DNS法測(cè)定還原糖的含量課件

DNS法測(cè)定還原糖的含量

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3，5-二硝基水楊酸溶液與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范實(shí)驗(yàn)圍內(nèi)反應(yīng)的還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系，可測(cè)定生成化合物的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線反推出還原糖的濃度。操作簡(jiǎn)便，快速，雜質(zhì)干擾較少，適于生物制氫中還原糖含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理Chemistry

顯色條件包括:波長(zhǎng)選擇，顯色劑用量，顯色時(shí)間，溶液酸度，顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。此次實(shí)驗(yàn)選擇波長(zhǎng)選擇，顯色劑用量，顯色時(shí)間，溶液酸度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試管號(hào)01234DNS/ml02221水/ml31糖/ml001（10-3mol/l）

1（10-4mol/l）2（10-2mol/l)二.顯色條件的選擇

1.波長(zhǎng)選擇取5支試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴15min,均加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，在不同波長(zhǎng)處分別進(jìn)行掃描。圖1為不同條件下溶液的波長(zhǎng)——吸光度圖（水調(diào)零）。由圖1可以看出白色與綠色曲線幾乎重合，說(shuō)明0.0001mol/l葡萄糖溶液與DNS反應(yīng)生成的氨基化合物極少，用比色法很難區(qū)分，故此法所能夠測(cè)量的葡萄糖濃度應(yīng)大于0.0001mol/l。由DNS＋H2O曲線可以看出當(dāng)波長(zhǎng)大于530nm時(shí)，DNS的吸光度已經(jīng)很小，這時(shí)DNS對(duì)反應(yīng)生成的氨基化合物吸光度的影響可以忽略。

Fig.24號(hào)試管稀釋10倍后波長(zhǎng)掃描吸光度A

λ/nm圖2為4號(hào)試管稀釋10倍后波長(zhǎng)掃描圖4號(hào)試管用高濃度的葡萄糖溶液和少量的DNS試劑反應(yīng)，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，儀器無(wú)法測(cè)定，故將其稀釋10倍。以水調(diào)零未出現(xiàn)最高峰，以DNS調(diào)零時(shí)（圖2）在540nm處有最高峰，這說(shuō)明在該濃度下，DNS可能會(huì)對(duì)氨基化合物吸光度的測(cè)量有較大影響，故測(cè)量時(shí)以DNS調(diào)零較準(zhǔn)確。選擇540nm作為最佳吸收波長(zhǎng)。2.DNS用量選擇取試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴30min,加入適量水使定容為10ml，流水冷卻，以1號(hào)試管中DNS溶液為參比，在540nm處測(cè)吸光度。

試管號(hào)01234567DNS/ml0211.522.533.5水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111

3.反應(yīng)時(shí)間(水浴時(shí)間)取試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴相應(yīng)時(shí)間后,加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，以6號(hào)試管中的DNS試劑調(diào)零，在540nm處測(cè)吸光度。

試管號(hào)0123456789DNS/ml0222222222水/ml3

1

11*10-4mol/l糖/ml0111110111煮沸時(shí)間/min15510152025153040504反應(yīng)溶液的酸度范圍的選擇取試管按下表加相應(yīng)試劑，由于所用器皿為試管，不方便用PH計(jì)調(diào)節(jié)PH，此次實(shí)驗(yàn)采用加入不同量的6%的鹽酸溶液的辦法，以PH試紙調(diào)節(jié)溶液的酸度。煮沸20min后，各加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測(cè)吸光度。試管號(hào)01234567DNS/ml02222222水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111PH/〉141189107〉14三．標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取試管按下表加相應(yīng)試劑，由0.01mol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制x*10-4mol/l（3<=x<=27）的葡萄糖，煮沸30min后，各加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測(cè)吸光度。試管號(hào)01234567891011121314DNS/ml022222222222222水/ml31

葡萄糖/ml001111111111111濃度/10-4mol/l

3579111315171921232527下圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，葡萄糖含量（mol/l）與相應(yīng)的吸光度（A）有一定的線性關(guān)系，且其回歸方程為：y=-0.14971+0.035786x，R=0.9954。另外采用較高濃度的葡萄糖來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到下圖2：其回歸方程為：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.當(dāng)所測(cè)得的吸光度比較小時(shí)，可用圖