層析技術(shù)課件

實驗課人數(shù)實驗時間周次日期內(nèi)容姓名實驗29月13-19分光光度計張學(xué)琴張學(xué)琴，閆紅39月20-26色譜技術(shù)張學(xué)琴移至第8周610月11-17芯片技術(shù)閆紅閆紅710月18-24實時定量PCR技術(shù)陳智忠陳智忠810月25-31共聚焦激光掃描顯微技術(shù)劉毅敏劉毅敏(confocal)閆紅(色譜)911月1-7質(zhì)譜技術(shù)馮繼東馮繼東1011月8-14離心技術(shù)張學(xué)琴張學(xué)琴1111月15-21電泳技術(shù)張學(xué)琴(說明考試方式)周三下午5-7節(jié)理論課；周五下午5-7節(jié)實驗課樣品制備生物大分子制備步驟：材料的選擇和預(yù)處理細胞的破碎提取純化濃縮、干燥和保存動物：選擇有效成分含量豐富的臟器組織便于提取絞碎、脫脂制成丙酮粉對于預(yù)處理好的材料，若不立即進行實驗，應(yīng)冷凍保存。對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。2.細胞的破碎機械磨碎法加壓破碎法超聲波處理反復(fù)凍融法物理法生物化學(xué)法自溶法溶菌酶處理化學(xué)處理法表面活性劑處理脂溶性溶劑處理用低滲溶液3.提取將經(jīng)過處理或破碎的細胞，置于一定條件和溶劑中，讓被提取的生物大分子充分釋放出來的過程。蛋白質(zhì)和酶的提取(1)、水溶液提取法：常用方法緩沖液，稀鹽溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大用量越大，提取越安全，濃度不能過稀溫度，pH，鹽濃度（2）有機溶劑提取法與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固的蛋白質(zhì)和酶，常用不同比例的有機溶劑提取。在提取蛋白質(zhì)的過程中，應(yīng)加入表面活性劑（SDS）、還原劑（DTT，巰基乙醇）、變性劑（尿素）、酶（RNAse,DNAse）、蛋白酶抑制劑（PMSF,aprotinin,Leupeptin,pepstatin）等。一、層析技術(shù)(chromatographytechniques)1、發(fā)展1903年俄國植物學(xué)家TswettCaCO3和石油醚葉綠素提取液

樣品混合物的分離過程是樣品中各組分在色譜分離柱的兩相間不斷進行著的分配過程?！锲渲械囊幌喙潭ú粍?，稱為固定相；★另一相是攜帶樣品混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。20世紀50年代Cermer氣相層析技術(shù)60年代高壓液相層析技術(shù)80年代超臨界色譜90年代微量高效液相1947年美國原子能委員會離子交換層析分離稀土元素論文蛋白快速分離系統(tǒng)（FPLC）(1)、層析技術(shù)的應(yīng)用范圍2、層析特點范圍：無機，有機，生物大分子以及活體生物等。（2）、分析參數(shù)對物質(zhì)進行定量、定性和純度鑒定。吸附層析，分配層析，排阻層析，離子交換層析，親和層析，金屬螯合層析，疏水層析，反向?qū)游?，聚焦層析，灌注層?、層析分類(1)、按層析的分離相狀態(tài)分類：氣相層析，液相層析，超臨界層析(2)、按層析的分離機理分類4、層析技術(shù)術(shù)語(1)、層析圖譜

以組分的保留值為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，得到層析圖譜（層析曲線）。HPLCL：標(biāo)準胰蛋白酶峰(2)、層析峰的區(qū)域與名稱保留體積：自流動相中的某一組分進入層析柱開始到出現(xiàn)該組分峰最高點時，所收集的體積.保留時間：自流動相中的某一組分進入層析柱開始到出現(xiàn)該組分峰最高點時，所需要的時間。兩層析峰之間必須有足夠遠的距離，這是由分配系數(shù)決定的；每一個層析峰的峰寬盡可能窄，與層析過程中的傳質(zhì)速度和擴散行為有關(guān)。1、分離現(xiàn)象二、層析的原理完全分離，必須具備兩個基本條件：塔板理論和速率理論將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入色譜柱后，就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作一個理論塔板（theoreticalplate），一個理論塔板的長度稱為理論塔板高度（theoreticalplateheight）H。經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。由于色譜柱內(nèi)的塔板數(shù)相當(dāng)多，因此即使組分分配系數(shù)只有微小差異，仍然可以獲得好的分離效果。塔板理論三、液相層析(liquidchromatography)1、原理2、液相層析儀器3、固定相4、流動相5、應(yīng)用(1)、基本構(gòu)造儲液器層析柱檢測器記錄器收集器2、液相層析儀器HPLC儲液器儲存樣品和流動相的試劑瓶

層析柱包括：層析介質(zhì)、柱管和柱管的各種接口。有機無機生物金屬柱有機玻璃柱玻璃柱檢測器包括：光學(xué)檢測器和化學(xué)檢測器吸收離子導(dǎo)電光學(xué)檢測器：a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，80%檢測波長：215nm，254nm，280nm檢測波長連續(xù)可調(diào)光源：氘燈，汞燈，空心陰極燈，

流動池：石英玻璃，5、10、20、

50、100μlb.熒光檢測器：靈敏度高專一性強稠環(huán)芳烴，甾族化合物，蛋白質(zhì)（酶），氨基酸，維生素，色素等c.示差折光率檢測器：偏轉(zhuǎn)式和反射式旋光物質(zhì)化學(xué)檢測器：電導(dǎo)檢測器：電流樣品濃度

記錄器：將檢測器檢測到的信號放大、計算、處理以圖表的形式顯示出來。其它附件：部分收集器，定量輸液泵，梯度混合器等。3.固定相固定相(層析介質(zhì)、填料、填充劑)：不溶于溶劑和水的固體化顆粒。

材料：無機----Al2O3，硅膠，沸石、硅藻土等有機-----聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸等多糖類----葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺等。層析介質(zhì)與生物大分子的關(guān)系分離生物大分子的介質(zhì)大孔徑、親水性好的球形材料多糖類凝膠類層析介質(zhì)不同膠聯(lián)度－－不同分子量適合：多糖、酶、蛋白質(zhì)、核酸葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel）缺點：剛性差，不能耐壓，分離時間長層析介質(zhì)的性能球形：實心和空心，網(wǎng)狀球不定形（纖維素粉、沸石等）a.形狀MILLIPORE獨特基質(zhì)和多種特異性親和配基的Prosep親和層析介質(zhì),適合不同抗體的純化。b.技術(shù)指標(biāo)：機械強度：即剛性，衡量層析介質(zhì)耐壓程度的一個重要標(biāo)志，常用Pa表示。機械強度高，流速快，保留值小。粒度大?。褐睆剑é蘭）粒度大的介質(zhì)，流速快，理論塔板數(shù)量低，分離效果差。反之，分離效果好。均勻度：介質(zhì)顆粒大小在一定范圍內(nèi)的正態(tài)分布。如50μm－150μm層析過程中，顆粒大小均勻、流速快，線性關(guān)系，峰值集中。理化性質(zhì)：表示合成介質(zhì)的材料及合成后的介質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。

優(yōu)：性質(zhì)穩(wěn)定，非特異吸附少，親水性好，能耐受一定濃度的酸堿和有機溶劑。吸附容量：指單位質(zhì)量或體積的層析介質(zhì)吸附流動相中溶質(zhì)的質(zhì)量，常用mg/g，mg/ml，mol/g,etc.表示吸附容量大小分離效率4、流動相兩類：緩沖液：合適濃度、pH值、離子強度、緩沖容量等。有時加保護劑：如抗氧化劑：DTT，巰基乙醇；穩(wěn)定劑：離子強度，糖類，尿素；蛋白酶抑制劑：PMSF

有機溶劑：極性和溶解度分離生物大分子：甲醇，乙醇，乙腈，丙醇等。5、應(yīng)用層析定性分析：a.保留值及其測定方法：

絕對保留值：溫度、流速、固定相性質(zhì)、樣品雜質(zhì)等影響，導(dǎo)致重現(xiàn)性差。

相對保留值：常用法。與柱溫，固定相性質(zhì)關(guān)。b.已知內(nèi)標(biāo)法：在未知樣品中加入一定的已知物使層析峰增高來進行定性分析。在一定的層析操作條件下，待測物的含量與層析儀檢測器上產(chǎn)生響應(yīng)的信號成正比。積分儀純度鑒定：層析的定量分析：根據(jù)層析峰的數(shù)量判斷純度。純的物質(zhì)只有一個保留值。通過適當(dāng)?shù)臉悠诽幚矸椒?，游離的和結(jié)合的植物激素類似物[大豆素(daidzein)，雌馬酚(eguol)，染料木素(genitein)，芒柄花素(formononetin)，香豆雌酚(coumestrol)和美皂異黃酮biochaninA)]從新鮮植物材料白三葉草(Trifoliumrepens)的提取物中分離出來。并在不同的紫外光波長下，可被HPLC法定量測定。根據(jù)滯留時間和標(biāo)準品的添加，可鑒定出植物激素類似物的層析峰。本方法的測定靈敏度為2ppm。通過比較游離植物激素類似物的含量測定，本方法的提取率比經(jīng)典的甲醇浸提法更為有效。應(yīng)用實例1、發(fā)展歷史2、原理3、吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)4、吸附層析技術(shù)5、分離過程6、應(yīng)用實例四、吸附層析(absorptionchromatography)1、發(fā)展歷史凡是利用固定相表面的活性基團來吸附流動相中溶質(zhì)而進行分離的方法，稱為吸附層析。1903年，俄國植物學(xué)家CaCO3作固定相石油醚作流動相分離植物葉片壓汁中的色素類物質(zhì)。1931年，氧化鋁作吸附介質(zhì)分離胡蘿卜素的同分異構(gòu)體，表明吸附層析有較高的分辯率。后來，活性碳、羥基磷灰石、磷酸鈣、硅膠、沸石、聚苯乙烯聚合物作介質(zhì)，分離aa，核苷酸，蛋白質(zhì)，胺類化合物，生物堿類，黃酮類等

生物、有機和天然藥物分子。推出具高分辨率的用于微量分析的吸附層析介質(zhì)。2、原理吸附現(xiàn)象吸附：密集行為吸附現(xiàn)象：溶質(zhì)從溶液中到停留在固體表面上這一過程。固－氣，固－液，液－氣吸附介質(zhì)與被吸附物質(zhì)：吸附與被吸附吸附力的產(chǎn)生吸附類型物理吸附：范德華力無選擇性，吸附速度快，可逆吸附力較強，吸附過程中釋放的能量小，吸附的分子層有單層、有多層，易被解吸附。化學(xué)吸附：化學(xué)鍵選擇性吸附，吸附速度慢，吸附過程中釋放的能量大，吸附力強，不易被解吸附，被吸附的分子層只有單層。復(fù)合吸附：物理吸附和化學(xué)吸附同時發(fā)生飽和吸附：吸附解吸附平衡檢測流入和流出溶液中被分離物質(zhì)的量，如果相等，表示該層析柱已達飽和吸附。3、吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)種類多；多為天然材料制：如硅膠，氧化鋁，沸石，活性碳，磷酸鈣等；少數(shù)為化學(xué)合成：聚酰胺，聚苯乙烯等。活性炭：動物炭，植物炭和礦物炭產(chǎn)生范德華力形成的吸附。吸附能力與溶劑、極性、pH、同系物有關(guān)。

三類：顆粒、粉末和錦綸黏合活性炭

硅膠：硅酸鹽（SiO2?χH2O）；極性吸附介質(zhì)：化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，吸附量大。再生：5-10倍體積的0.25mol/LNaCl回流30min,熱過濾，用dH2O洗至pH8，再經(jīng)3－6倍體積的5%乙酸回流30min，過濾，再用dH2O洗至中性，乙醇洗2次，用水轉(zhuǎn)換乙醇，晾干，120C燒烤12h氧化鋁：疏水性吸附介質(zhì)，分離非極性化合物吸附容量大，分離效果好，尤其對脂溶性天然小分子，如醛、酮、醌等。價格低廉羥基間相互作用形成氫鍵三類：堿性、酸性和中性磷酸鈣：極性吸附介質(zhì)分離生物大分子蔗糖鈣＋磷酸或CaCl2+磷酸氫二鈉調(diào)pH溶質(zhì)分子中的酸性基團對Ca2+有吸附，用高濃度的磷酸鹽洗脫。

雙鏈和單鏈DNA，變性和復(fù)性DNA聚苯乙烯：非極性吸附介質(zhì)分離分子中含有硝基、氯原子和酚羥基化合物介質(zhì)顆粒內(nèi)部有穿透孔，利用吸附溶液中的化合物，剛性強，流速快，分辨率高。聚丙烯酰胺：極性吸附介質(zhì)，分離極性化合物吸附特異性強、分辨率高、吸附容量大、可選擇性強。酰胺基與被分離物質(zhì)的羥基形成氫鍵，形成氫鍵的強弱與溶劑、pH有關(guān)4、吸附層析技術(shù)吸附劑的選擇：被分離物質(zhì)的特性：極性對極性；非極性對非極性介質(zhì)的容量：吸附容量大介質(zhì)的通用性：多功能；利于分離混合樣品介質(zhì)的穩(wěn)定性：理化性質(zhì)穩(wěn)定介質(zhì)的剛性：剛性強，粒度均勻，提高的層析流速溶劑和洗脫劑的選擇：對樣品溶解度和穩(wěn)定性；對檢測器不敏感洗脫劑還應(yīng)有較強的解吸附能力，保證洗下的物質(zhì)的穩(wěn)定，不發(fā)生聚合、沉淀、變性和相關(guān)化學(xué)反應(yīng)。洗脫過程：在洗脫過程中，柱內(nèi)的吸附介質(zhì)、吸附溶質(zhì)不斷發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，如此反復(fù)循環(huán)的過程。利用保留值大小，將物質(zhì)分開。在吸附層析中，大多以有機溶劑為洗脫劑，只適合有機化合物的分離；中性鹽溶液適合生物大分子。5、分離過程

6、應(yīng)用實例細胞色素C的制備(1)、原理：細胞色素C是細胞色素家族中的一員，主要存在于細胞線粒體中。分子內(nèi)含有鐵卟啉，是一種結(jié)合蛋白，13kD，蛋白質(zhì)部分由104aa。在胞內(nèi)以氧化型和還原性2種形式存在。前者在水溶液中呈深紅色，后者則為桃紅色，在酸性溶液中溶解度大，對熱、酸、堿較穩(wěn)定，在三氯乙酸或乙酸中易變性失活。人造沸石（硅鋁酸鹽）對細胞色素C有較好的吸附作用，吸附后的細胞色素可用25%硫銨溶液洗脫，即可與其它雜蛋白分開。（2）、試劑和材料層析柱（10cm×1cm）(3)、方法材料與處理：新鮮豬心臟提取離心，取上清裝柱柱層析吸附：控制流速洗脫：控制流速鹽析20%TCA沉淀離心透析：沉淀對dH2O凍干，保存五、離子交換層析(ionexchangechromatography)1、原理2、離子交換層析介質(zhì)3、常用的離子交換層析介質(zhì)及其特性4、離子交換介質(zhì)的指標(biāo)5、離子交換層析技術(shù)6、洗脫曲線的分析7、影響離子交換層析的因素8、離子交換劑的處理與再生9、應(yīng)用實例離子交換層析：利用固定相偶聯(lián)的離子交換基團和流動相解離的離子之間發(fā)生可逆的離子交換反應(yīng)而進行分離的方法。離子交換介質(zhì)是在一種高分子的不溶性固體（載體）上引入具有活性的離子交換基團，即陽離子交換基團或陰離子交換基團。1、原理離子交換劑的交換作用CCCA,BABC++2CAAA+2BKd=Ms/MlKd為分配系數(shù)Ms為單位質(zhì)量的離子交換介質(zhì)的摩爾質(zhì)量Ml為單位體積溶液中溶質(zhì)的摩爾質(zhì)量在一定情況下，吸附在離子交換介質(zhì)上的離子的量與溶液中游離離子的量達到平衡時，二者物質(zhì)的質(zhì)量比，稱為分配系數(shù)或平衡常數(shù)。2、離子交換層析介質(zhì)惰性載體和交換基團高分子化合物或多糖類化合物交聯(lián)而成的球形顆粒易解離的酸根基團或堿性基團載體：特點：應(yīng)具有良好的親水性、水不溶性、

較好的化學(xué)穩(wěn)定性和較多的活化基團分類：化學(xué)原料合成載體，如聚苯乙烯樹脂；

天然材料制成，如瓊脂糖凝膠。離子交換基團

特點：酸性離子基團，即陽離子交換基團堿性離子交換基團，即陰離子交換基團分類：強酸性陽離子交換基團（如磺酸基）中強酸性陽離子交換基團（如磷酸基）弱酸陽離子交換基團（如羧酸基）強堿性陰離子交換基團（如季胺基）弱堿性陰離子交換基團（如伯胺基）交換基團的交換反應(yīng)式：

陽離子交換基團－R－SO3-H＋+Na+－R－SO3-Na+H+磺酸基：陰離子交換基團－R－N＋（C2H5）3OH-+Cl-－R－N＋（C2H5）3Cl+OH-3、常用的離子交換層析介質(zhì)及其特性聚苯乙烯樹脂離子交換介質(zhì)：特點：剛性強，流速快，效率高，適合小分子強離子型化合物的分離如Dowex-50(Sigma)，樹脂201×8（國產(chǎn)）纖維素離子交換介質(zhì)：特點：具有較好的親水性，對生物大分子或有機小分子均可分離價格便宜，適合規(guī)模化生產(chǎn)如DEAE－Sephacel(Phamarcia)DEAE-纖維素-（DE32）（國產(chǎn)）葡聚糖凝膠離子交換介質(zhì):特點：具有較好的親水性和凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，適用于生物大分子化合物的分離。如CM－SephadexC25(Phamarcia)DEAE-葡聚糖（國產(chǎn)）瓊脂糖凝膠離子交換介質(zhì)：特點:具有較好的親水性，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大孔性，剛性好，能耐受一定的操作壓，流速快，分辨率高，非特異性吸附少。適用于生物大分子的分離、可用于大規(guī)模的分離純化。如DEAE－Sepharose-4B(Phamarcia)CM-QT4(國產(chǎn))4、離子交換介質(zhì)的指標(biāo)交換容量及其表示方法:表示在單位質(zhì)量或單位體積的離子交換介質(zhì)中所能交換溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量。固體：mg/gormmol/g溶脹好的介質(zhì)：mg/mlormmol/ml交換容量的測定方法一般以酸、堿滴定法確定強酸性或強堿性離子交換介質(zhì)的交換容量，或者通過吸附某一特定的生物大分子的質(zhì)量來確定弱酸或弱堿性離子交換介質(zhì)的交換容量。強酸型陽離子交換介質(zhì)交換容量的測定交換容量的測定方法：交換容量（mmol/g）=測得的氫離子毫摩爾數(shù)量（mmol/L）離子交換介質(zhì)的質(zhì)量（g）離子交換介質(zhì)去離子水溶脹漂洗干凈1mol/LNaOH離子水洗至中性1mol/LNaCl洗脫收集洗脫液NaOH滴定吸附氫離子的毫摩爾數(shù)量溶脹系數(shù)大多介質(zhì)以干燥的小圓珠或粉末狀保存，使用前要經(jīng)過溶脹才能用。指每克干的離子交換介質(zhì)吸水后膨脹的體積，ml/g溶脹體積與介質(zhì)交聯(lián)度有關(guān)，如Sepharose4BFF：1g干膠溶脹后能獲得5ml凝膠介質(zhì)，其溶脹系數(shù)為5。介質(zhì)粒度介質(zhì)顆粒直徑的大小，μm。4類：粗：100－500μm大規(guī)模制備中粗：50－150μm小型制備兼分析中細：20－80μm分析細：5－30μm微量分析，HPLC理化性質(zhì)：剛性：較高壓力下不變形，柱床體積保持穩(wěn)定物理穩(wěn)定性：耐熱－不影響交聯(lián)度化學(xué)穩(wěn)定性：強酸、強堿和高濃度鹽不使化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，并具抗氧化能力。5、離子交換層析技術(shù)離子交換層析介質(zhì)的選擇解離度及解離后所帶電荷的性質(zhì)緩沖液的pH與被分離物質(zhì)的等電點比較大于負電荷陰離子交換介質(zhì)小于正電荷陽離子交換介質(zhì)對于生物大分子，被分離物質(zhì)的等電點與溶液的pH值之間的差別至少要在一個pH值以上。差別越大，越利于交換層析的進行。未知被分離物質(zhì)的等電點:++++pH4.0+++pH4.5++pH5.0+pH5.5-pH6.0-pH6.5-pH7.0選擇的基本原則：

已知被分離物等電點：緩沖液的選擇緩沖液：弱酸和強堿、強酸和弱堿、弱酸和弱堿原則：利于樣品的穩(wěn)定；利于樣品的吸附和洗脫；利于樣品后處理。是否有毒性，是否有熱源。

包括：濃度、緩沖容量、pH值、離子強度和保護劑。緩沖容量：在緩沖容量滿足的前提下，濃度盡可能低。

pH：緩沖溶液pH最少要高于或低于被分離物質(zhì)pI1個pH單位，盡量遠離樣品的pI。離子強度：在保證樣品穩(wěn)定的前提下，盡可能用低離子強度，利于樣品發(fā)生離子交換。保護劑：某些樣品在溶液中不穩(wěn)定，需加入如鹽類、糖類、抗氧化劑類或尿素等。上樣及洗脫方式：上樣上樣量：與離子交換介質(zhì)的交換容量有關(guān)，上樣量不超過交換容量的10%－20%。W＝V×E

W為上樣量V為柱床體積E為介質(zhì)的交換容量樣品濃度：不宜過高，過高，粘度大，傳質(zhì)速度慢，不利于交換，回收率下降。離子強度：不宜過高。過高則影響介質(zhì)對溶質(zhì)的吸附。流速：與樣品的濃度、溶液的粘度、樣品的解離度及分子量的大小有關(guān)。洗脫方式一步洗脫：常用指用一種濃度的洗脫劑進行洗脫；只針對組分單一或被分離組分明確。分步洗脫：兩種以上的組分，吸附能力有差異，可以采取同濃度的洗脫劑或不同種類的洗脫劑進行洗脫。

針對吸附數(shù)量少、分離度差別較大的組分。梯度洗脫：多種組分，吸附能力有差異，在洗脫時采用濃度連續(xù)變化的洗脫劑進行洗脫。

適合吸附數(shù)量較多、分離度差別較小、用一步或分步難以分離的組分洗脫。

方式：離子強度，pH，離子強度＋pH洗脫劑：酸、堿和鹽溶液，用來改變整個系統(tǒng)的酸堿度和離子強度，使結(jié)合在離子交換柱上的組分性能發(fā)生改變。當(dāng)洗脫液中的離子強度大于結(jié)合在離子交換柱上的組分或柱內(nèi)的酸堿度發(fā)生改變甚至超過其pI時，該組分逐漸被洗脫。6、洗脫曲線分析洗脫峰變?。褐邮褂枚啻魏?，柱內(nèi)介質(zhì)的交換容量變小，洗脫峰一次比一次小，上樣時流出液中有效組分有含量增多，此時柱內(nèi)介質(zhì)需再生和處理。洗脫峰部分重疊：在離子交換層析過程中，相鄰的洗脫峰出現(xiàn)部分重疊的現(xiàn)象。

原因：相鄰組分的性質(zhì)相近離子強度或酸堿性太大洗脫峰拖尾：在離子交換層析過程中，洗脫峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象或兩峰之相距較遠。

原因：洗脫液中的離子強度偏低或梯度洗脫的斜率偏低。

措施：適當(dāng)增加洗脫液的離子強度、提高洗脫曲線的斜率或采用混合梯度洗脫。7、影響離子交換層析的因素離子交換介質(zhì)的影響凝膠孔徑對分離度的影響：保留值與靜電效應(yīng)和大孔徑的凝膠載體的分子篩效應(yīng)。凝膠孔徑對柱容量的影響：柱容量與介質(zhì)的表面成正比。30-50nm孔徑可分離100kD以上的蛋白質(zhì)。離子交換柱長度的影響柱長易造成分子篩效應(yīng)，使保留值延長，引起洗脫峰的擴散，出現(xiàn)重疊。使用短柱優(yōu)點：洗脫體積相對集中，相應(yīng)濃度較高，易提高檢測靈敏度，柱的負載少，操作壓小，有利于提高流速。緩沖液的影響pH：弱電解質(zhì)和兩性解離的大分子如分離蛋白質(zhì)時，緩沖液pH高于蛋白質(zhì)pI，帶負電荷，低于pI，帶正電荷。緩沖容量：對溶液的pH起平衡作用。緩沖液濃度：離子強度增加，離子與分離物的親和力大，降低被分離物質(zhì)與交換介質(zhì)的親和力，抑制了被分離物質(zhì)與介質(zhì)的交換作用。流速的影響

直接影響交換率。流速慢，溶液中的離子流過介質(zhì)所需要的時間長，易與介質(zhì)發(fā)生交換作用。如分離70kD的蛋白質(zhì)，要保持小分子一樣的柱效，流速必須降低10倍，相當(dāng)于小分子量流速的1/10。8、離子交換劑的處理與再生新購買的離子交換介質(zhì)與使用多次柱效下降的交換介質(zhì)要進行處理和再生。聚苯乙烯類介質(zhì)

新介質(zhì)：70%乙醇浸泡，除去介質(zhì)中少量的脂溶性物質(zhì)，再分別用1mol/LHCl和1mol/LNaOH

進行處理。

使用過的介質(zhì)：用1mol/LHCl、1mol/LNaOH或1mol/L

NaCl溶液再生。纖維素粉類介質(zhì)

新介質(zhì)：70%乙醇浸泡，再分別用0.5mol/LHCl和

0.5mol/LNaOH進行處理。使用過的介質(zhì)：分別用0.5mol/LHCl、0.5mol/LNaOH或

1mol/LNaCl溶液再生。凝膠類介質(zhì)

多數(shù)為多糖類載體，分子中有許多糖苷鍵，在強酸強堿下容易發(fā)生水解，尤其是在強酸溶液中糖苷鍵易斷裂，因此要避免強酸強堿。

Sephadex可用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH進行處理。

Sepharose可用0.5－1.0mol/LNaCl或0.1-0.5mol/L

快速洗脫處理。9、應(yīng)用實例多克隆抗體制備目的：

獲得特異性強、親和力高、稀釋倍數(shù)(效價)大的抗體，用于免疫的動物與免疫原在種屬關(guān)系應(yīng)不同，且親緣關(guān)系愈遠愈好。免疫原的制備是一個中心環(huán)節(jié)針對合成的全抗原，用SephadexG-25萄聚糖凝膠過濾層析，以脫鹽去雜質(zhì)和結(jié)合蛋白后才用于免疫，三免后每次采集的兔血經(jīng)離心去紅細胞，取抗血清進行效價檢測。1.抗體簡單純化多抗血清中含的不光是針對半抗原的抗體，還含有較多的雜蛋白，如：白蛋白、血紅蛋白、多種球蛋白等。如不除去干擾抗原抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的非特異性吸附的這些蛋白就可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。所以需對多抗血清進行提純。2、離子交換層析純化ELISA對抗體的純度要求較高，鹽析粗提去雜蛋白，不能滿足要求，雖然得到的r球蛋白大部份是IgG,但還有0.5%的為其它區(qū)帶蛋白和IgG，需用離子交換層析進一步進行純化。

離子交換層析是利用不同蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)的不同達到分離純化蛋白的目的。蛋白質(zhì)進入離子交換柱后，IgG與離子交換樹脂進行選擇性結(jié)合，與離子交換樹脂無親和力的蛋白質(zhì)被洗脫下來。余下的蛋白質(zhì)都結(jié)合在樹脂上。由于不同蛋白質(zhì)電荷不同，與樹脂的親和力也各不相同。可用漸增加洗脫液中的反電荷離子的方法將其它的一一洗脫下來。離子交換層析純化抗體時，首先確定目的蛋白的等電點（pI），所以過柱前需對目的IgG進行等電點測定；根據(jù)PI選擇用陽性或陰性離子交換樹脂；離子交換用的緩沖液（洗脫液）的pH值應(yīng)與目的蛋白的等電點相差一個單位，這樣可使蛋白質(zhì)的凈電荷量既保證將其結(jié)合在樹脂上，又不需洗脫時使用苛刻的條件；選擇反荷離子要遵循反荷離子既要具有與目的蛋白競爭結(jié)合的能力，但又不至于濃度過高或過低使目的蛋白變性；樹脂裝填要均一，不能有斷層和氣泡；裝柱后充分平衡，否則會影響上樣后目的蛋白與樹脂的結(jié)合；上樣過程嚴格小心，不要破壞柱平面；洗脫時流速控制在0.5ml/min，更換洗脫溶液時最好將柱上端前次洗脫液除去，以減少由于洗脫濃度稀釋而出現(xiàn)拖尾。收集時務(wù)必對每個出現(xiàn)的吸收峰進行收集檢測，以確定目的蛋白洗脫時離子強度。用抗原包被聚苯乙烯板孔，加收集液反應(yīng)，洗去游離物，再加酶標(biāo)二抗顯色反應(yīng)，顏色越深證明收集液里的目的抗體越多.當(dāng)然要想獲得更純的抗體，可過親和層析來實現(xiàn)。六、親和層析1、原理2、親和層析介質(zhì)3、親和層析介質(zhì)的制備4、親和層析技術(shù)5、影響親和層析的主要因素6、應(yīng)用實例1、原理親和層析：根據(jù)流動相中的生物大分子與固定相表面偶聯(lián)的特異性配基發(fā)生親和作用，并有選擇性吸收溶液中的溶質(zhì)而進行的層析分離方法。待分離物質(zhì)與配基專一性結(jié)合，分辨率高，操作簡單，通過一次性操作即可得到較高純度的分離物質(zhì)。優(yōu)點：利用生物學(xué)的特異性進行分離，因此分離條件比較溫和，能夠很好地保持樣品原有的生物學(xué)性質(zhì)。具有濃縮作用，可從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品，有的純化倍數(shù)達幾千倍。2、親和層析介質(zhì)載體：

纖維素、sephadex、sepharose、Bio-gel等；配基：有機小分子類：氨基酸類、核苷酸類、烷基類；生物大分子類：酶類、抑制劑類、蛋白質(zhì)、抗原抗體類染料：藍色葡萄糖、熒光染料等?；罨瘎?/p>

200多種；溴化氰、環(huán)氧氯丙烷等3、親和層析介質(zhì)的制備

配基必須與載體有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后不影響配基和被分離生物大分子的專一結(jié)合特性；

配基的選擇條件若分離物質(zhì)是生物分子，盡量選擇分子量較大的化合物作為配基，以減少在分離過程中的空間阻隔。配基必須能與被分離物質(zhì)發(fā)生親和作用，且專一性強，以便更有效地分離目標(biāo)產(chǎn)物；配基與生物大分子結(jié)合后，在一定條件下能夠被解吸附，且不破壞生物大分子的生物活性和理化性質(zhì)；載體的選擇原則：不溶于水，具有高度親水性，載體上的配基易與水溶液中的親和介質(zhì)接近并結(jié)合。具有稀松的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)好的機械性能，均勻的球形顆粒，較強的剛性，維持較好的流速。有足夠數(shù)量的化學(xué)基團；惰性化學(xué)性質(zhì)，極少的物理吸附。

載體的基本性質(zhì)

纖維素：葡萄糖殘基－氫鍵；純化倍數(shù)不高。葡聚糖凝膠：葡聚糖經(jīng)環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成；具良好的化學(xué)和物理穩(wěn)定性，多孔性差，孔徑小，影響在親和層析中的應(yīng)用。瓊脂糖凝膠：D－半乳糖和L－半乳糖交替結(jié)合而成；機械強度隨凝膠濃度降低而降低。etc.凝膠類載體的特點

凝膠介質(zhì)上的羥基易被多種活化劑活化，并易引入不同的基團；具有大孔性和親水性；剛性較好；極低的非特異性吸附；理化性質(zhì)較穩(wěn)定?；罨瘎┑倪x擇：

溴化氰：活化效率高，活化速度快；易產(chǎn)生劇毒的氫氰酸，活化臂短，不利于生物大分子結(jié)合。環(huán)氧丙烷：堿性條件下活化載體、活化效率高，活化臂長，利于生物大分子結(jié)合；活化溫度較高，活化時間長。1，4－丁二醚：活化臂長，其余與環(huán)氧丙烷類似?；罨瘎囟取鎝H時間min溴化氰41010-30環(huán)氧氯丙烷45－56131201，4-丁二醚50±113120常用幾種活化劑的活化條件親和介質(zhì)的技術(shù)指標(biāo)：

配基偶聯(lián)量：每克或每亳升載體偶聯(lián)的微摩爾數(shù)。樣品吸附量：每克或每亳升載體偶聯(lián)的毫克數(shù)化學(xué)穩(wěn)定性：抗氧化物，配基不降解。耐酸堿：指穩(wěn)定的pH應(yīng)用范圍，如pH3-10親和層析介質(zhì)預(yù)處理裝柱平衡上樣品洗去未吸附雜質(zhì)洗脫收集洗脫峰親和吸附劑的再生4、親和層析技術(shù)吸附條件的選擇層析柱：吸附容量和分離物質(zhì)的總量緩沖液pH離子強度樣品上柱體積溫度速度樣品上柱后，用10倍柱床體積的平衡液流洗除去未吸附的雜蛋白，也可用高離子強度的鹽溶液進一步洗去非專一吸附的雜質(zhì)，盡可能在親和柱上只留下專一吸附的結(jié)合物。洗脫條件的選擇：競爭性洗脫離子強度洗脫：NaClpH離子強度洗脫變性劑洗脫化學(xué)斷裂洗脫方式：一步洗脫，分步洗脫，梯度洗脫親和層析結(jié)束后，用大量洗脫液洗滌親和柱，再用平衡液使柱子充分平衡，親和柱可反復(fù)使用。多次使用后，親和效率下降，此時親和介質(zhì)需經(jīng)再生處理，可采用高鹽、有機溶劑、蛋白變性劑徹底洗脫介質(zhì)上非特異性吸附的大分子，使介質(zhì)恢復(fù)原來的吸附性能：▲0.5－1.0mol/LNaCl中性鹽處理，除去離子性較強的雜質(zhì)；▲異丙醇處理，除去疏水性較強的雜質(zhì)；▲6mol/L脲處理，除去中性分子雜質(zhì)；▲6mol/L鹽酸胍處理，除去中性分子雜質(zhì)。親和介質(zhì)的處理親和層析介質(zhì)一般保存于溶脹狀態(tài)，溫度為4－8℃，不可冷凍，否則會破壞凝膠的珠狀結(jié)構(gòu)。在保存液中加入20%的乙醇或0.02%的硫柳汞以防止長菌。而活化的thiol-sepharose4B或thiopropyl-sepharose6B帶巰基的介質(zhì)不能用硫柳汞。親和介質(zhì)的保存樣品體積:：上樣量不超過柱床體積最大吸附量的5%流速：盡量慢，保證被結(jié)合物與配基間有足夠的時間達平衡。柱長：吸附容量高，選擇較短柱子，較慢的線性流速；否則，反之。溫度：親和介質(zhì)的吸附強度隨溫度升高而降低。一般在4℃進行吸附，在不影響生物大分子活性的較高溫度下如25℃進行洗脫。6、影響親和層析的主要因素6、應(yīng)用實例2-胰凝乳蛋白酶的提純⒈親和吸附劑（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制備

取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr，攪拌，滴加2-8mol/LNaOH，使溶液pH維持在11。20℃左右，8-12分鐘完成反應(yīng)。在布氏漏斗中抽濾活化的瓊脂糖，然后用20倍體積冷0.1mol/LNaHCO3（pH9.0）溶液洗滌。將上述活化的Sepharose4B與等體積0.1mol/LNaHCO3（pH9.0，冰箱中預(yù)冷）溶液混合，接著迅速加入α-胰蛋白酶抑制劑（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose4B65μmol/L。4℃緩慢攪拌約24小時，而后再用水和緩沖液反復(fù)地洗至沒有游離的抑制劑為止。制得的親和吸附劑在50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0）中保存?zhèn)溆?。⒉分離

親和吸附劑裝柱后用50mmol/LTris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡（室溫）。樣品溶于相同緩沖液中并上柱，再應(yīng)用同樣緩沖液淋洗柱子。流速為30-60ml/小時，直至280nm無光吸收時停止洗滌，然后改用0.2mol/L醋酸緩沖液（pH3.0）洗脫。七、排阻層析(exclusionchromatography)1、原理2、凝膠層析介質(zhì)3、排阻層析分離條件的確定4、凝膠介質(zhì)的后處理5、排阻層析的分離模式6、應(yīng)用實例1、原理排阻層析：也稱分子篩層析、凝膠過濾。凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差和形狀異進行層析分離的方法。排阻層析介質(zhì)：最初淀粉或瓊脂糖－－血清蛋白質(zhì)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等。凝膠層析分離的分子主要有3部分：全排阻分子，也稱上限分子部分滲透分子，也稱分離分子全滲透分子，也稱下限分子有效分離范圍：

103－105參數(shù)的表示方法：

柱床體積介質(zhì)經(jīng)溶脹、裝柱、沉降、體積穩(wěn)定后，所在層析柱內(nèi)的總體積。Vt，ml

外水體積存在于柱床體積內(nèi)凝膠顆粒之外、顆粒間的空隙所占有的那一部分水相體積或溶劑體積。V0，ml

內(nèi)水體積凝膠吸水溶脹后，存在于凝膠顆粒內(nèi)所占的那一部分水相體積或溶劑體積。Vi，ml

凝膠體積凝膠顆粒自身的體積，即床體積減去外水體積和內(nèi)水體積后所占有的體積，也稱膠體積或干膠體積。Vg，ml洗脫體積自加樣液時開始，到洗脫組分濃度最大時出現(xiàn)的峰（洗脫峰峰頂）為止，所收集的體積。Ve，mlVt=V0+Vi+VgVe=V0+KdViKd=Ve-V0Vi凝膠層析介質(zhì)的分類：

葡聚糖凝膠層析介質(zhì)如：SephadexG系列，介質(zhì)的型號不同，交聯(lián)度也不同，分離的分子量范圍有差異。SephadexG-25、G-50、G-75、G-200等代表不同型號的葡聚糖凝膠。

G后面的數(shù)字表示吸水量，數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，，分子量的分離范圍越大，凝膠的溶脹體積越大。

2、凝膠層析的介質(zhì)凝膠的基本性質(zhì)：化學(xué)穩(wěn)定性，無特異性吸附，具有較好的耐受性，剛性好瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)

天然多糖混合物，源于海藻如SepharoseB系列，不同型號的瓊脂糖凝膠表示不同的瓊脂糖百分含量。B前面的數(shù)字表示瓊脂糖的百分濃度，瓊脂糖濃度越高表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，相對分子量分離范圍越小。凝膠的規(guī)格與用途：粗，中粗，中細，細，超細等凝膠性能比較：凝膠層析介質(zhì)的選擇：介質(zhì)型號凝膠粒度層析柱：柱長/柱內(nèi)徑流動相樣品的制備上樣體積：組分分離：不超過柱床體積的0.5%－5%；組別分離：不超過體積的30%3、排阻層析分離條件的確定凝膠柱的保存凝膠介質(zhì)的處理與干燥脫鹽：SephadexG-25測定相對分子量分離蛋白質(zhì)5、排阻層析的分離模式4、凝膠介質(zhì)的后處理單克隆抗體親和層析一步純化重組人生長激素1.2.1抗單克隆抗體的純化用hGH的單抗細胞株3H3制得的腹水，經(jīng)（NH4）2SO4及ProteinA-SepharoseCL4B親和柱純化，制得小鼠抗hGHIgG。

1.2.2雙層親和層析柱的制備將純化的小鼠抗hGHIgG通過CNBr法偶聯(lián)到Sepharose4B珠上，制成親和層析柱。在柱上層平面加入1.5cm高的SephadexG-75，成為純化hGH的雙層親和層析柱。

6、應(yīng)用實例1.2.3hGH的純化將離心后的hGH基因工程菌發(fā)酵破碎液加入到3×3.5cm免疫親和層析柱上，在洗脫hGH前，先用30倍床體積的PBS（含有0.2%TRITON-100）洗取不吸附的雜蛋白和非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用20倍床體積的PBS洗滌，最后用甘氨酸-HCl洗脫hGH。

1.2.4hGH純度的鑒定親和層析法純化的重組hGH純度由HPLC鑒定，WesternBlot分析及與兔抗hGH血清免疫雙擴散試驗。

八、疏水層析（hydrophobicchromatography）1、原理2、疏水介質(zhì)3、疏水層析的影響因素4、應(yīng)用實例1、原理以疏水性為固定相，以一定濃度的鹽溶液為流動相，借助于偶聯(lián)在載體上疏水基團與溶液中的一些疏水性溶質(zhì)發(fā)生疏水作用、分離具有一定疏水性的物質(zhì)而進行的層析方式。(1)、疏水基團與疏水作用疏水基團相互作用生物大分子疏水基團數(shù)分布在分子內(nèi)部或表面，表面疏水基團數(shù)量有差異，疏水強弱不同利用被分離物質(zhì)暴露在表面的疏水基團之間的差異進行分離，把不同極性的物質(zhì)分開。介質(zhì)的疏水性烷基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠珠正辛基和苯基疏水性較強，對疏水性大的蛋白有吸附作用，且吸附后不易被洗脫，如細胞色素C、血紅蛋白；甲基、丙基疏水性較弱。蛋白質(zhì)的疏水特性多數(shù)蛋白質(zhì)溶于水，具較強的親水性，但在分子內(nèi)部存在一個疏水中心。如蛋白質(zhì)分子表面含非極性氨基酸側(cè)鏈：Leu，Phe，Trp，Ala，Proetc.決定蛋白質(zhì)的疏水性。非極性氨基酸數(shù)目和結(jié)合部位，決定疏水性強弱溶液所致的疏水性細胞中天然蛋白高度折疊生物學(xué)功能離開細胞空間構(gòu)象和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，某些蛋白分子的疏水基團暴露在表面，分子極性減弱，非極性增強。如某些蛋白質(zhì)在水溶液中溶解度大，分子極性大，在高鹽溶液中疏水性明顯增大，溶解度降低，出現(xiàn)鹽析。而在低鹽中則相反。因此，疏水性可以通過鹽溶液中的離子強度改變，控制蛋白質(zhì)的極性與非極性，這就是溶液所致的疏水性。(2)、疏水基團的分離理論自由能分離理論熵分離理論疏溶理論2、疏水介質(zhì)特征：表面含有疏水性配基以烷烴類為配基的介質(zhì)，碳鏈最短的為甲基，最長的是18烷基；以芳香族類為配基的介質(zhì)，常用的是單個苯基、聯(lián)苯、二甲苯、三甲苯和苯的衍生物。3、疏水層析的影響因素鹽的影響鹽的摩爾表面張力增量鹽和離子對的作用KSCN>CaCl2

>NH4Cl>NaCl>Na2SO4具有鹽析作用的離子，如SO42－具有鹽溶作用的離子，如Cl-利用鹽析和鹽溶的特性，可作為選擇疏水層析上樣和洗脫的條件依據(jù)。根據(jù)鹽析作用和洗脫能力的強弱，將常用的正負離子和鹽類排序：負離子PO43-、SO42-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO2-正離子（CH3）N+、NH4+、K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+鹽類Na2SO4、KH2PO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4、NaCl鹽析作用增強洗脫能力增強離子強度直接影響蛋白質(zhì)在固定相的保留值，一般增加離子強度來增加蛋白質(zhì)的保留值，降低離子強度來提高蛋白質(zhì)的解吸附能力。pH維持蛋白質(zhì)的生物活性；溶液的pH越接近蛋白的pI，疏水性增加，利于與固定相配基相互結(jié)合；相反，遠離蛋白質(zhì)的pI，疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，而利于蛋白質(zhì)洗脫。一般不采取改變?nèi)芤旱膒H來增加蛋白質(zhì)疏水性，而采用改變?nèi)芤旱碾x子強度。柱溫溫度對分離度影響疏水層析對柱溫較敏感：柱溫高，生物大分子的構(gòu)象發(fā)生改變，疏水作用增強，保留值增加，利于提高層析柱的分離度。分離小分子有效。溫度對蛋白構(gòu)象的影響自然界多數(shù)蛋白質(zhì)在高溫下易變性失活，在分離純過程中一般都是在常溫或低溫下操作。4、應(yīng)用實例JL-QT6-S-C4分離純化乙肝表面抗原JL-QT6-S-C4是一種含巰基丁烷疏水配基介質(zhì)，適合于分離中等極性的介質(zhì)。乙肝表面抗原-HbsAg在20mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液[內(nèi)含8%（NH4）2SO4]，具有一定的非極性，易與JL-QT6-S-C4疏水層析介質(zhì)上的丁烷發(fā)生疏水作用，在10mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液中非極性減弱，易從疏水柱上洗脫下來。十、金屬螯合層析九、聚焦層析十一、灌注層析十二、樣品制備十、金屬螯合層析（metalchelatingchromatography）1、原理2、金屬螯合介質(zhì)3、螯螯合層析介質(zhì)的制備4、分離條件的選擇5、金屬螯合層析分離技術(shù)6、金屬螯合層析應(yīng)注意的問題7、應(yīng)用實例1、原理利用固定相偶聯(lián)的配基－－亞胺基乙二酸鈉及二價金屬離子發(fā)生螯合作用，該金屬離子又與蛋白質(zhì)分子中的某些含有巰基或咪唑基的氨基酸結(jié)合，利用這種特性進行分析分離的方法，稱為螯合層析。組氨酸（His）、半胱氨酸(Cys)與二價金屬離子發(fā)生螯合作用；亞氨基乙二酸配基與含有金屬離子的金屬結(jié)合蛋白發(fā)生螯合作用，可將金屬結(jié)合蛋白與非金屬結(jié)合蛋白分開。特點：分離對象專一性；分離富含Cys、His的蛋白質(zhì)、酶類、肽類，如SOD、金屬硫蛋白或基因工程表達的重