實(shí)驗(yàn)3-ELISA法測(cè)定乙肝

實(shí)驗(yàn)3ELISA法測(cè)定乙肝酶標(biāo)記免疫技術(shù)以酶作為標(biāo)記物，通過(guò)顯色反應(yīng)指示抗原-抗體反應(yīng)的標(biāo)記技術(shù)稱為酶免疫技術(shù)。可分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測(cè)定技術(shù)兩大類。目前應(yīng)用最廣的為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）,是免疫測(cè)定技術(shù)的代表。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法和結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩⒖乖ɑ蚩贵w）結(jié)合于某種固相載體的表面，并保持免疫活性，再以標(biāo)本中的待檢抗體（或抗原）與之結(jié)合，然后使酶標(biāo)抗體與已形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，分別洗去未結(jié)合的抗原與抗體，最后加入酶反應(yīng)的底物，出現(xiàn)呈色反應(yīng)，該反應(yīng)中的有色產(chǎn)物含量與待檢抗體（抗原）的含量直接相關(guān)。實(shí)驗(yàn)原理：ELISA測(cè)定方法有：間接法：檢測(cè)抗體最常用的方法；雙抗體夾心法：檢測(cè)抗原最常用的方法；競(jìng)爭(zhēng)法：既可用于測(cè)抗原，又可用于測(cè)抗體；（1）間接法測(cè)定抗體A.將抗原吸附于固相載體表面(試劑盒生產(chǎn)廠家已經(jīng)做好）；B.加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物

;C.

加酶標(biāo)抗體（多為37℃孵育）

；D.洗液洗去多余

未結(jié)合酶標(biāo)抗體E.加底物,顯色反應(yīng)，測(cè)定底物的降解量和抗體量有關(guān)。

（2）雙抗體夾心法測(cè)定抗原A.

將抗體吸附于固相表面;B.

加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體;D.洗液洗去多余

未結(jié)合酶標(biāo)抗體E.加底物顯色。底物的降解量與抗原量有關(guān)。

（3）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原A.

將抗體吸附在固相載體表面;B.加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體；對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒測(cè)定原理：采用單克隆抗-HBs（HBsAb）包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入多克隆抗HBs-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）,當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAg時(shí)，該HBsAg與包被抗-HBs結(jié)合并與抗HBs-HRP結(jié)合形成抗-HBs-HBsAg-抗HBs-HRP復(fù)合物，加入顯色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無(wú)顯色反應(yīng)。試劑盒組成：1.包被好的微孔反應(yīng)板2.酶結(jié)合物3.陽(yáng)性對(duì)照4.陰性對(duì)照5.洗滌液6.顯色劑A、B測(cè)定步驟1.每孔加入待測(cè)樣本50μl，設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔加入陰性對(duì)照（或陽(yáng)性對(duì)照）各一滴，并設(shè)空白對(duì)照1孔。2.每孔加入酶結(jié)合物一滴（空白對(duì)照孔除外），充分混勻封板，置37℃孵育30分鐘。3.手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇5次程序洗板后拍干。4.每孔加入顯色劑A、B液各一滴，充分混勻，封板，置37℃孵育15分鐘。5.用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm,先用空白孔較零，然后讀取各孔OD值。結(jié)果判斷：判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。陰性對(duì)照OD值低于0.05時(shí)作0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。樣品OD值陰性對(duì)照平均OD值2.1HBV抗原抗體檢測(cè)結(jié)果的臨床分析＋－－－－HBV感染或無(wú)癥狀攜帶＋＋－－－急慢性乙肝或無(wú)癥狀攜帶＋＋－－＋急慢性乙肝（大三陽(yáng)）＋－－＋＋趨于恢復(fù)（小三陽(yáng)）－－＋＋＋－－＋＋－既往感染恢復(fù)期－－－－＋感染過(guò)HBV－－＋－－既往感染或接種過(guò)疫苗酶標(biāo)板酶標(biāo)儀⒈ELISA法有哪幾種類型？其原理是什么？⒉ELISA操作過(guò)程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？⒊ELISA的結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用？

思考題膠體金技術(shù)（金標(biāo)法）氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12－），外層離子層H則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。

膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。

免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique