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌，則支持淋病的診斷。不推薦用革蘭染色直接顯微鏡檢查診斷直腸和咽部淋球菌感染，亦不能用于療效判斷。如果在中性粒細(xì)胞外見到形態(tài)典型的革蘭陰性雙球菌，需做培養(yǎng)進(jìn)行確證。A.2.2淋球菌的分離培養(yǎng)A.2.2.1培養(yǎng)基：分離淋球菌一般選用營養(yǎng)豐富的選擇性培養(yǎng)基。常用的選擇性培養(yǎng)基有Thayer-Martin（T-M）培養(yǎng)基、含抗生素的血液瓊脂或巧克力瓊脂培養(yǎng)基?？少徺I商品化的培養(yǎng)基或?qū)嶒?yàn)室自配，培養(yǎng)基應(yīng)密封在塑料袋中，于4℃冰箱貯存，貯存時(shí)間不應(yīng)超過3周，時(shí)間過久則分離率降低。A.2.2.2接種標(biāo)本：取材后標(biāo)本應(yīng)盡可能及早接種。培養(yǎng)基應(yīng)先置于室溫中預(yù)溫。將取材的拭子轉(zhuǎn)動(dòng)涂布于平皿的上1/4范圍，然后用接種環(huán)分區(qū)劃線，以保證獲得較純的單個(gè)菌落。A.2.2.3培養(yǎng)條件：接種標(biāo)本后，立即將平皿置于36℃、含5%～10%CO2、濕潤（70%濕度）的環(huán)境中培養(yǎng)。淋球菌為需氧菌，但初代分離需要CO2。CO2環(huán)境可由CO2培養(yǎng)箱、CO2產(chǎn)氣袋或燭缸提供。使用燭缸時(shí)，應(yīng)使用白色、無芳香味的無毒蠟燭。在燭缸底部放些浸水棉球以保持一定的濕度。A.2.2.4觀察結(jié)果：培養(yǎng)24h后檢查平皿，此時(shí)沒有菌生長的平皿應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至48h，仍無菌生長才可丟棄，作為淋球菌培養(yǎng)陰性的報(bào)告。對(duì)選擇性培養(yǎng)基上分離的可疑菌落應(yīng)作進(jìn)一步鑒定。A.2.3淋球菌的鑒定A.2.3.1初步鑒定：菌落特征、氧化酶試驗(yàn)和革蘭染色是初步鑒定淋球菌的三個(gè)主要依據(jù)。A.2.3.1.1菌落：選擇性培養(yǎng)基上分離出的淋球菌菌落大小及形態(tài)隨培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間的不同可有差異。一般而言，在巧克力培養(yǎng)基平皿上生長24h時(shí)直徑大約為0.5mm～1mm，呈圓形、凸起、濕潤、光滑、半透明或灰白色菌落，通常有黏性。培養(yǎng)48h后菌落直徑可達(dá)3mm，邊緣平滑或呈鋸齒狀，表面粗糙。A.2.3.1.2氧化酶試驗(yàn)：淋球菌具有氧化酶，它產(chǎn)生的氧離子能將氧化酶試劑氧化成醌類化合物，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。=1\*GB2⑴試劑：有兩種：鹽酸四甲基對(duì)苯二胺及鹽酸二甲基對(duì)苯二胺，前者更敏感。工作液為0.5%～1%水溶液。=2\*GB2⑵方法：將氧化酶試劑滴加于可疑菌落上，觀察顏色變化。也可先將試劑滴在一小張濾紙上，然后用白金耳或塑料接種環(huán)挑取可疑菌落與之接觸；或先將菌落涂在濾紙上，再滴加試劑，觀察有無顏色變化。=3\*GB2⑶結(jié)果在10s～15s內(nèi)出現(xiàn)深紫紅色（二甲基對(duì)苯二胺）或深紫蘭色（四甲基對(duì)苯二胺）即為陽性反應(yīng)。=4\*GB2⑷注意事項(xiàng)：氧化酶試劑對(duì)細(xì)胞有毒性，可迅速殺死淋球菌。因此，需保留菌株時(shí)應(yīng)注意不要將試劑滴于全部可疑菌落上，留一部分菌落作轉(zhuǎn)種。=5\*GB2⑸臨床意義：淋球菌氧化酶試驗(yàn)為陽性，但氧化酶反應(yīng)并非特異性試驗(yàn)。所有奈瑟菌屬細(xì)菌及許多其他細(xì)菌，包括多數(shù)弧菌、布氏菌屬、綠膿桿菌及嗜血桿菌屬等氧化酶反應(yīng)亦呈陽性。如氧化酶陰性，一般可排除淋球菌。A.2.3.1.3革蘭染色：取單個(gè)可疑菌落制備涂片作革蘭染色，在顯微鏡下檢查。24h的新鮮菌落可見到呈典型腎形的革蘭陰性雙球菌（約占25%），其余呈單球、四聯(lián)或八疊形。超過48h的較老培養(yǎng)物，因細(xì)胞自溶，革蘭染色常難以說明問題。A.2.3.2確診試驗(yàn)：對(duì)于取自泌尿生殖道的標(biāo)本，在選擇性培養(yǎng)基上分離出氧化酶陽性的革蘭陰性雙球菌，一般可診斷為淋球菌，準(zhǔn)確性98%。但對(duì)取自泌尿生殖道以外部位的標(biāo)本或涉及醫(yī)療法律案例的分離株，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)的菌株經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)或熒光抗體試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定、確證。A.2.3.2.1糖發(fā)酵試驗(yàn)：該試驗(yàn)檢測(cè)奈瑟球菌分解特定糖類（葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖）而產(chǎn)酸的能力。根據(jù)淋球菌僅分解葡萄糖，腦膜炎球菌分解葡萄糖和麥芽糖等可將淋球菌與其它奈瑟球菌加以鑒別。=1\*GB2⑴試劑：配制20%的葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，過濾滅菌。配制緩沖平衡鹽指示溶液（BSS）：每1L中含磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.4g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.1g、氯化鉀（KCl）8.0g、酚紅0.6g、pH7.1～7.2。過濾滅菌，貯于4℃?zhèn)溆谩?2\*GB2⑵方法：WHO推薦的微量試管法：=1\*GB3①取在非選擇性（不含抗生素）巧克力瓊脂或血液瓊脂培養(yǎng)基上過夜生長的純培養(yǎng)淋球菌（2接種環(huán)），在0.4mLBSS中制成濃厚菌懸液。=2\*GB3②取5支小試管，在1～4管中分別加入20%過濾滅菌的葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖各0.05mL。第5管不加糖，作為陰性對(duì)照管。=3\*GB3③每管加入0.1mLBSS。=4\*GB3④每管加0.05mL菌懸液，充分混勻。置37℃水浴箱中孵化4h，觀察結(jié)果。=3\*GB2⑶結(jié)果觀察：淋球菌僅發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵其他糖類。僅葡萄糖管顏色由紅變?yōu)辄S色為淋球菌。=4\*GB2⑷注意事項(xiàng)：用于試驗(yàn)的糖類純度要高，尤其是麥芽糖應(yīng)為分析純級(jí)。糖發(fā)酵試驗(yàn)中常因雜菌污染導(dǎo)致假陽性，或培養(yǎng)物過老自溶而導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。因此，待測(cè)菌應(yīng)為純培養(yǎng)物，不能用選擇性培養(yǎng)基上的初代分離菌（可能含有雜菌）。此外，菌懸液濃度要足夠高。=5\*GB2⑸臨床意義：選擇性培養(yǎng)基上分離出的氧化酶陽性、革蘭陰性的雙球菌，若糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性可確定為淋球菌。糖發(fā)酵試驗(yàn)的特異性為99%～100%，某些淋球菌菌株尤其是AHU－分離株反應(yīng)弱，可呈現(xiàn)陰性葡萄糖反應(yīng)，需用另外的試驗(yàn)加以鑒定。麥芽糖陰性的腦膜炎球菌也會(huì)被誤鑒定為淋球菌，對(duì)泌尿生殖道外的分離株最好采用一種以上的鑒定方法。A.2.3.2.2熒光抗體染色法：抗淋球菌主要外膜蛋白=1\*ROMANI的單克隆熒光抗體與淋球菌結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可見到發(fā)特異熒光的淋球菌。=1\*GB2⑴試驗(yàn)方法：用接種環(huán)取數(shù)個(gè)菌落（可用初代分離菌）涂布于玻片上，加一滴生理鹽水，制備成涂片，干燥后加熱固定。將30L熒光抗體試劑加于涂膜上，放于一濕盒中，置37℃15min。用蒸餾水輕輕沖洗涂片，洗去未結(jié)合的抗體。涂片置空氣中干燥，加一滴封固液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。=2\*GB2⑵結(jié)果觀察：在熒光顯微鏡下見到發(fā)蘋果綠色熒光的雙球菌為陽性。=3\*GB2⑶注意事項(xiàng)：加試劑后的涂片應(yīng)放在濕盒內(nèi)以防干燥，否則干燥的熒光抗體附著在玻片上會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光。封固劑中甘油的純度要高，否則其產(chǎn)生的自發(fā)熒光會(huì)影響結(jié)果的正確判斷。=4\*GB2⑷臨床意義：選擇性培養(yǎng)基上分離出的氧化酶陽性、革蘭陰性的雙球菌，若熒光抗體染色陽性可確定為淋球菌。但市售的某些抗淋球菌熒光抗體也可和腦膜炎球菌及其他奈瑟球菌起交叉反應(yīng)，也有少數(shù)淋球菌不與所用試劑起反應(yīng)。A.3培養(yǎng)基A.3.1Thayer-Martin（T-M）培養(yǎng)基A.3.1.1成分：T-M培養(yǎng)基的組成包括：=1\*GB3①GC基礎(chǔ)培養(yǎng)基；=2\*GB3②血紅蛋白粉；=3\*GB3③VCNT抑菌劑（含萬古霉素、多粘菌素、三甲氧芐胺嘧啶和制霉菌素）；=4\*GB3④Iso-Vitalex增菌劑。A.3.1.2配制方法：以配制500ml培養(yǎng)基為例。=1\*GB2⑴稱取GC瓊脂粉18g，置一燒瓶中，加235ml蒸餾水，搖勻后置沸水浴15min～30min，使瓊脂完全溶解。=2\*GB2⑵稱取血紅蛋白粉5g，加于乳缽內(nèi)，用250ml蒸餾水分次研磨溶解后，置沸水浴15min～30min。=3\*GB2⑶將上述兩種溶液置于121℃高壓滅菌15min，冷卻至50℃，在無菌條件下將血紅蛋白溶液緩慢加入到瓊脂液內(nèi)，棄去可能存在的血紅蛋白沉渣。=4\*GB2⑷取1小瓶Iso-Vitalex增菌劑，用所附的一小瓶稀釋液溶解后加入步驟=3\*GB2⑶所配的混合液中，邊加邊搖。=5\*GB2⑸取一小瓶VCNT抑菌劑，用5ml無菌蒸餾水溶解后加入步驟=4\*GB2⑷所配的混合液中，邊加邊搖。=6\*GB2⑹在無菌條件下將配好的培養(yǎng)基分裝入無菌平皿中，待凝固后，置塑料袋封存，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。A.3.2血液瓊脂培養(yǎng)基A.3.2.1成分：包括：GC基礎(chǔ)培養(yǎng)基；脫纖維羊血。A.3.2.2配制方法：以配制500ml培養(yǎng)基為例。=1\*GB2⑴取GC瓊脂粉18g，置一燒瓶中，加