實驗3-ELISA法測定乙肝

實驗3ELISA法測定乙肝酶標記免疫技術(shù)以酶作為標記物，通過顯色反應(yīng)指示抗原-抗體反應(yīng)的標記技術(shù)稱為酶免疫技術(shù)?？煞譃槊该庖呓M織化學技術(shù)和酶免疫測定技術(shù)兩大類。目前應(yīng)用最廣的為酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）,是免疫測定技術(shù)的代表。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、方法和結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用。實驗?zāi)康模簩⒖乖ɑ蚩贵w）結(jié)合于某種固相載體的表面，并保持免疫活性，再以標本中的待檢抗體（或抗原）與之結(jié)合，然后使酶標抗體與已形成的抗原抗體復合物結(jié)合，分別洗去未結(jié)合的抗原與抗體，最后加入酶反應(yīng)的底物，出現(xiàn)呈色反應(yīng)，該反應(yīng)中的有色產(chǎn)物含量與待檢抗體（抗原）的含量直接相關(guān)。實驗原理：ELISA測定方法有：間接法：檢測抗體最常用的方法；雙抗體夾心法：檢測抗原最常用的方法；競爭法：既可用于測抗原，又可用于測抗體；（1）間接法測定抗體A.將抗原吸附于固相載體表面(試劑盒生產(chǎn)廠家已經(jīng)做好）；B.加抗體,形成抗原-抗體復合物

;C.

加酶標抗體（多為37℃孵育）

；D.洗液洗去多余

未結(jié)合酶標抗體E.加底物,顯色反應(yīng)，測定底物的降解量和抗體量有關(guān)。

（2）雙抗體夾心法測定抗原A.

將抗體吸附于固相表面;B.

加抗原，形成抗原-抗體復合物;C.

加酶標抗體;D.洗液洗去多余

未結(jié)合酶標抗體E.加底物顯色。底物的降解量與抗原量有關(guān)。

（3）競爭法測定抗原A.

將抗體吸附在固相載體表面;B.加入酶標抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；對照只加入酶標抗原；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒測定原理：采用單克隆抗-HBs（HBsAb）包被反應(yīng)板，加入待測標本，同時加入多克隆抗HBs-HRP（辣根過氧化物酶）,當標本中存在HBsAg時，該HBsAg與包被抗-HBs結(jié)合并與抗HBs-HRP結(jié)合形成抗-HBs-HBsAg-抗HBs-HRP復合物，加入顯色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無顯色反應(yīng)。試劑盒組成：1.包被好的微孔反應(yīng)板2.酶結(jié)合物3.陽性對照4.陰性對照5.洗滌液6.顯色劑A、B測定步驟1.每孔加入待測樣本50μl，設(shè)陰性、陽性對照孔，每孔加入陰性對照（或陽性對照）各一滴，并設(shè)空白對照1孔。2.每孔加入酶結(jié)合物一滴（空白對照孔除外），充分混勻封板，置37℃孵育30分鐘。3.手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復5次后拍干。洗板機洗板：選擇5次程序洗板后拍干。4.每孔加入顯色劑A、B液各一滴，充分混勻，封板，置37℃孵育15分鐘。5.用酶標儀讀數(shù)，取波長450nm,先用空白孔較零，然后讀取各孔OD值。結(jié)果判斷：判斷為陽性，否則為陰性。陰性對照OD值低于0.05時作0.05計算，高于0.05按實際OD值計算。樣品OD值陰性對照平均OD值2.1HBV抗原抗體檢測結(jié)果的臨床分析＋－－－－HBV感染或無癥狀攜帶＋＋－－－急慢性乙肝或無癥狀攜帶＋＋－－＋急慢性乙肝（大三陽）＋－－＋＋趨于恢復（小三陽）－－＋＋＋－－＋＋－既往感染恢復期－－－－＋感染過HBV－－＋－－既往感染或接種過疫苗酶標板酶標儀⒈ELISA法有哪幾種類型？其原理是什么？⒉ELISA操作過程中應(yīng)注意哪些事項？⒊ELISA的結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用？

思考題膠體金技術(shù)（金標法）氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負離子（AuC12－），外層離子層H則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。

膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。

免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique