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雜交瘤技術(shù)的實驗原理及其操作演示演示實驗(一).接受抗原刺激后,能分泌針對該抗原的特異性抗體,在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞,通常不再進行細胞分裂,存活一段時間后便會死亡——短命細胞一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的特性:B淋巴細胞(Blymphocytes):.骨髓瘤細胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細胞,只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活——長命細胞。經(jīng)篩選與馴化,現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細胞株——沒有抗體分泌物。.2.細胞融合技術(shù):脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學獎.3.雜交瘤細胞的篩選:脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞脾細胞/脾細胞骨髓瘤細胞/骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞脾細胞篩選出不能長期存活不能長期存活.HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細胞:HGPRT+,

TK+骨髓瘤細胞:HGPRT-,

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑).二、雜交瘤技術(shù)的操作流程1.動物免疫:目的:在細胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標抗原的特異性抗體的雜交瘤細胞.特定目標抗原動物免疫脾臟中B淋巴細胞B淋巴細胞大量增殖刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體.常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法:“穩(wěn)妥;優(yōu)勢克隆”皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑:“省時;省抗原”“省時”“操作繁瑣”.常規(guī)免疫法:第1次免疫:抗原+福氏完全佐劑第2次免疫:抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫:抗原+不加佐劑第4次免疫:抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射).二、細胞融合及HAT篩選病毒介導的細胞融合PEG介導細胞融合電激融合1、細胞融合方法:.細胞懸液的制備與融合(1)脾細胞懸液的制備:最后一次免疫后第3天制備

(2)骨髓瘤細胞懸液的制備:于對數(shù)生長期制備(3)細胞融合:50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min.2、HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater.三、抗體的檢測要求:

簡便、快速、敏感;在短時間內(nèi)能檢測大量樣品常用方法:酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴散法.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標儀檢測技術(shù)原理:.四、克隆化常用克隆化方法:有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法80個細胞/96孔飼養(yǎng)細胞(feedercells)ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清,選出分泌特異性抗體的陽性孔,所分泌抗體即為單克隆抗體。.由單一克隆的雜交瘤細胞分泌的抗體,只針對于一個抗原決定簇——單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體優(yōu)點:高度純一高度專一應(yīng)用:疾病的論斷和治療(生物導彈)生物大分子的鑒定、定位和分離純化細胞器的鑒定、定位和分離特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離.五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法:動物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細胞培養(yǎng)罐法.培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?;囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動物免疫細胞融合混合細胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細胞骨髓瘤細胞X抗原B淋巴細胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天

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