醫(yī)院抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求（2019年版）

第第頁醫(yī)院抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求（2019年版）目錄1范圍 22術(shù)語和定義 23常規(guī)藥敏試驗(yàn)的藥物選擇和報(bào)告 44藥敏試驗(yàn)方法 75各種屬細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 126質(zhì)量控制（Qualitycontrol，QC） 177商品化藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證 19附錄A（資料性附錄）臨床各種屬細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件 23附錄B（資料性附錄）不常見苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌藥敏試驗(yàn)折點(diǎn) 27范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了臨床抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求，包括常規(guī)藥敏試驗(yàn)的藥物選擇和報(bào)告、藥敏試驗(yàn)方法、各種屬細(xì)菌藥敏試驗(yàn)、常見菌特殊耐藥表型檢測、藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制、商品化藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證。本標(biāo)準(zhǔn)適用于開展臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)的各級臨床實(shí)驗(yàn)室。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。 抗微生物藥物敏感性試驗(yàn) Antimicrobialsusceptibilitytesting指檢測微生物（本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)特指細(xì)菌）對抗微生物藥物（本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)特指抗菌藥物）的體外敏感性，以指導(dǎo)臨床合理選用藥物的微生物學(xué)試驗(yàn)，簡稱藥敏試驗(yàn)。 最低抑菌濃度 Minimalinhibitoryconcentration；MIC指在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測試驗(yàn)中能抑制肉眼可見的微生物生長的最低抗菌藥物濃度。 折點(diǎn) Breakpoint能預(yù)測臨床治療效果，用以判斷敏感、中介、劑量依賴型敏感、耐藥、非敏感的最低抑菌濃度（MIC）或者抑菌圈直徑（mm）的數(shù)值。 敏感 Susceptible；S當(dāng)抗菌藥物對分離株的MIC值或抑菌圈直徑處于敏感范圍時，使用推薦劑量進(jìn)行治療，該藥在感染部位通常達(dá)到的濃度可抑制被測菌的生長，臨床治療可能有效。 中介 Intermediate；I當(dāng)菌株的MIC值或抑菌圈直徑處于中介時，該數(shù)值接近藥物在血液和組織中達(dá)到的濃度，從而治療反應(yīng)率低于敏感菌群。該分類意味著采用高于常規(guī)劑量治療時或在藥物生理濃集的部位，臨床治療可能有效。該分類同樣可作為“緩沖域”，以防止由微小、不可控的技術(shù)因素導(dǎo)致的重大偏差，尤其是毒性范圍較窄的藥物。 劑量依賴型敏感 Susceptible-dosedependent；SDD指細(xì)菌菌株對抗菌藥物的敏感性依賴于抗菌藥物的劑量。當(dāng)某種藥物對菌株的MIC或抑菌圈直徑在SDD范圍時，臨床可通過提高劑量和（或）增加給藥頻率等修正給藥方案以達(dá)到臨床療效。 耐藥 Resistant；R當(dāng)抗菌藥物對分離株的MIC值或抑菌圈直徑處于該分類范圍時，使用常規(guī)治療方案，該藥在感染部位所達(dá)到的藥物濃度不能抑制細(xì)菌的生長，和（或）被測菌株獲得特殊耐藥機(jī)制，且治療性研究顯示該藥臨床療效不確切。 非敏感 Nonsusceptible；NS對于那些因未現(xiàn)或罕現(xiàn)耐藥，而僅具有敏感折點(diǎn)的抗菌藥物，當(dāng)該藥對某分離株的MIC值高于或抑菌圈直徑低于敏感折點(diǎn)時，此分類為非敏感。 流行病學(xué)界值 Epidemiologicalcutoffvalue；ECV將微生物群體區(qū)分為有或無獲得性耐藥的MIC值或抑菌圈直徑，是群體敏感性的上限。根據(jù)ECV，可將菌株分為野生型和非野生型。 野生型 Wild-type；WT根據(jù)ECV值，將抗菌藥物（包括抗真菌藥物）評估中未獲得耐藥機(jī)制或無敏感性下降的菌株定義為野生型。非野生型 Non-wild-type；NWT根據(jù)ECV值，將抗菌藥物（包括抗真菌藥物）評估中獲得了耐藥機(jī)制或存在敏感性下降的菌株，定義為非野生型。 效價(jià) Potency抗菌藥物中具有抗菌活性的成分，通過同類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定得出。單位mg/g、IU/g或用百分比表示。 基本一致性 Essentialagreement；EA指待測MIC系統(tǒng)與參考方法MIC值相差不超過1個稀釋倍數(shù)。當(dāng)待評估方法為紙片擴(kuò)散法時，不計(jì)算EA。 分類一致性 Categoricalagreement；CA指被評估藥敏方法與參考方法判斷試驗(yàn)結(jié)果為敏感、中介、耐藥的一致性。 極重大誤差 Verymajorerror；VME指將耐藥誤判為敏感，即假敏感。 重大誤差 Majorerror，ME指將敏感誤判為耐藥，即假耐藥。 小誤差 Minorerror指將中介判為敏感或耐藥、或者將耐藥或敏感判為中介。 常規(guī)藥敏試驗(yàn) Routinetest指用于臨床常規(guī)檢測的紙片擴(kuò)散法、肉湯或瓊脂稀釋法。 補(bǔ)充（非常規(guī)）藥敏試驗(yàn) Supplemental（notrouting）test指通過常規(guī)紙片擴(kuò)散法、肉湯或瓊脂稀釋法以外的方法檢測某種或某類藥物的敏感性或耐藥性，且該方法無需額外試驗(yàn)確證藥物的敏感性或耐藥性。 篩選試驗(yàn) Screeningtest提供假XX果的試驗(yàn)。當(dāng)篩查結(jié)果陽性時，需進(jìn)行附加試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。 替代藥物試驗(yàn) Surrogateagenttest當(dāng)目標(biāo)抗菌藥物的藥敏無法檢測或替代藥物的藥敏檢測性能優(yōu)于目標(biāo)藥物時，該藥物可替代目標(biāo)藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 等效藥物試驗(yàn) Equivalentagenttest某藥可預(yù)測與其密切相關(guān)的同類藥物的藥敏結(jié)果，測定該藥的藥敏試驗(yàn)可減少其他相關(guān)藥物的檢測數(shù)量以提高檢測效率。常規(guī)藥敏試驗(yàn)的藥物選擇和報(bào)告藥敏試驗(yàn)測試藥物的分組A組：對特定的菌種，常規(guī)測試并報(bào)告的基本抗菌藥物。B組：常規(guī)測試，但只選擇性報(bào)告的基本抗菌藥物，例如當(dāng)對A組同類藥物耐藥時。選擇性報(bào)告指征還包括：特定部位分離菌（如三代頭孢菌素對腦脊液中腸桿菌科菌）、混合感染、多部位感染、患者對A組藥物過敏/不耐受/無反應(yīng)、出于感染控制目的。C組：包括替代性或補(bǔ)充性的抗菌藥物。在某些醫(yī)療機(jī)構(gòu)，地方或流行菌株對A組/B組多個藥物耐藥時，需測試該組藥物；當(dāng)對基本測試藥物過敏、或測試少見細(xì)菌時、或流行病學(xué)和感染控制需要時，需測試的補(bǔ)充藥物。U組：包括那些僅僅或主要用于治療泌尿道感染的抗菌藥物。各級實(shí)驗(yàn)室結(jié)合當(dāng)?shù)夭≡V特征、藥物代表性、臨床需求和本實(shí)驗(yàn)室條件等，確定本室不同菌種/藥物測試和報(bào)告組合。綜合上述原則選擇自動化藥敏板，當(dāng)藥敏板無法滿足需求時，予以補(bǔ)充。結(jié)果解釋分類實(shí)驗(yàn)室測試和報(bào)告抗菌藥物的MIC值或抑菌圈直徑（mm）的結(jié)果，按折點(diǎn)分為:敏感（S）、劑量依賴型敏感（SDD）、中介（I）、耐藥（R）或非敏感（NS）；按ECV分為野生型（WT）或非野生型（NWT）。報(bào)告原則基本原則只有當(dāng)分離株可能有臨床意義而非定植或污染時，才可報(bào)告藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)檢測獲得性耐藥而非天然耐藥，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)明確各類菌屬的天然耐藥譜，避免將天然耐藥誤報(bào)為敏感。個別菌屬對某些藥非常敏感，或該菌引起的感染不需使用抗菌藥物時（如大腸埃希菌O157引起的腹瀉），常規(guī)不需藥敏試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室根據(jù)藥物分組、標(biāo)本類型等，選擇性報(bào)告藥敏結(jié)果。藥敏方法和折點(diǎn)的選擇針對不同藥物/菌種組合，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)乃幟舴椒?，并制定相?yīng)藥敏試驗(yàn)的操作程序（包括質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果解釋等）。實(shí)驗(yàn)室宜采用國內(nèi)、外權(quán)威機(jī)構(gòu)近兩年發(fā)布的折點(diǎn)，并每年評審本室藥敏檢測系統(tǒng)的折點(diǎn)范圍；因藥敏板條濃度范圍受限，無法采用新折點(diǎn)時，需補(bǔ)充相應(yīng)的耐藥表型檢測試驗(yàn)，且告知臨床。判定折點(diǎn)的適用性與菌種、藥敏方法、檢測條件、紙片含量、感染部位、藥物（種類、劑量、頻次、途徑）有關(guān)。當(dāng)上述條件符合相應(yīng)要求時，折點(diǎn)方適用。對于國際藥敏委員會未給出折點(diǎn)的藥物，建議采用國內(nèi)、外專家共識和權(quán)威文獻(xiàn)等進(jìn)行操作和判斷，并告知臨床。藥敏報(bào)告特殊注意事項(xiàng)腸道分離的沙門菌屬和志賀菌屬僅需報(bào)告氨芐XX、一種氟喹諾酮類藥物和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。腸道外分離的沙門菌屬，需增加測試并報(bào)告一種三代頭孢菌素，必要時測試并報(bào)告氯霉素。傷寒樣沙門菌（傷寒沙門菌和甲、乙、丙型副傷寒沙門菌）應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，腸道分離的非傷寒樣沙門菌一般不進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。沙門菌屬和志賀菌屬對第一代、第二代頭孢菌素、頭霉素和氨基糖苷類體外可能敏感，但臨床治療無效，所以不測試和報(bào)告這些藥物。苯唑XX耐藥葡萄球菌對目前可用的β-內(nèi)酰胺類（除頭孢洛林等外）均耐藥。測試青霉素和苯唑XX或頭孢西丁可以推測其它β-內(nèi)酰胺類的敏感性。腸球菌屬對氨基糖苷類（除外高濃度的氨基糖苷類）、頭孢菌素類、克林霉素和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑體外可能出現(xiàn)敏感，但臨床治療無效，不應(yīng)報(bào)告為敏感。腦脊液分離菌株，不宜常規(guī)測試和報(bào)告下列藥物：僅有口服劑型的藥物、第一代和第二代頭孢菌素（除外頭孢呋辛注射劑）和頭霉菌素類、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類。呼吸道分離株不應(yīng)測試和報(bào)告達(dá)托霉素，尿液分離株不報(bào)告氯霉素、克林霉素和紅霉素，非尿液分離株不測試和報(bào)告呋喃妥因。罕見耐藥表型、廣泛耐藥或全耐藥菌應(yīng)復(fù)核后方可發(fā)出藥敏報(bào)告。一旦確認(rèn)應(yīng)報(bào)告醫(yī)院感染控制辦公室。實(shí)驗(yàn)室保留這些菌株，以備流行病學(xué)調(diào)查或臨床追加額外的藥敏試驗(yàn)之需。報(bào)告單內(nèi)容和形式一般信息報(bào)告單包括：患者信息（姓名、年齡、性別、病歷號等）、臨床信息（如科室、臨床診斷、抗菌藥物使用、標(biāo)本類型等）、實(shí)驗(yàn)室信息（包括標(biāo)本采集時間、送檢時間、接收時間和審核報(bào)告時間、操作人和審核人雙簽名）等。藥敏試驗(yàn)細(xì)菌和藥物名稱細(xì)菌名稱應(yīng)規(guī)范化，參見細(xì)菌命名標(biāo)準(zhǔn)。宜標(biāo)注拉丁文名稱。藥物名稱應(yīng)使用規(guī)范的化學(xué)通用名稱，不使用商品名。宜同時顯示藥物的中英文名稱，且同一類藥物不同品種集中排列。結(jié)果呈現(xiàn)報(bào)告單應(yīng)明確列出各類藥物對該菌種的折點(diǎn)、本實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)的版本號或出版時間。若沒有折點(diǎn)而借用其他菌種折點(diǎn)或采用權(quán)威文獻(xiàn)折點(diǎn)，需備注說明。MIC法報(bào)告MIC值（單位為mg/L或μg/mL）和結(jié)果解釋；紙片擴(kuò)散法報(bào)告抑菌圈直徑值（應(yīng)為整數(shù)，單位為mm）。結(jié)果解釋根據(jù)折點(diǎn)或ECV判斷為S、I、R、SDD、NS、WT、NWT等類型。不報(bào)告替代藥物的藥敏結(jié)果。如用于判斷金黃色葡萄球菌對苯唑XX耐藥性的頭孢西丁不應(yīng)報(bào)告。特殊耐藥表型宜在報(bào)告中明確標(biāo)注特殊耐藥表型，同時對特殊耐藥表型進(jìn)行專業(yè)解釋，包括含義、機(jī)制、用藥限制和建議等。對于罕見耐藥現(xiàn)象，進(jìn)行復(fù)核，并標(biāo)示結(jié)果狀態(tài)，如復(fù)核中、已復(fù)核等。少見和矛盾耐藥表型進(jìn)行確認(rèn)。報(bào)告單備注或注釋形式性注釋：用于符號、縮寫等的詳細(xì)解釋。專業(yè)性注釋：包括概念解釋（如特殊菌天然耐藥）、臨床意義和治療建議等，專業(yè)性注釋宜有科學(xué)依據(jù)。重要性提示：如“高致病性/高傳播性”。時效性提示：如“若有疑義，請于48h內(nèi)與實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系”。管理性提示：如“需要上報(bào)傳染病卡”。免責(zé)提示：如“該結(jié)果僅對該標(biāo)本負(fù)責(zé)”，“該結(jié)果解釋宜結(jié)合患者臨床表現(xiàn)與治療反應(yīng)，僅供參考”等。醫(yī)院地址和實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系方法等。報(bào)告發(fā)放藥敏報(bào)告應(yīng)盡快發(fā)放。緊急情況應(yīng)將部分結(jié)果先行發(fā)出，如血培養(yǎng)和腦脊液等其他無菌體液培養(yǎng)的初步藥敏試驗(yàn)結(jié)果。無論提前還是延時，報(bào)告上應(yīng)顯示時間，并注明報(bào)告級別（初步報(bào)告或最終報(bào)告）。保存抗菌藥物敏感性試驗(yàn)資料，至少每年向臨床報(bào)告流行病學(xué)分析結(jié)果。藥敏試驗(yàn)方法藥敏試驗(yàn)方法的分類藥敏試驗(yàn)方法包括：稀釋法（包括瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法）、紙片擴(kuò)散法、梯度擴(kuò)散法和自動化儀器法。稀釋法是檢測抗菌藥物敏感性的定量試驗(yàn)方法，為藥敏試驗(yàn)的參考方法。稀釋法瓊脂稀釋法材料Mueller-Hinton瓊脂（Mueller-HintonAgar，MHA）按產(chǎn)品說明稱量MHA干粉。103.4Kpa、121.3℃高壓蒸汽滅菌15min。立即放至40℃～50℃水浴鍋備用。培養(yǎng)基制備完畢后室溫下（25℃）校正pH值為7.2～7.4。某些營養(yǎng)要求高的苛養(yǎng)細(xì)菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌屬等，MHA培養(yǎng)基須加入相應(yīng)補(bǔ)充物質(zhì)或使用特殊培養(yǎng)基，詳見附錄A?？咕幬锾荻认♂尶咕幬锾荻认♂屢旱恼麄€配制過程嚴(yán)格無菌操作。見光易分解的替加環(huán)素避光保存，易降解、不穩(wěn)定的藥物如頭孢克洛、氨芐XX、克拉維酸和亞胺培南現(xiàn)用現(xiàn)配。抗菌藥物粉末可采用標(biāo)準(zhǔn)品或藥廠生產(chǎn)的商品化粉末。采用分析天平稱藥，抗菌藥物的有效成分按如下公式計(jì)算：實(shí)際稱取抗菌藥物粉末重量（mg）=QUOTE實(shí)際配制抗菌藥物儲液的體積×儲液濃度（mg/L）抗菌藥物的效價(jià)（μg實(shí)際配制抗菌藥物儲液的體積（mL）=QUOTE實(shí)際稱取抗菌藥物粉末重量（mg）×抗菌藥物的效價(jià)（μg配制藥物儲液：藥物儲液的濃度不低于1000mg/L或高于待測抗菌藥物最高檢測濃度的10倍。對大多數(shù)穩(wěn)定、且不易降解的抗菌藥物，將未用完的儲液分裝至無菌小管，置于-70℃或更低溫度貯存，時限為6個月。每次使用取一管，避免反復(fù)凍融影響其活性?？咕幬飪σ旱南♂專翰捎帽侗认♂尫ㄖ苽湟幌盗兴杩咕幬餀z測梯度。含藥的MHA平皿將梯度對倍稀釋的抗菌藥物（生長對照MHA平皿加無菌水）按1:9比例加入4.2.1.1.1制備的已高壓滅菌完畢且溫度在40℃～50℃的MHA瓊脂中。將瓊脂和抗菌藥物充分混勻。傾注平皿，MHA含藥瓊脂平皿厚度為3mm～4mm。室溫放置冷卻至凝固，當(dāng)日使用或?qū)⑵矫笱b入密閉塑料袋中，置于2℃～8℃保存，貯存時限為5天。平皿使用前置室溫平衡，可置于孵箱中30min使瓊脂表面干燥。操作步驟制備初始接種菌懸液被測菌株和質(zhì)控菌株配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，約1×108CFU/mL～2×108CFU/mL，作為初始接種物，并按一定順序放入試管架。稀釋接種菌懸液用無菌肉湯或生理鹽水將初始接種物1:10稀釋，混勻后將稀釋后的接種物按排列順序分別吸取0.1mL至96孔微孔板。接種菌懸液標(biāo)記含藥MHA平皿接種點(diǎn)方向。采用多點(diǎn)接種儀或標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)等將稀釋后的接種物按順序分別接種1μL～3μL至無抗菌藥物的生長對照平皿、含梯度藥MHA平皿表面（從低濃度到高濃度）和第二塊生長對照平皿。最終菌液接種量為104CFU/點(diǎn)（點(diǎn)直徑為5mm～8mm）。平皿室溫放置至菌點(diǎn)干燥，但放置時間不超過30min。孵育置于35℃±2℃空氣環(huán)境中孵育16h～20h?？琉B(yǎng)菌的藥敏試驗(yàn)平皿孵育條件和時間見附錄A。結(jié)果判讀將平皿置于黑色、無反光背景上讀取結(jié)果。以抑制細(xì)菌肉眼可見生長的最低濃度為MIC。肉湯稀釋法材料陽離子校正的Mueller-Hinton肉湯（Cation-adjustedMueller-Hintonbroth，CAMHB）按產(chǎn)品說明稱量CAMHB干粉。103.4Kpa、121.3℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至室溫備用。培養(yǎng)基制備完畢后宜在室溫環(huán)境（25℃）校正pH值為7.2～7.4?？咕幬锾荻认♂屢嚎咕幬飪σ号渲?、保存和稀釋同瓊脂稀釋法。將配制好的梯度稀釋抗菌藥物溶液每個梯度按0.05mL/孔分裝至96孔微孔板（微量肉湯稀釋法）或按1mL/管分裝至13mm×100mm帶螺帽的試管中（宏量肉湯稀釋法），當(dāng)日使用或凍存于≤-20℃?zhèn)溆?。操作步驟制備初始接種菌懸液被測菌株和相應(yīng)質(zhì)控菌株如大腸埃希菌ATCC25922配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙海鳛槌跏冀臃N物菌懸液。稀釋接種菌懸液用4.2.2.1.1制備的CAMHB肉湯將初始接種物1:100倍稀釋（微量肉湯稀釋法）或1:150倍（宏量肉湯稀釋法）稀釋，混勻，菌液濃度約為1×106CFU/mL。接種菌懸液將稀釋后的接種物按順序依次吸取0.05mL至4.2.2.1.2步驟制備的含等量藥96孔微孔板或吸取1mL至4.2.2.1.2步驟制備的含等量藥試管中（最終接種物濃度為5×105CFU/mL）。稀釋菌液在15min內(nèi)接種完畢。同時將稀釋后的接種物接種至不含抗菌藥物的非選擇性瓊脂平皿，以檢測接種菌懸液的純度。微量肉湯稀釋法：將稀釋后的菌懸液接種至不含抗菌藥物微孔作為生長對照，同時設(shè)置不加接種菌懸液的含藥孔。宏量肉湯稀釋法：設(shè)置每一株菌的初始接種物的不含藥的生長對照管。孵育接種好的菌液和抗菌藥物混合液置于35℃±2℃孵箱中孵育16h～20h。苛養(yǎng)菌的孵育條件和時間見附錄A。接種菌懸液的菌落計(jì)數(shù)每一批試驗(yàn)應(yīng)同時進(jìn)行接種菌懸液的菌落計(jì)數(shù)，以保證微量肉湯稀釋法和宏量肉湯稀釋法的最終接種菌懸液濃度為5×105CFU/mL，具體步驟：4.2.2.2.3步驟接種完畢后，立即從質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922的生長對照孔或生長對照管吸取0.01mL。置于10mL無菌生理鹽水中（1:1000倍稀釋）?；靹蚝螅?.1mL均勻涂布在不含抗菌藥物的瓊脂平皿上（根據(jù)不同細(xì)菌生長特性選取非選擇性營養(yǎng)瓊脂平皿）。置于35℃±2℃孵箱中孵育16h～20h后觀測：若平皿生長菌落數(shù)為50CFU左右，即為最終接種細(xì)菌量為5×105CFU/mL。結(jié)果判讀以抑制細(xì)菌肉眼可見生長的最低濃度為MIC。根據(jù)生長對照孔/管菌液生長量判定生長終點(diǎn)。革蘭陽性球菌檢測氯霉素、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺和四環(huán)素時，易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，讀取拖尾現(xiàn)象開始的第一個孔的MIC值，忽略微小菌膜。若存在多孔跳孔現(xiàn)象，需重新檢測。紙片擴(kuò)散法材料MHA瓊脂按下列步驟制備MHA培養(yǎng)基：按產(chǎn)品說明書稱量MHA干粉，103.4Kpa、121.3℃高壓蒸汽滅菌15min 后放至40℃～50℃水浴。將無菌空平皿（內(nèi)徑9cm或14cm）置于超凈臺水平臺面上，晃動搖勻MHA后傾倒平皿，每塊平皿瓊脂厚度為3mm～4mm。平皿室溫冷卻后，2℃～8℃冰箱保存。pH值：紙片擴(kuò)散法使用的培養(yǎng)基pH值在室溫下為7.2～7.4。水分：進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時，MHA瓊脂表面應(yīng)濕潤，但不能有水滴，平皿蓋上不應(yīng)有水珠?？咕幬锛埰幟艏埰瑸橹睆?.35mm、吸水量為0.02mL的專用藥敏紙片。藥敏紙片使用前需室溫平衡1h～2h。紙片需密封貯存于-20℃冰箱內(nèi)。XX后的紙片可置于含干燥劑的螺口塑料或玻璃管中2℃～8℃保存，不超過1周。標(biāo)準(zhǔn)比濁管用硫酸鋇比濁管（0.5號麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管）標(biāo)定接種菌液濃度。比濁管制備方法：取0.048mol/L氯化鋇（BaCl2）[1.175%（W/V）BaCl2.2H2O]0.5mL，加到99.5mL的0.18mol/L硫酸（1%，V/V）溶液中，制成比濁管，用光徑為1cm的紫外分光光度計(jì)測定吸光度值來標(biāo)定比濁管。0.5號比濁管在625nm波長的吸光度為0.08～0.13。選取管徑與制備菌液試管相同的螺口試管，每管分裝4mL～6mL，密封，置于室溫避光環(huán)境。使用前漩渦震蕩混勻。操作步驟制備接種菌懸液被測菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于非選擇性培養(yǎng)基如血平皿，置于35℃空氣培養(yǎng)18h～24h（孵育條件參照附錄A進(jìn)行）。采用直接菌落法或肉湯增菌法制備：直接菌落法：選取孵育18h～24h后的菌落形態(tài)一致的且生長較好的3～5個菌落； 采用接種環(huán)或無菌拭子觸碰每個菌落頂部，轉(zhuǎn)移至含有4mL～5mL的胰大豆肉湯或無菌生理鹽水中。肉湯增菌法:將單個菌落接種至肉湯培養(yǎng)基，置于35℃±2℃孵育，至濁度接近規(guī)定的濃度（通常孵育2h～6h）。采用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷峁埽s1×108CFU/mL～2×108CFU/mL），也可用電子比濁儀。接種平皿用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去。在MHA平皿表面均勻涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平皿60°，最后沿平皿內(nèi)瓊脂邊緣涂抹一周。校正濃度后的菌液在15min內(nèi)接種完畢。貼抗菌藥物紙片接種菌懸液后的MHA平皿置室溫下干燥3min～5min。用紙片分配器或無菌鑷子將抗菌藥物紙片緊密貼于平皿。各紙片中心相距≥24mm。紙片貼上后不應(yīng)再移動。孵育貼上紙片15min內(nèi)，須把平皿倒置放于35℃孵箱中孵育16h～18h。對于某些特殊抗菌藥物如苯唑XX或萬古霉素，孵育時間需XX至24h。苛養(yǎng)菌等孵育環(huán)境和時間見附錄A。結(jié)果判讀將平皿置于黑色背景下，利用反射光從平皿背面用游標(biāo)卡尺或直尺測量無明顯細(xì)菌生長區(qū)域的直徑（含紙片），即抑菌圈直徑，取整數(shù)位，單位為mm。培養(yǎng)基若加入血液，須打XX皿蓋，借助反射光，從正面測量抑菌圈直徑。測量萬古霉素、利奈唑胺和苯唑XX等的抑菌圈時，使用透射光。測量甲氧芐啶和磺胺類藥物的抑菌圈時，可忽視輕微生長（20%或較少菌苔生長）而測量較明顯抑制的邊緣。梯度擴(kuò)散法梯度擴(kuò)散法是一種結(jié)合稀釋法和紙片擴(kuò)散法原理對抗菌藥物敏感性直接定量的藥敏試驗(yàn)方法。材料梯度擴(kuò)散法條商品化梯度擴(kuò)散法條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的、濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別刻度。梯度擴(kuò)散法條抗菌藥物濃度梯度可覆蓋有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍。培養(yǎng)基同紙片擴(kuò)散法。操作步驟待測細(xì)菌的菌懸液配制和接種方法同紙片擴(kuò)散法。待平皿干燥后，用鑷子將梯度擴(kuò)散法條有MIC刻度面朝上，貼在已接種被測菌株的平皿表面，梯度擴(kuò)散法條全長與瓊脂表面緊密接觸，試條貼好后不應(yīng)移動。置于35℃±2℃孵箱中孵育16h～18h。結(jié)果判讀讀取橢圓形抑菌圈與梯度擴(kuò)散法條交界點(diǎn)的讀值，即為待測抗菌藥物的MIC值。自動化儀器法0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙旱呐渲品椒ㄍ埰瑪U(kuò)散法，按照各儀器說明書對菌懸液進(jìn)行稀釋。不同種屬細(xì)菌稀釋后的菌懸液，加入對應(yīng)的商品化試驗(yàn)板條，上機(jī)進(jìn)行檢測。各種屬細(xì)菌藥敏試驗(yàn)各種屬細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件臨床常見快速生長非苛養(yǎng)菌、常見苛養(yǎng)菌、不常見菌、潛在生物恐怖病原菌、諾卡菌屬和其他需氧放線菌、厭氧菌的藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件見附錄A。常見菌各種屬細(xì)菌藥敏折點(diǎn)參照參考文獻(xiàn)[1]。常見菌特殊耐藥表型檢測β-內(nèi)酰胺酶表型檢測臨床報(bào)告葡萄球菌屬、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌和一些厭氧菌對青霉素的敏感性前，應(yīng)進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶的補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)（方法見表1）。青霉素可用于預(yù)測上述種屬對青霉素酶不穩(wěn)定的青霉素類的敏感性，包括青霉素、阿莫XX、氨芐XX、羧芐XX、替卡XX、阿洛XX和哌拉XX等。β-內(nèi)酰胺酶表型檢測檢測β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌種流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌和一些厭氧菌金黃色葡萄球菌（當(dāng)青霉素MIC≤0.12mg/L或紙片擴(kuò)散法抑菌圈直徑≥29mm時）金黃色葡萄球菌和包括路登葡萄球菌在內(nèi)的凝固酶陰性葡萄球菌（當(dāng)青霉素MIC≤0.12mg/L或紙片擴(kuò)散法抑菌圈直徑≥29mm時）檢測方法直接頭孢硝噻吩紙片法青霉素紙片擴(kuò)散法（青霉素抑菌圈-邊緣試驗(yàn)）可誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)培養(yǎng)基-MHA-藥物濃度頭孢硝噻吩紙片青霉素紙片（10單位）=1\*GB3①青霉素（10單位）或頭孢西?。?0μg）紙片=2\*GB3②頭孢硝噻吩紙片接種孵育16h～20h的菌落或細(xì)菌懸液標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作步驟誘導(dǎo)生長（孵育16h～18h后的MHA平皿或血平皿上青霉素或頭孢西丁紙片邊緣的生長物）孵育條件室溫環(huán)境35℃±2℃空氣環(huán)境室溫環(huán)境孵育時間1h或遵照商品說明書16h～18h1h或遵照商品說明書結(jié)果讀取b=1\*GB3①陽性：紙片由黃色變?yōu)榧t色或粉色=2\*GB3②陰性：紙片未變色，仍為黃色=1\*GB3①陽性：抑菌圈邊緣銳利或如同“絕壁”=2\*GB3②陰性：抑菌圈邊緣模糊或如同“海灘”=1\*GB3①陽性：紙片由黃色變?yōu)榧t色或粉色=2\*GB3②陰性：紙片未變色，仍為黃色；金黃色葡萄球菌采用此法檢測，結(jié)果為陰性時需增加青霉素抑菌圈-邊緣試驗(yàn)確認(rèn)是否產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶質(zhì)控菌株陽性：金黃色葡萄球菌ATCC29213；陰性：金黃色葡萄球菌ATCC25923。葡萄球菌屬對苯唑XX耐藥性檢測檢測葡萄球菌屬對苯唑XX敏感性的方法見表2。苯唑XX或頭孢西丁的藥敏結(jié)果適用于其他對青霉素酶穩(wěn)定的青霉素類如氯唑XX、雙氯XX、氟氯XX、甲氧XX和萘夫XX。苯唑XX或頭孢西丁藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感，即對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物、頭孢菌素類和碳青霉烯類敏感。一旦檢測為苯唑XX耐藥，即對所有β-內(nèi)酰胺類（頭孢洛林除外）藥物耐藥。苯唑XX耐藥葡萄球菌表型檢測方法葡萄球菌分類苯唑XX頭孢西丁苯唑XX鹽瓊脂篩選試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法（1μg）MIC法紙片擴(kuò)散法（30μg）MIC法金黃色葡萄球菌不可檢測可檢測可檢測可檢測可檢測路登葡萄球菌不可檢測可檢測可檢測可檢測不可檢測假中間葡萄球菌可檢測可檢測不可檢測不可檢測不可檢測萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌（VancomycinintermediateS.aureus，VISA）、萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（VancomycinresistantS.aureus，VRSA）和萬古霉素耐藥腸球菌（VancomycinresistantEnterococcus，VRE）表型檢測，見表3。金黃色葡萄球菌和腸球菌屬對萬古霉素的耐藥性檢測檢測萬古霉素的耐藥性菌種金黃色葡萄球菌a腸球菌屬檢測方法MIC法紙片擴(kuò)散法bMIC法孵育時間24h24h24h結(jié)果判讀=1\*GB3①VSSA：≤2mg/L=2\*GB3②VISAc：4mg/L～8mg/L=3\*GB3③VRSAc：≥16mg/L=1\*GB3①敏感：≥17mm=2\*GB3②中介：15mm～16mm，需進(jìn)一步測定MIC值。若MIC值仍為中介，即8mg/L～16mg/L，需進(jìn)一步確認(rèn)菌株是否為鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌，因該兩種細(xì)菌對萬古霉素通常中介或耐藥。=3\*GB3③VRE：≤14mm或（和）抑菌圈內(nèi)發(fā)現(xiàn)任何生長=1\*GB3①敏感：≤4mg/L=2\*GB3②中介c：8mg/L～16mg/L=3\*GB3③VREc：≥32mg/L質(zhì)控菌株陽性：糞腸球菌ATCC51299；陰性：糞腸球菌ATCC29212。a不應(yīng)采用紙片擴(kuò)散法檢測金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥性。b在測量萬古霉素抑菌圈直徑時，用透射光仔細(xì)檢查抑菌圈內(nèi)紙片周圍是否有微小菌落或片狀輕微生長。c當(dāng)紙片擴(kuò)散法或自動化儀器法檢測出萬古霉素中介或耐藥時，需用MIC法（肉湯稀釋法或瓊脂稀釋法）進(jìn)一步確認(rèn)。誘導(dǎo)克林霉素耐藥性檢測當(dāng)葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌和β-溶血鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類如紅霉素耐藥，而對克林霉素中介或敏感時，宜進(jìn)行誘導(dǎo)克林霉素耐藥性檢測，包括紙片擴(kuò)散法（D試驗(yàn)，表4）、微量肉湯稀釋法和自動化儀器法。微量肉湯稀釋法是將4mg/L的紅霉素和0.5mg/L的克林霉素置于同一孔里，35℃±2℃空氣環(huán)境孵育18h～24h檢測后，檢測菌株是否生長。生長即為陽性，不生長為陰性。葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌和β-溶血鏈球菌的誘導(dǎo)克林霉素耐藥性檢測方法檢測誘導(dǎo)克林霉素耐藥性菌種葡萄球菌屬肺炎鏈球菌和β-溶血鏈球菌檢測方法紙片擴(kuò)散法紙片擴(kuò)散法培養(yǎng)基MHA含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的MHA或含5%（V/V）脫纖維綿羊血的TSA平皿藥物濃度紅霉素（15μg）和克林霉素（2μg）紙片紅霉素（15μg）和克林霉素（2μg）紙片接種標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作步驟紅霉素和克林霉素紙片邊緣相距15mm～26mm標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作步驟紅霉素和克林霉素紙片邊緣相距12mm孵育條件35℃±2℃空氣環(huán)境35℃±2℃的5%的CO2環(huán)境孵育時間16h～18h20h～24h結(jié)果讀取=1\*GB3①陽性：鄰近紅霉素紙片側(cè)，克林霉素抑菌圈出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象（稱為“D”抑菌圈），提示存在可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥，報(bào)告克林霉素耐藥。=2\*GB3②陰性：無“截平”現(xiàn)象，報(bào)告克林霉素敏感。常規(guī)質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923肺炎鏈球菌ATCC49619補(bǔ)充的質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌BAA-976（D試驗(yàn)陰性），金黃色葡萄球菌BAA-977（D試驗(yàn)陽性）。腸球菌屬氨基糖苷類高水平耐藥（High-levelaminoglycosideresistance，HLAR）表型檢測，見表5。腸球菌屬氨基糖苷類高水平耐藥表型檢測檢測慶大霉素高水平耐藥性鏈霉素高水平耐藥性檢測方法紙片擴(kuò)散法微量肉湯稀釋法瓊脂稀釋法紙片擴(kuò)散法微量肉湯稀釋法瓊脂稀釋法培養(yǎng)基MHABHI肉湯BHI瓊脂MHABHI肉湯BHI瓊脂藥物濃度慶大霉素（120μg）慶大霉素500mg/L慶大霉素500mg/L鏈霉素紙片（300μg）鏈霉素1000mg/L鏈霉素2000mg/L接種標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作步驟標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法操作步驟吸取10μL的0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙旱江傊砻鏄?biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作步驟標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法操作步驟吸取10μL的0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙旱江傊砻娣跤龡l件35℃±2℃空氣環(huán)境35℃±2℃空氣環(huán)境35℃±2℃空氣環(huán)境35℃±2℃空氣環(huán)境35℃±2℃空氣環(huán)境35℃±2℃空氣環(huán)境孵育時間16h～18h24h24h16h～18h24h～48h24h～48h結(jié)果讀取=1\*GB3①耐藥：6mm，即HLAR=2\*GB3②不確定：7mm～9mm，需MIC法進(jìn)一步確認(rèn)=3\*GB3③敏感：≥10mmHLAR：微孔內(nèi)有任何生長HLAR：＞1個菌落生長=1\*GB3①耐藥：6mm，即HLAR=2\*GB3②不確定：7mm～9mm，需MIC法進(jìn)一步確認(rèn)=3\*GB3③敏感：≥10mmHLAR：微孔內(nèi)有任何生長HLAR：＞1個菌落生長質(zhì)控菌株陽性：糞腸球菌ATCC51299，陰性：糞腸球菌ATCC29212備注紙片擴(kuò)散法為篩選試驗(yàn)，不確定時宜采用MIC方法確認(rèn)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）表型檢測 ESBLs檢測適用菌種為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和奇異變形桿菌。ESBLs確證試驗(yàn)包括紙片擴(kuò)散法、MIC法（稀釋法或梯度擴(kuò)散法）。紙片擴(kuò)散法：使用每片含30μg頭孢他啶、頭孢噻肟紙片和頭孢他啶/克拉維酸（30μg/10μg）、頭孢噻肟/克拉維酸（30μg/10μg）復(fù)合物紙片進(jìn)行檢測，當(dāng)任何一種復(fù)合物紙片抑菌圈直徑比其單獨(dú)藥敏紙片抑菌圈直徑大于或等于5mm，可確證該菌株產(chǎn)ESBLs。稀釋法：使用頭孢他啶（0.25mg/L～128mg/L）、頭孢他啶/克拉維酸（0.25/4mg/L～128/4mg/L）、頭孢噻肟（0.25mg/L～64mg/L）、頭孢噻肟/克拉維酸（0.25/4mg/L～64/4mg/L）進(jìn)行檢測，當(dāng)與克拉維酸聯(lián)合藥物組的MIC小于或等于單獨(dú)藥物組MIC3個倍比稀釋度時（或比值≥8），可確證該菌株產(chǎn)ESBLs。碳青霉烯酶的表型檢測適用條件當(dāng)腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌對厄他培南（銅綠假單胞菌不適用）、亞胺培南或美羅培南中任何一種藥物中介或耐藥時，需進(jìn)行復(fù)核，并檢測該菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，以便采取感染控制措施。碳青霉烯酶表型檢測方法為改良碳青霉烯類滅活試驗(yàn)（Modifiedcarbapeneminactivationmethod，mCIM）等。銅綠假單胞菌碳僅采用mCIM試驗(yàn)，腸桿菌科細(xì)菌宜同時執(zhí)行mCIM試驗(yàn)和EDTA-mCIM（eCIM）試驗(yàn)。具體步驟血平皿過夜孵育待測菌。用1μL接種環(huán)重懸腸桿菌科細(xì)菌（銅綠假單胞菌采用10μL接種環(huán)）于2mL胰大豆肉湯（TSB）管中。當(dāng)檢測腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)酶株時，再另取一新的接種環(huán)重懸待測菌株于另一2mLTSB管中，并吸取20μL0.5MEDTA（終濃度為5mM）置于該管中。渦旋震蕩10s～15s。分別取10μg美羅培南紙片各一片置于b）步驟含和不含EDTA的TSB菌液管中，確保整個紙片浸沒在菌懸液中。35℃±2℃空氣孵育4h±15min。待孵育時間接近4h時，采用生理鹽水制備大腸埃希菌ATCC25922的0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海?5min內(nèi)按照常規(guī)紙片擴(kuò)散法步驟將其涂布于MHA平皿上，干燥3min～10min。采用10μL接種環(huán)從TSB-美羅培南紙片懸液中取出美羅培南紙片，排出過多液體，將其貼在已接種好大腸埃希菌ATCC25922的MHA平皿上，反轉(zhuǎn)平皿，35℃±2℃空氣孵育18h～24h后，測量美羅培南抑菌圈直徑。mCIM結(jié)果判讀：=1\*GB3①陽性：當(dāng)抑菌圈直徑6mm～15mm或在16mm～18mm抑菌圈內(nèi)存在大腸埃希菌ATCC25922菌落時，報(bào)告產(chǎn)碳青霉烯酶；=2\*GB3②陰性：當(dāng)抑菌圈邊緣清晰可見，且其直徑≥19mm時，報(bào)告不產(chǎn)碳青霉烯酶；=3\*GB3③不確定：當(dāng)抑菌圈直徑為16mm～18mm或抑菌圈直徑在≥19mm抑菌圈內(nèi)存在大腸埃希菌ATCC25922菌落時，不能確定待測菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，宜用分子方法確認(rèn)。eCIM結(jié)果判讀：僅在mCIM陽性才解讀eCIM結(jié)果。若抑菌圈內(nèi)存在菌落，測量eCIM抑菌圈時可忽略不計(jì)，直接量取抑菌圈邊緣。=1\*GB3①陽性：eCIM抑菌圈直徑-mCIM抑菌圈直徑≥5mm，報(bào)告產(chǎn)金屬酶；=2\*GB3②陰性：eCIM抑菌圈直徑-mCIM抑菌圈直徑≤4mm，報(bào)告不產(chǎn)金屬酶，產(chǎn)絲氨酸類碳青霉烯酶。注：若菌株共產(chǎn)絲氨酸類碳青霉烯酶和金屬酶，eCIM試驗(yàn)為假陰性，此時不能區(qū)分二者。不常見苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌藥敏試驗(yàn)乏養(yǎng)球菌屬和顆粒鏈球菌屬乏養(yǎng)球菌屬和顆粒鏈球菌屬屬于苛養(yǎng)菌，是感染性心內(nèi)膜炎的重要致病菌。檢測藥物為青霉素、頭孢噻肟或頭孢XX和萬古霉素。來自呼吸道或傷口的分離株不必進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，來自無菌部位如血液、深部組織或植入的假體裝置，特別是免疫缺陷患者，宜進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)見附錄B表B.1。氣球菌屬、孿生球菌屬、乳球菌屬和微球菌屬氣球菌屬常規(guī)檢測藥物為青霉素、頭孢XX和萬古霉素。孿生球菌屬檢測藥物為青霉素、頭孢噻肟或頭孢XX和萬古霉素。乳球菌屬的檢測藥物則為青霉素或氨芐XX、頭孢XX、萬古霉素、克林霉素和紅霉素。格氏乳球菌對克林霉素天然耐藥。微球菌屬常為污染菌，多次血培養(yǎng)陽性或植入假體裝置分離的菌株可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。其檢測藥物為青霉素和萬古霉素。這些菌屬藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)見附錄B表B.2。對糖肽類藥物天然耐藥的革蘭陽性菌明串珠菌屬和片球菌屬明串珠菌屬和片球菌屬為苛養(yǎng)菌，對萬古霉素天然耐藥。分離自無菌部位如血培養(yǎng)或深部組織的菌株，尤其是免疫缺陷患者無菌部位分離的菌株可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。檢測藥物為青霉素或氨芐XX。豬紅斑丹毒絲菌豬紅斑丹毒絲菌為苛養(yǎng)菌，對萬古霉素和氨基糖苷類天然耐藥。豬紅斑丹毒絲菌常規(guī)不必進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；但因其引起心內(nèi)膜炎時，宜立即進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。檢測藥物為青霉素或氨芐XX。對青霉素過敏患者，需檢測紅霉素和克林霉素的敏感性。乳桿菌屬乳桿菌屬通常屬于苛養(yǎng)菌。分離自無菌部位如血培養(yǎng)或深部組織等的菌株，尤其是免疫缺陷患者無菌部位分離的菌株需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。檢測抗菌藥物為青霉素或氨芐XX。干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、陰道乳桿菌和玉米乳桿菌對萬古霉素天然耐藥；而嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、惰性乳桿菌、詹氏乳桿菌、約氏乳桿菌和乳酸乳桿菌對萬古霉素敏感。棒桿菌屬、類棒狀桿菌屬和黏滑羅氏菌棒桿菌屬、類棒狀桿菌屬（包括隱秘桿菌屬、節(jié)桿菌屬、短桿菌屬、纖維單胞菌屬、纖維微菌屬、皮桿菌屬、利夫森菌屬、微桿菌屬和厄氏菌屬等）和黏滑羅氏菌通常為污染菌或定植菌。分離自無菌部位如深部組織、腦脊液或血培養(yǎng)（多瓶培養(yǎng)陽性）的菌株，尤其是有植入假體裝置或免疫缺陷患者無菌部位分離的菌株需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。其檢測藥物和藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)詳見附錄B表B.3。需氧芽胞桿菌屬需氧芽胞桿菌屬通常為污染菌，明確為污染菌時，不應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。分離自無菌部位如深部組織、腦脊液或血培養(yǎng)（多瓶培養(yǎng)陽性）的菌株，尤其是有植入假體裝置、免疫缺陷或靜脈吸毒史患者無菌部位分離的菌株可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。需氧芽胞桿菌屬（不包括炭疽芽胞桿菌）檢測藥物為萬古霉素、氟喹諾酮類和克林霉素。該菌屬通常對萬古霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物敏感。蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶，通常對青霉素類和頭孢菌素類耐藥。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌對頭孢菌素類天然耐藥。因該菌通常對氨芐XX或青霉素敏感，因此常規(guī)不必藥敏試驗(yàn)。其藥敏試驗(yàn)僅限于治療失敗或者對青霉素過敏的患者。檢測藥物為青霉素或氨芐XX、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑和美羅培南。這四個藥物的敏感性折點(diǎn)分別為≤2mg/L，≤2mg/L，≤0.5/9.5mg/L、≤0.25mg/L，目前尚無中介和耐藥的折點(diǎn)?？ㄋ蟛糠挚ㄋ暌虍a(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶對不耐酶的青霉素（如青霉素、氨芐XX和阿莫XX）類耐藥。檢測藥物包括阿莫XX/克拉維酸、頭孢呋辛和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。流行病學(xué)調(diào)查或重癥感染患者分離的菌株宜進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)詳見附錄B表B.4。HACEK細(xì)菌群和巴斯德菌屬HACEK細(xì)菌群包括凝聚桿菌屬、心桿菌屬、嚙蝕艾肯菌和金桿菌屬。HACEK群為苛養(yǎng)菌，檢測抗菌藥物為青霉素、氨芐XX、阿莫XX/克拉維酸、頭孢噻肟或頭孢XX、亞胺培南、環(huán)丙沙星或左氧氟沙星和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。分離自咬傷部位的艾肯菌屬對阿莫XX/克拉維酸高度敏感，不必進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。巴斯德菌屬通常對苯唑XX、頭孢氨芐和克林霉素耐藥，而對氨芐XX、阿莫XX和青霉素的MIC值很少超過0.5mg/L。檢測藥物為青霉素類、阿莫XX/克拉維酸、頭孢XX、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)詳見附錄B表B.5。氣單胞菌屬和弧菌屬（不包括霍亂弧菌）氣單胞菌屬對氨芐XX、阿莫XX/克拉維酸和頭孢唑啉均耐藥。氣單胞菌屬檢測藥物為第三代、四代頭孢菌素、氟喹諾酮類和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。采用β-內(nèi)酰胺類藥物治療氣單胞菌屬時，該菌可產(chǎn)生誘導(dǎo)性β-內(nèi)酰胺酶而對超廣譜頭孢菌素類產(chǎn)生耐藥?；【鷮賹儆谑塞}菌，嗜鹽弧菌屬常對磺胺類、青霉素類、頭孢噻吩和頭孢呋辛耐藥?；魜y弧菌檢測藥物包括氨芐XX、阿奇霉素、氯霉素、磺胺類、四環(huán)素或多西環(huán)素和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。其他弧菌屬檢測抗菌藥物包括頭孢噻肟、頭孢他啶、氟喹諾酮類和四環(huán)素或多西環(huán)素。氣單胞菌屬和弧菌屬的藥敏試驗(yàn)常限于腸道外分離的菌株。藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)詳見附錄B表B.6。諾卡菌屬和其他需氧放線菌諾卡菌屬和其他需氧放線菌（馬紅球菌及其他紅球菌屬細(xì)菌、戈登菌屬和鏈霉菌屬等）屬于專性需氧菌，繁殖速度緩慢。諾卡菌屬檢測的藥物及其折點(diǎn)見附錄B表B.7。萬古霉素和利福平是治療馬紅球菌引起臨床感染的重要藥物，因此馬紅球菌藥敏需包括這兩個藥物。其他需氧放線菌如馬紅球菌、馬杜拉放線菌屬和戈登菌屬僅報(bào)告MIC值，尚無藥敏折點(diǎn)。質(zhì)量控制（Qualitycontrol，QC）實(shí)驗(yàn)室宜遵照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)建立本實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量管理體系，包括質(zhì)控菌株、質(zhì)控頻率和質(zhì)控范圍等，同時定期參加實(shí)驗(yàn)室室間比對項(xiàng)目。質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株可從ATCC或參考實(shí)驗(yàn)室以及商業(yè)機(jī)構(gòu)獲得。保存其來源和傳代等記錄，并有證據(jù)表明質(zhì)控菌株性能滿足要求。質(zhì)控頻率日質(zhì)控：可按20天或30天重復(fù)方案和15-重復(fù)方案中任意一種執(zhí)行日質(zhì)控。20天或30天重復(fù)方案（表6）連續(xù)檢測20天或30天，記錄藥物的MIC值或抑菌圈直徑。根據(jù)檢測結(jié)果是否在控，決定是否轉(zhuǎn)周質(zhì)控；若實(shí)驗(yàn)室常規(guī)每天檢測質(zhì)控菌株，期望將日質(zhì)控轉(zhuǎn)為周質(zhì)控，可回顧性分析過去兩年連續(xù)檢測的質(zhì)控結(jié)果，前提是檢測系統(tǒng)一致。20天或30天重復(fù)方案中可接受標(biāo)準(zhǔn)和推薦措施初始實(shí)驗(yàn)超出范圍次數(shù)（基于20個重復(fù)）初始實(shí)驗(yàn)結(jié)論（基于20個重復(fù)）重復(fù)實(shí)驗(yàn)后超出范圍次數(shù)（基于30個重復(fù)）重復(fù)實(shí)驗(yàn)后結(jié)論0-1方案成功，執(zhí)行周質(zhì)控--2-3再進(jìn)行另一個10天重復(fù)檢測2-3方案成功，執(zhí)行周質(zhì)控＞3方案失敗，調(diào)查并采取適當(dāng)糾正措施，繼續(xù)日質(zhì)控＞3方案失敗，調(diào)查并采取適當(dāng)糾正措施，繼續(xù)日質(zhì)控15-重復(fù)方案（見表7）每天重復(fù)測定3次，每次單獨(dú)制備接種物，連續(xù)測定5天，記錄藥物的MIC值或抑菌圈直徑。根據(jù)檢測結(jié)果是否在控，決定是否轉(zhuǎn)周質(zhì)控。15-重復(fù)方案中可接受標(biāo)準(zhǔn)和推薦措施初始實(shí)驗(yàn)超出范圍次數(shù)（基于15個重復(fù)）初始實(shí)驗(yàn)結(jié)論（基于15個重復(fù)）重復(fù)實(shí)驗(yàn)后超出范圍次數(shù)（基于30個重復(fù)）重復(fù)實(shí)驗(yàn)后結(jié)論0-1方案成功，執(zhí)行周質(zhì)控--2-3再進(jìn)行另一個15-重復(fù)（3×5天）方案2-3方案成功，執(zhí)行周質(zhì)控≥4方案失敗，調(diào)查并采取適當(dāng)糾正措施，繼續(xù)日質(zhì)控≥4方案失敗，調(diào)查并采取適當(dāng)糾正措施，繼續(xù)日質(zhì)控周質(zhì)控：即每周檢測1次。當(dāng)使用同一廠商新批號的培養(yǎng)基時，應(yīng)執(zhí)行周質(zhì)控。若周質(zhì)控失控，應(yīng)采取適當(dāng)糾正措施。對于某些不穩(wěn)定易降解的抗菌藥物，質(zhì)控頻率可增加，不局限于一周一次。質(zhì)控結(jié)果失控原因分析和糾正措施失控原因可分為隨機(jī)誤差、可確認(rèn)的誤差和系統(tǒng)誤差。隨機(jī)誤差和可確認(rèn)的誤差可通過簡單重復(fù)進(jìn)行質(zhì)控予以糾正；而系統(tǒng)誤差不可通過簡單重復(fù)進(jìn)行質(zhì)控予以糾正。失控原因是可確認(rèn)的誤差（即誤差原因易發(fā)現(xiàn)和誤差易于糾正）若在失控當(dāng)天通過重復(fù)檢測相同質(zhì)控菌株/抗菌藥物組合，其結(jié)果在控，可不必進(jìn)一步糾錯。可確認(rèn)的誤差產(chǎn)生的失控原因包括但不局限于以下幾方面：質(zhì)控菌株：=1\*GB3①使用誤差的質(zhì)控菌株；=2\*GB3②不當(dāng)?shù)膬Υ娣绞剑?3\*GB3③維護(hù)不足（如相同的傳代產(chǎn)物超過1個月）；=4\*GB3④污染，菌株失活；=5\*GB3⑤菌株性能改變（如突變或質(zhì)粒丟失等）。檢測試劑：=1\*GB3①不當(dāng)?shù)膬Υ婧瓦\(yùn)輸環(huán)境；=2\*GB3②污染；=3\*GB3③試管或微孔內(nèi)肉湯量不足；=4\*GB3④板條、瓊脂平皿或藥敏卡等損壞（如破裂或泄露等）；=5\*GB3⑤試劑失效。檢測過程：=1\*GB3①接種物菌懸液配制方法不當(dāng)或濁度調(diào)節(jié)方法不當(dāng)；=2\*GB3②配制接種物使用的細(xì)菌孵育時長不當(dāng)；=3\*GB3③配制接種物使用的細(xì)菌來源于選擇性培養(yǎng)基、含抗菌藥物或細(xì)菌生長抑制復(fù)合物的平皿；=4\*GB3④孵育溫度或孵育條件不當(dāng)；=5\*GB3⑤使用誤差的試劑及配套設(shè)備；=6\*GB3⑥藥敏結(jié)果讀取方法或結(jié)果解釋不當(dāng)；=7\*GB3⑦書寫誤差。儀器：儀器故障或定標(biāo)不通過（如微量分液器）。日質(zhì)控檢測，失控為不可確認(rèn)的誤差執(zhí)行糾正措施：失控當(dāng)天采用相同的質(zhì)控菌株/抗菌藥物組合重復(fù)進(jìn)行檢測，若在控，繼續(xù)執(zhí)行日質(zhì)控；若不在控，執(zhí)行糾正措施，見6.3.4所述。周質(zhì)控檢測，失控為不可確認(rèn)的誤差執(zhí)行糾正措施：失控當(dāng)天重復(fù)檢測相同的質(zhì)控菌株/抗菌藥物組合，若重復(fù)檢測的結(jié)果在控，且已找到失控的原因，連續(xù)五天重復(fù)使用同一批號的試劑檢測所有抗菌藥物/質(zhì)控菌株組合的質(zhì)控結(jié)果，若：=1\*GB3①5次檢測結(jié)果均可控，可繼續(xù)執(zhí)行周質(zhì)控；=2\*GB3②3次檢測結(jié)果在控，繼續(xù)執(zhí)行連續(xù)2天重復(fù)檢測直至5次結(jié)果在控。糾正措施，包括：若重復(fù)檢測仍不在控，執(zhí)行糾正措施。繼續(xù)執(zhí)行日質(zhì)控直至找到失控原因。選用新的質(zhì)控菌株或新的試劑批號或新的品牌。在尋找失控原因過程中，可采用替代性檢測試驗(yàn)。商品化藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證受試菌株的選擇選擇適用于待驗(yàn)證系統(tǒng)中藥物檢測的臨床菌株，且兼顧藥敏板的類型（如驗(yàn)證葡萄球菌專用藥敏板時選擇葡萄球菌）、每種藥物的抗菌譜（如驗(yàn)證糖肽類時只選革蘭陽性菌）、檢測的范圍（如尿液分離株）。敏感和耐藥菌株的數(shù)量宜均衡。如可能，宜使用已知耐藥表型的菌株，或所在地區(qū)具有特殊臨床意義的耐藥菌株（如碳青霉烯耐藥腸桿菌科）。產(chǎn)品說明書中未列出的菌種不列入驗(yàn)證范圍，可不驗(yàn)證罕見耐藥菌（如萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌），但實(shí)驗(yàn)室應(yīng)審閱制造商的數(shù)據(jù)或相關(guān)文獻(xiàn)。推薦使用非凍存的、新鮮的臨床分離株。為增加菌種的多樣性和耐藥表型的數(shù)量，也可使用凍存菌株、室間質(zhì)評或其他來源的菌株。檢測前，凍存菌株傳代2次，且傳代后24h內(nèi)使用。受試菌株的數(shù)量每種藥敏板至少需要測試30株菌，這樣每個藥會產(chǎn)生30個藥敏結(jié)果。對于未達(dá)到30個結(jié)果的藥物，需檢測其他菌株或使用質(zhì)控株的結(jié)果以保證每種藥物至少有30個藥敏結(jié)果，但質(zhì)控株的結(jié)果不能超過50%。盡可能選擇大量的臨床菌株，包括特殊或少見耐藥表型菌株。對照方法的選擇引入新的藥敏檢測系統(tǒng)時，需與現(xiàn)有的且驗(yàn)證過的藥敏系統(tǒng)進(jìn)行比較。如果實(shí)驗(yàn)室目前無藥敏系統(tǒng)，可在新的藥敏系統(tǒng)上使用已知藥敏結(jié)果的貯存菌株進(jìn)行驗(yàn)證；或與通過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)聯(lián)系，將檢測結(jié)果與該實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證過的藥敏系統(tǒng)進(jìn)行比對；實(shí)驗(yàn)室也可通過與參考方法（如微量肉湯稀釋法）的比較，驗(yàn)證新的藥敏系統(tǒng)（表8）。推薦用于不同情況下藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證的方案現(xiàn)有系統(tǒng)新系統(tǒng)比較的方法和數(shù)據(jù)評價(jià)無紙片擴(kuò)散法=1\*GB3①新系統(tǒng)的紙片擴(kuò)散法與通過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室的紙片擴(kuò)散法或肉湯稀釋法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。=2\*GB3②利用S、I和R結(jié)果判斷CA。自動化或人工方法a檢測MIC=1\*GB3①新系統(tǒng)的MIC結(jié)果與通過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室的MIC方法進(jìn)行比較。=2\*GB3②利用S、I和R結(jié)果判斷CA。如果CA可接受，不需計(jì)算EA。=3\*GB3③如檢測的倍比稀釋度足夠?qū)?，可利用MIC結(jié)果判斷EA。只有紙片擴(kuò)散法自動化或人工方法a檢測MIC=1\*GB3①新系統(tǒng)的MIC結(jié)果與紙片擴(kuò)散法進(jìn)行比較。=2\*GB3②利用S、I和R結(jié)果判斷CA。如果CA可接受，不需計(jì)算EA。自動化或人工方法a檢測MIC自動化或人工方法a檢測MIC=1\*GB3①新系統(tǒng)的MIC結(jié)果與現(xiàn)有MIC系統(tǒng)的結(jié)果進(jìn)行比較。=2\*GB3②利用S、I和R結(jié)果判斷CA。如果CA可接受，不需計(jì)算EA。=3\*GB3③如檢測的倍比稀釋度足夠?qū)?，可利用MIC結(jié)果判斷EA。=4\*GB3④在適當(dāng)情況下，紙片擴(kuò)散法或梯度擴(kuò)散法a可用于判斷不一致的結(jié)果。a人工MIC方法包括梯度擴(kuò)散法，通過國家食品及藥物管理局批準(zhǔn)的梯度擴(kuò)散法也可作為比較方法。使用此商品時，應(yīng)嚴(yán)格遵守制造商的說明，并確保質(zhì)控結(jié)果在可接受范圍。性能驗(yàn)證期間的質(zhì)量控制新藥敏檢測系統(tǒng)藥敏系統(tǒng)驗(yàn)證期間的每一天，應(yīng)在新系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量控制。使用合適的針對藥敏板的質(zhì)控菌株。實(shí)驗(yàn)室如希望將質(zhì)控頻率從日變到周，需實(shí)施質(zhì)量控制計(jì)劃，評審質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)是否支持這種轉(zhuǎn)變。改良的藥敏檢測系統(tǒng)當(dāng)實(shí)驗(yàn)室改良已有的藥敏檢測系統(tǒng)或采用個性化藥敏檢測系統(tǒng)時，需對變更項(xiàng)目實(shí)施個性化質(zhì)量控制，質(zhì)量控制方案詳見表9。改良藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng)時推薦的質(zhì)量控制方案要求的質(zhì)控頻率變更項(xiàng)目1天5天“15-重復(fù)”或“20天或30天”計(jì)劃評論MIC試驗(yàn)使用新批號或新貨號√擴(kuò)展稀釋范圍√舉例：從折點(diǎn)類板條更換為寬MIC范圍減少稀釋范圍√舉例：從寬稀釋度藥敏板更換為折點(diǎn)板使用新方法（相同的制造商）√舉例：從肉眼改為儀器讀板；從過夜到快速M(fèi)IC檢測此外，還需進(jìn)行精密度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證使用新制造商的MIC法√此外，還需進(jìn)行精密度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證使用來自新制造商的肉湯或瓊脂√現(xiàn)存系統(tǒng)中添加新的抗菌藥物√接種物的制備改用具有自身質(zhì)控規(guī)程的設(shè)備進(jìn)行接種物的準(zhǔn)備/標(biāo)準(zhǔn)化√舉例：從肉眼變?yōu)槭褂糜匈|(zhì)控程序的光度儀調(diào)整濁度改為用戶自身技術(shù)進(jìn)行接種物的準(zhǔn)備/標(biāo)準(zhǔn)化√舉例：從肉眼變?yōu)榉枪舛葍x器的其他方法調(diào)整濁度設(shè)備/軟件影響藥敏結(jié)果的軟件更新√監(jiān)測所有抗菌藥物，不僅僅包括軟件改進(jìn)涉及的藥物影響藥敏結(jié)果的設(shè)備維修√根據(jù)維修的程度（即關(guān)鍵部件如攝相設(shè)備），可能需要進(jìn)行附加試驗(yàn)（如5天）精密度指采用相同分析方法對同一菌株連續(xù)檢測結(jié)果的一致性。藥敏檢測系統(tǒng)精密度評估應(yīng)考慮正常變異，如抗細(xì)菌藥物結(jié)果差異為±1個倍比稀釋度，抗真菌藥物結(jié)果差異為±2個倍比稀釋度時，認(rèn)為結(jié)果相同。評估時，至少使用5個代表性的質(zhì)控和臨床菌株，每株檢測三次。檢測可以在一天或多天內(nèi)進(jìn)行。現(xiàn)有系統(tǒng)通常不需進(jìn)行精密度分析，但是當(dāng)某一臨床菌株在新系統(tǒng)中的結(jié)果不可重復(fù)時，需在現(xiàn)有檢測系統(tǒng)中重新檢測。如果現(xiàn)有檢測系統(tǒng)的結(jié)果仍然不可重復(fù)，換一菌株。評估精密度，至少95%的結(jié)果符合EA。此外，至少95%質(zhì)控菌株的結(jié)果在控。準(zhǔn)確度指待評估藥敏檢測系統(tǒng)的結(jié)果和對照方法之間結(jié)果的一致性。使用相同菌株同時在新系統(tǒng)和對照系統(tǒng)中檢測。推薦使用臨床菌株。評估準(zhǔn)確度包括在不同檢測系統(tǒng)中評估CA和EA，可接受標(biāo)準(zhǔn)為：CA≥90%和EA≥90%。藥敏試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析分析驗(yàn)證數(shù)據(jù)時，應(yīng)當(dāng)只包括抗菌藥物適用的臨床菌株的結(jié)果。如頭孢菌素類不用于腸球菌藥敏的分析。分析藥敏檢測系統(tǒng)的結(jié)果至少包括CA。如果CA可接受，不需評估EA。如果檢測的倍比稀釋度有限（如2-3個），不需評估EA；如果倍比稀釋度大于4個，且報(bào)告的MIC值可用于指導(dǎo)治療時，評估EA。為及早發(fā)現(xiàn)問題，應(yīng)在評估中而不是評估后分析數(shù)據(jù)。分類錯誤或MIC差異超過一個倍比稀釋度時，保存菌株并補(bǔ)充可能的附加試驗(yàn)。矛盾結(jié)果的解決商品化藥敏檢測系統(tǒng)之間不一致的結(jié)果稱為“差異”（discrepancies），而商品化藥敏檢測系統(tǒng)與參考方法的差異稱為“誤差”（errors）。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重新檢測具有主要分類差異的菌株（如在一個系統(tǒng)中為耐藥，但在另一個系統(tǒng)為敏感）。如可能，重復(fù)試驗(yàn)最好使用相同的接種物同時在兩個系統(tǒng)上檢測，并重復(fù)三次。如重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果仍不一致，使用第三種方法，優(yōu)選是參考方法。此參考方法為該產(chǎn)品開發(fā)時所用的方法（見產(chǎn)品說明書上）。實(shí)驗(yàn)室記錄參考方法檢測的結(jié)果，比較新系統(tǒng)與參考方法結(jié)果間的相關(guān)性。如結(jié)果一致，不需要附加檢測；如不一致，實(shí)驗(yàn)室宜向制造商咨詢。制造商可能要求提供這些菌株用于附加試驗(yàn)。檢測結(jié)果不一致的菌株，應(yīng)在故障排除后和/或完成制造商建議的糾正措施后重新檢測?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)雖然商品化檢測系統(tǒng)在獲批前已建立了嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)（包括EA和生長不足等），但是實(shí)驗(yàn)室仍有必要分析自己的數(shù)據(jù)以確保檢測系統(tǒng)正常運(yùn)行?！安町悺保壑卮蟛町悾╩ajordiscrepancy，MD）和極重大差異（verymajordiscrepancy，VMD）］指不同藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng)之間結(jié)果的差別，“誤差”（ME和VME）指藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng)與參考方法（如微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法）結(jié)果的不同。不是所有的藥敏檢測系統(tǒng)都使用相同的參考方法。當(dāng)符合以下條件時，針對特定藥物／臨床菌株組合的藥敏檢測系統(tǒng)，認(rèn)為通過驗(yàn)證：與現(xiàn)有系統(tǒng)相比較，CA≥90%和EA≥90%（如果報(bào)告MIC）。所有耐藥菌株的VMD或VME＜3%。所有敏感菌株的MD或ME＜3%。如果任一條標(biāo)準(zhǔn)沒有滿足，宜采取附加措施，包括重復(fù)檢測結(jié)果不一致的菌株，或檢測額外的菌株，或與參考方法進(jìn)行比較。

（資料性附錄）

臨床各種屬細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件臨床常見快速生長非苛養(yǎng)菌、常見苛養(yǎng)菌、不常見菌、潛在生物恐怖病原菌、諾卡菌屬和其他需氧放線菌、厭氧菌的藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件見表A.1。臨床各種屬細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件細(xì)菌種屬藥敏試驗(yàn)方法a培養(yǎng)基b接種物來源孵育環(huán)境孵育時間c常見快速生長非苛養(yǎng)菌腸桿菌科、銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、其他革蘭陰性桿菌、葡萄球菌屬d、腸球菌屬紙片擴(kuò)散法瓊脂稀釋法梯度擴(kuò)散法MHA血平皿35℃空氣環(huán)境孵育18h～20h35℃±2℃空氣環(huán)境16h～18h，不動桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌孵育20h～24h肉湯稀釋法CAMHB血平皿35℃空氣環(huán)境孵育18h～20h35℃±2℃空氣環(huán)境16h～20h，不動桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌孵育20h～24h自動化儀器法根據(jù)各自動化儀器的產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作常見苛養(yǎng)菌肺炎鏈球菌其他鏈球菌紙片擴(kuò)散法含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的MHA血平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育18h～20h35℃±2℃5%CO2環(huán)境20h～24h稀釋法含2.5%～5%（V/V）裂解馬血CAMHB（CAMHB-LHB）血平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育18h～20h35℃±2℃空氣環(huán)境20h～24h流感嗜血桿菌e副流感嗜血桿菌e紙片擴(kuò)散法嗜血桿菌試驗(yàn)培養(yǎng)基（HaemophilusTestMedium，HTM）瓊脂巧克力平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～24h35℃±2℃5%CO2環(huán)境16h～18h肉湯稀釋法HTM肉湯巧克力平皿35℃±2℃5%CO2環(huán)境孵育20h～24h35℃±2℃空氣環(huán)境20h～24h淋病奈瑟菌f紙片擴(kuò)散法瓊脂稀釋法GC瓊脂+1%特定的生長添加劑巧克力平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～24h36±1℃（不超過37℃）5%CO2環(huán)境20h～24h腦膜炎奈瑟菌紙片擴(kuò)散法瓊脂稀釋法含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的MHA巧克力平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～22h35℃±2℃5%CO2環(huán)境20h～24h微量肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）巧克力平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～22h35℃±2℃5%CO2環(huán)境20h～24h不常見苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌乏養(yǎng)球菌屬顆粒鏈球菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）+0.001%鹽酸吡哆醛（即10mg/L）含半胱氨酸（或鹽酸吡哆醛）的巧克力平皿或厭氧瓊脂35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境20h～24h氣球菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～24h35℃5%CO2環(huán)境20h～24h孿生球菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育24h～48h35℃5%CO2環(huán)境24h～48h表A.1（續(xù)）細(xì)菌種屬藥敏試驗(yàn)方法a培養(yǎng)基b接種物來源孵育環(huán)境孵育時間hc乳球菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境20h～24h微球菌屬肉湯稀釋法CAMHB血平皿35℃空氣環(huán)境孵育16h～20h35℃空氣環(huán)境20h～24h片球菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境20h～24h明串珠菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境20h～24h豬紅斑丹毒絲菌肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿或巧克力平皿35℃空氣環(huán)境孵育24h形成針尖樣菌落，需孵育1～3天35℃空氣環(huán)境20h～24h乳桿菌屬肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育24h～48h35℃5%CO2環(huán)境24h～48h棒桿菌屬（包括白喉棒狀桿菌）和類棒狀桿菌屬（包括隱秘桿菌屬、節(jié)桿菌屬、短桿菌屬、纖維單胞菌屬、纖維微菌屬、皮桿菌屬、利夫森菌屬、微桿菌屬、厄氏菌屬、不包括黏滑羅氏菌在內(nèi)的羅氏菌屬、Trueperella和Turicella）肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V），若檢測達(dá)托霉素，CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）中鈣離子濃度加至50mg/L血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境24h～48h（除外β-內(nèi)酰胺類孵育48h，其它類抗菌藥物孵育24h可讀取結(jié)果）黏滑羅氏菌肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境20h～24h需氧芽胞桿菌屬（不包括炭疽芽胞桿菌）肉湯稀釋法CAMHB血平皿35℃空氣環(huán)境孵育16h～20h35℃空氣環(huán)境16h～20h產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境20h～24h卡他莫拉菌紙片擴(kuò)散法MHA血平皿35℃空氣環(huán)境孵育16h～20h35℃5%CO2環(huán)境20h～24h微量肉湯稀釋法CAMHB血平皿35℃空氣環(huán)境孵育16h～20h35℃空氣環(huán)境20h～24hHACEK群（包括凝聚桿菌屬、心桿菌屬、嚙蝕艾肯菌和金桿菌屬）微量肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）替代HTM培養(yǎng)基或布氏肉湯+維生素K（1mg/L）+血紅素（5mg/L）+5%LHB血平皿或巧克力平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育24h～48h35℃5%CO2環(huán)境24h～48h巴斯德菌屬紙片擴(kuò)散法含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的MHA血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20～24h35℃空氣環(huán)境16h～18h微量肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境18h～24h氣單胞菌屬紙片擴(kuò)散法MHA血平皿35℃空氣環(huán)境孵育18h～20h35℃空氣環(huán)境16h～18h微量肉湯稀釋法CAMHB血平皿35℃5%CO2環(huán)境孵育20h～24h35℃空氣環(huán)境16h～20h弧菌屬（包括霍亂弧菌）g紙片擴(kuò)散法MHA血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃±2℃空氣環(huán)境16h～18h微量肉湯稀釋法CAMHB血平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃±2℃空氣環(huán)境16h～20h表A.1（續(xù)）細(xì)菌種屬藥敏試驗(yàn)方法a培養(yǎng)基b接種物來源孵育環(huán)境孵育時間hc空腸彎曲菌/大腸彎曲菌紙片擴(kuò)散法含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的MHA含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的陽離子校正的Mueller-Hinton瓊脂平皿36℃～37℃微需氧環(huán)境（10%CO2、5%O2和85%N2）孵育48h或42℃微需氧環(huán)境孵育24h42℃微需氧環(huán)境24h微量肉湯稀釋法CAMHB-LHB（2.5%～5%，V/V）含5%（V/V）的脫纖維綿羊血的陽離子校正的Mueller-Hinton瓊脂平皿36℃～37℃微需氧環(huán)境孵育48h或42℃微需氧環(huán)境孵育24h36℃～37℃微需氧環(huán)境孵育48h或42℃微需氧環(huán)境孵育24h（孵育溫度低于36℃或超過42℃均可導(dǎo)致細(xì)菌生長不良。）幽門螺桿菌h瓊脂稀釋法加入5%（V/V）≥2周的綿羊血的MHA加入血或血清的平皿36℃～37℃環(huán)境孵育72h35℃±2℃微需氧環(huán)境72h潛在生物恐怖病原菌i炭疽芽孢桿菌微量肉湯稀釋法CAMHB生長法或直接菌落法，用CAMHB制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液35℃±2℃空氣環(huán)境16h～20h類鼻疽伯克霍爾德菌微量肉湯稀釋法CAMHB生長法或直接菌落法，用CAMHB制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液35℃±2℃空氣環(huán)境16h～20h鼻疽伯克霍爾德菌微量肉湯稀釋法CAMHB生長法或直接菌落法，用CAMHB制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液35℃±2℃空氣環(huán)境16h～20h鼠疫耶爾森菌微量肉湯稀釋法CAMHB生長法或直接菌落法，用CAMHB制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液35℃±2℃空氣環(huán)境24h，若生長對照孔生長不好，繼續(xù)孵育24h布魯菌屬微量肉湯稀釋法無添加劑的布魯肉湯，pH值調(diào)至7.1±0.1生長法或直接菌落法，用CAMHB制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液35℃±2℃空氣環(huán)境48h土拉弗朗西斯菌j微量肉湯稀釋法CAMHB+2%特定生長添加劑，pH值調(diào)至7.1±0.1巧克力平皿35℃空氣環(huán)境孵育20h～24h35℃±2℃空氣環(huán)境48h諾卡菌屬和其他需氧放線菌諾卡菌屬和其他需氧放線菌（馬紅球菌和其他紅球菌屬、戈登菌屬、冢村菌屬和鏈霉菌屬）微量肉湯稀釋法CAMHB或無菌去離子水血平皿或TSA平皿35℃±2℃空氣環(huán)境孵育直至生長充分（通常3天～7天）37℃±2℃空氣環(huán)境如對照孔生長充分，72h可以讀取結(jié)果；如生長不充分，繼續(xù)孵育，每天觀察，直至第5天厭氧菌厭氧菌瓊脂稀釋法布魯瓊脂+血紅素（5mg/L）+維生素K1（1mg/L）+5%裂解綿羊血生長法或直接菌落法，用布魯肉湯制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液36℃±1℃厭氧環(huán)境42h～48h肉湯稀釋法布魯瓊脂+血紅素（5mg/L）+維生素K1（1mg/L）+5%LHB生長法或直接菌落法，用布魯肉湯制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液36℃±1℃厭氧環(huán)境46h～48h表A.1（續(xù)）a 采用自動化儀器法和梯度擴(kuò)散法等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)需遵照廠家說明書。自動化儀器法通常只能用于常見細(xì)菌，而梯度擴(kuò)散法可用于苛養(yǎng)菌和少見菌的藥敏試驗(yàn)，但需要獲得相關(guān)管理部門的批件。b 檢測達(dá)托霉素時，培養(yǎng)基加入50mg/L的鈣離子；檢測磷霉素時，加入25mg/L的6-磷酸葡萄糖；檢測達(dá)巴萬星和奧利萬星時，加入0.002%的聚山梨醇酯-80。c 紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法檢測苯唑XX和萬古霉素的敏感性宜孵育24h。紙片擴(kuò)散法檢測頭孢西丁的敏感性和凝固酶陰性葡萄球菌對所有抗菌藥物的敏感性孵育24h。d檢測葡萄球菌屬對苯唑XX的敏感性，須在CAMHB加入2%NaCl。e嗜血桿菌屬若檢測甲氧芐啶或磺胺甲噁唑，培養(yǎng)基中加入0.2IU胸苷磷酸化酶。HTM肉湯為CAMHB中加入15mg/L的β-NAD、15mg/L的牛血紅素或豬血紅素、5g/L的酵母提取物。f 淋病奈瑟菌可采用CAMHB或pH7.0的0.9%的磷酸鹽緩沖液配制菌懸液。紙片擴(kuò)散法1%的特定生長添加劑不宜含半胱氨酸；瓊脂稀釋法檢測碳青霉烯類和克拉維酸時宜含半胱氨酸；檢測其他抗菌藥物，是否含有半胱氨酸對檢測結(jié)果影響不大。特定生長添加劑配制方法如下：將1.1g左旋胱氨酸、0.03g鹽酸鳥嘌呤、0.003g鹽酸硫胺素、0.013g對氨基苯甲酸、0.01g維生素B12、0.1g焦磷酸硫胺素、0.25gNAD、1g腺嘌呤、10g左旋谷氨酰胺、100g葡萄糖、0.02g硝酸鐵和25.9g左旋半胱氨酸溶于1L無菌去離子水中，攪拌混勻。g 嗜鹽弧菌屬采用0.85%NaCl溶液制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液。h 幽門螺桿菌采用0.85%NaCl溶液配制成2.0麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?。i 潛在生物恐怖病原菌送至生物安全I(xiàn)I級BSL-2以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。對極易產(chǎn)生氣溶膠的操作在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。j 土拉弗朗西斯菌：特定生長添加劑配制方法如下，將25.9g左旋鹽酸半胱氨酸、1.1g左旋半胱氨酸、1g腺嘌呤、0.03g鹽酸鳥嘌呤、0.01g維生素B12、0.1g焦磷酸硫胺素、0.25g煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、10g左旋谷氨酰胺、0.02g.硝酸鐵、100g葡萄糖、3mg鹽酸硫胺素和13mg對氨基苯甲酸溶于1L無菌去離子水中，攪拌混勻。

（資料性附錄）

不常見苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)乏養(yǎng)球菌屬和顆粒鏈球菌屬的藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)見表B.1。乏養(yǎng)球菌屬和顆粒鏈球菌屬的藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)抗菌藥物MIC折點(diǎn)（mg/L）SIR青霉素≤0.120.25-2≥4氨芐XX≤0.250.5-4≥8頭孢噻肟≤12≥4頭孢XX≤12≥4頭孢吡肟≤12≥4亞胺培南≤0.51≥2美羅培南≤0.51≥2紅霉素≤0.250.5≥1克林霉素≤0.250.5≥1環(huán)丙沙星≤12≥4左氧氟沙星≤24≥8氯霉素≤4-≥8萬古霉素≤1--氣球菌屬、孿生球菌屬、乳球菌屬和微球菌屬的藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)見表B.2。氣球菌屬、孿生球菌屬、乳球菌屬和微球菌屬的藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)細(xì)菌種類抗菌藥物MIC折點(diǎn)（mg/L）SIR氣球菌屬青霉素≤0.120.25-2≥4氨芐XX≤0.250.5-4≥8頭孢噻肟≤12≥4頭孢XX≤12≥4美羅培南≤0.5--萬古霉素≤1--環(huán)丙沙星≤12≥4左氧氟沙星≤24≥8四環(huán)素≤24≥8甲氧芐啶/磺胺甲噁唑a≤2/38-≥4/76利奈唑胺≤2--孿生球菌屬青霉素≤0.120.25-2≥4頭孢噻肟≤12≥4頭孢XX≤12≥4美羅培南≤0.51≥2萬古霉素≤1-