生物總復(fù)習(xí)選修1專題4名師優(yōu)質(zhì)課賽課一等獎市公開課獲獎?wù)n件

選修1生物技術(shù)實(shí)踐

專題4DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)第1頁考綱內(nèi)容及能力要求考向定位1.了解DNA物理化學(xué)性質(zhì)和DNA溶解性2.二苯胺法判定DNA方法和原理3.掌握PCR技術(shù)基本原理4.能夠掌握PCR試驗(yàn)操作中主要步驟5.了解PCR試驗(yàn)中每個(gè)步驟所發(fā)生改變6.熟練進(jìn)行試驗(yàn)操作，掌握試驗(yàn)方法1.PCR反應(yīng)過程2.DNA合成方向3.PCR反應(yīng)所需試驗(yàn)條件4.PCR反應(yīng)緩沖液組成成份5.TaqDNA聚合酶應(yīng)用6.PCR試驗(yàn)中詳細(xì)操作步驟和試驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)7.PCR產(chǎn)物檢測方法第2頁基礎(chǔ)梳理

第3頁DNA粗提取與判定

基礎(chǔ)梳理1.提取DNA方法提取生物大分子基本思緒是選取一定__________或__________方法，分離含有不一樣__________或__________生物大分子。對于DNA粗提取而言，就是要利用DNA與_________、_________和__________等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面差異，提取DNA，去除其它成份。物理化學(xué)物理化學(xué)性質(zhì)RNA蛋白質(zhì)脂質(zhì)第4頁(1)DNA溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其它成份在不一樣濃度氯化鈉溶液中溶解度__________，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)鹽濃度就能使DNA_________，而使雜質(zhì)沉淀；或者使雜質(zhì)__________，DNA被析出，以到達(dá)分離目標(biāo)。(2)DNA對酶、高溫和洗滌劑耐受性蛋白酶能水解__________，不過對__________沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60~80℃高溫，而DNA在__________以上才會變性。洗滌劑能夠瓦解__________，但對DNA沒有影響。(3)DNA判定在__________條件下，DNA遇__________會被染成__________色，所以，二苯胺能夠作為判定DNA試劑。藍(lán)不一樣充分溶解溶解蛋白質(zhì)DNA80℃細(xì)胞膜沸水浴二苯胺第5頁2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)(1）試驗(yàn)材料選取凡是含有_________生物材料都能夠考慮，不過，選取________________生物組織，成功可能性會更大。在下面生物材料中選取適合試驗(yàn)材料：魚卵、豬肝、菜花（花椰菜）、香蕉、雞血、哺乳動物紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌。(2）破碎細(xì)胞，獲取含DNA濾液動物細(xì)胞破碎比較輕易，以雞血為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量__________，同時(shí)用__________攪拌，過濾后搜集濾液即可。假如試驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用__________溶解細(xì)胞膜。比如，提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎洋蔥中加入一定__________和__________，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬脱心?，過濾后搜集研磨液。DNADNA含量相對較高蒸餾水玻璃棒洗滌劑洗滌劑食鹽第6頁（3）去除濾液中雜質(zhì)在濾液中加入NaCl溶液，使NaCl溶液濃度為2mol/L，過濾除去不溶雜質(zhì)，再調(diào)整NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA，過濾去除__________中雜質(zhì),再用2mol/LNaCl溶液溶解DNA。（4）DNA析出與判定將處理后溶液過濾，加入與濾液體積__________、冷卻__________，靜置2~3min，溶液中會出現(xiàn)__________色__________物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒__________攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面水分。取兩支20mL試管，各加入物質(zhì)量濃度為__________NaCl溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mL__________。混合均勻后，將試管置于__________中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色改變，看看溶解有DNA溶液是否變__________。藍(lán)溶液相等酒精溶液白絲狀沿一個(gè)方向2mol/L二苯試劑沸水第7頁3.操作提醒以血液為試驗(yàn)材料時(shí)，每100mL血液中需要加入3g__________，預(yù)防血液凝固。加入洗滌劑后，動作要__________、__________，不然輕易產(chǎn)生大量泡沫，不利于后續(xù)步驟操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動作要__________，以免加劇DNA分子斷裂，造成DNA分子不能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要__________，不然會影響判定效果。4.結(jié)果分析與評價(jià)?，F(xiàn)配現(xiàn)用檸檬酸鈉輕緩柔和輕緩第8頁歸納整合

一、DNA粗提取與判定過程（詳細(xì)見必修2第3章第1節(jié)“走進(jìn)試驗(yàn)室”）提取DNA第一步是材料選取，其目標(biāo)是選取DNA含量較高生物材料，不然會因?yàn)樵囼?yàn)過程中或多或少損失而造成檢測困難；第二步是DNA釋放和溶解，這一步是試驗(yàn)成功是否關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)DNA全部溶解；第三步是DNA純化，即依據(jù)DNA溶解特征、對酶及高溫耐受性不一樣等特征，最大程度地將DNA與雜質(zhì)分開；第四步是對DNA進(jìn)行判定，這是對整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果檢測。第9頁二、DNA溶解度與NaCl溶液濃度關(guān)系當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA溶解度升高。第10頁跟蹤訓(xùn)練（

年江蘇卷）以下敘述中錯(cuò)誤是（）A.改變NaCl溶液濃度只能使DNA溶解而不能使其析出B.在沸水浴中，DNA遇二苯胺試劑會展現(xiàn)藍(lán)色C.加鹽和加酒都能抑制微生物生長D.密封瓶口前最好將瓶口經(jīng)過火焰以防雜菌污染第11頁

解析：當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA溶解度升高；NaCl溶液濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最低。所以，改變NaCl溶液濃度能夠使其析出。

答案：A第12頁血紅蛋白提取和分離

基礎(chǔ)梳理1.凝膠色譜法凝膠色譜法也稱做__________，是依據(jù)____________大小分離蛋白質(zhì)有效方法。大多數(shù)凝膠是由____________組成多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫通通道，當(dāng)相對分子質(zhì)量不一樣蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠時(shí)，相對分子質(zhì)量較小蛋白質(zhì)__________進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，旅程__________，移動速度__________；而相對分子質(zhì)量__________蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，只能在__________移動，旅程__________，移動速度__________。相對分子質(zhì)量不一樣蛋白質(zhì)分子所以得以分離。較快分配色譜法相對分子質(zhì)量多糖類化合物輕易較長較慢較大凝膠外部較短第13頁2.緩沖溶液緩沖溶液作用是_____________________________________________。緩沖溶液通常由1~2種_________溶解于水中配制而成。生物體內(nèi)進(jìn)行各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定pH下進(jìn)行，比如：血漿pH是_________。為了能夠在試驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)過程，就必須保持體外pH與體內(nèi)__________?；疽恢略谝欢ǚ秶鷥?nèi)，抵制外界酸和堿對溶液pH影響，維持pH基本不變緩沖劑7.35~7.45第14頁3.電泳電泳是指帶電粒子在__________作用下發(fā)生__________過程。許多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解離基團(tuán)，在一定pH下，這些基團(tuán)會帶上__________。在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷__________電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子__________以及分子本身__________、__________不一樣，使帶電分子產(chǎn)生不一樣_________，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子分離。兩種慣用電泳方法是_______________和____________________，在測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用____________________________。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率取決于__________以及__________等原因。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，蛋白質(zhì)遷移速率完全取決于蛋白質(zhì)__________。分子大小電場遷移正電或負(fù)電相反帶電性質(zhì)大小形狀遷移速度瓊脂糖凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法它所帶凈電荷多少分子大小第15頁4.蛋白質(zhì)提取和分離蛋白質(zhì)提取和分離普通分為四步：__________、__________、__________和__________。5.樣品處理血液由__________和__________組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞含有________________________________特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一個(gè)非常主要蛋白質(zhì)：__________，其作用是________________________________________，血紅蛋白由__________個(gè)肽鏈組成，其中每條肽鏈圍繞一個(gè)__________基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶__________________。血紅蛋白因含有_____________________而展現(xiàn)紅色。紅細(xì)胞洗滌洗滌紅細(xì)胞目標(biāo)是________________________________________，采集血樣要及時(shí)采取__________分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明__________，樣品處理粗分離純化純度判定血漿各種血細(xì)胞無細(xì)胞核，無細(xì)胞器，含有大量血紅蛋白血紅蛋白攜帶氧氣和二氧化碳4亞鐵血紅素一分子氧或一分子二氧化碳血紅素去除雜蛋白________離心血漿第16頁將下層暗紅色__________倒入燒杯，再加入__________，遲緩攪拌，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至_______________，表明紅細(xì)胞已洗滌潔凈。血紅蛋白釋放在__________和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白溶液將攪拌好混合溶液離心后，試管中溶液分為4層。第1層為無色透明__________，第2層為白色薄層固體，是_______________，第3層是紅色透明液體，這是_____________，第4層是其它雜質(zhì)暗紅色沉淀物。將試管中液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層紅色透明液體。紅細(xì)胞生理鹽水上清液沒有黃色出現(xiàn)蒸餾水甲苯層脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白水溶液第17頁透析取1mL血紅蛋白溶液裝入__________中，將透析袋放入盛有300mL物質(zhì)量濃度為20mmol/L磷酸緩沖液中，透析12h。透析能夠去除樣品中__________雜質(zhì)，或用于更換樣品__________。6.凝膠色譜操作第一步要制作__________，第二步要_____________，因?yàn)開_____________________________________，所以裝柱前需要依據(jù)色譜柱內(nèi)體積計(jì)算所需要凝膠量。在裝填凝膠色譜柱時(shí)，不得有__________存在。因?yàn)闅馀輹_________，降低分離效果。第三步是__________。緩沖液透析袋分子量較小改變不一樣大小分子蛋白質(zhì)遷移次序凝膠色譜柱裝填凝膠色譜柱干凝膠和用緩沖液平衡好凝膠體積差異很大氣泡樣品加入和洗脫第18頁歸納整合一、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是依據(jù)相對分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)方法之一。所用凝膠實(shí)際上是一些微小多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物組成，在小球體內(nèi)部有許多貫通通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子樣品溶液遲緩流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不一樣移動，即垂直向下移動和無定向擴(kuò)散運(yùn)動，相對分子質(zhì)量較大蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，經(jīng)過旅程較短，移動速度較快；相對分子質(zhì)量較小蛋白質(zhì)分子比較輕易進(jìn)入凝膠內(nèi)通道，經(jīng)過旅程較長，移動速度較慢。第19頁所以，樣品中相對分子質(zhì)量較大分子先流出，相對分子質(zhì)量中等分子后流出，相對分子質(zhì)量最小分子最終流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。另外，凝膠本身含有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對分子質(zhì)量大分子經(jīng)過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上空襲時(shí)阻力大，而相對分子質(zhì)量小分子經(jīng)過時(shí)阻力小，所以不一樣分子量蛋白質(zhì)分子能夠取得分離。第20頁二、電泳作用及其原理電泳是指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移過程。許多主要生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都含有可解離基團(tuán)，它們在某個(gè)特定pH下會帶上正電或負(fù)電；在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反電極方向移動。電泳技術(shù)就是在電場作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)差異，使帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度，從而到達(dá)對樣品進(jìn)行分離、判定或提純目標(biāo)。第21頁跟蹤訓(xùn)練（

年廣東卷）（1）商品化植酸酶主要來自微生物。在產(chǎn)酶菌株篩選過程中，常在基本培養(yǎng)基中添加不溶于水植酸鈣制成固體平板，植酸鈣被植酸酶分解后可在平板上產(chǎn)生__________，可依據(jù)其大小選擇目標(biāo)菌株，所得菌株需要深入測定植酸酶活性。活性測定能夠植酸鈉作為底物，活性可用一定條件下單位時(shí)間__________表示。第22頁（2）利用上述所得菌株制備植酸酶流程以下列圖：Ⅰ中主要成份為__________；Ⅱ中包含各種酸酶等各種蛋白質(zhì)。請寫出一個(gè)純化得到植酸酶方法及其依據(jù)。________________________________________。純酶發(fā)酵液離心菌體去除含酶發(fā)酵液透析透析液(Ⅰ)去除粗提物(Ⅱ)純化第23頁(3)為建設(shè)基因工程菌，可用PCR等技術(shù)從上述菌株中克隆植酸酶基因。PCR反應(yīng)包含屢次循環(huán)，每次循環(huán)包含三步：__________。反應(yīng)過程中打開模板DNA雙鏈方法是__________。(4)除植酸酶外，微生物還應(yīng)用在__________生產(chǎn)中。第24頁

解析：本題考查對微生物分離和培養(yǎng)、蛋白質(zhì)純化、酶活性判定等知識，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用。

答案：（1）透明圈植酸鈉消耗量（肌醇和磷酸生成量）（2）小分子雜質(zhì)凝膠色譜法：依據(jù)蛋白質(zhì)之間分子大小、吸附性質(zhì)等差異進(jìn)行純化（或電泳法：依據(jù)蛋白質(zhì)之間電荷、分子大小等差異進(jìn)行純化）（3）變性、復(fù)性和延伸加熱（4）蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶第25頁熱點(diǎn)聚焦

第26頁DNA粗提取

(雙選)（年江蘇卷）以下關(guān)于DNA和蛋白質(zhì)提取與分離試驗(yàn)敘述，正確有（）A.提取細(xì)胞中DNA和蛋白質(zhì)都需用蒸餾水漲破細(xì)胞B.用不一樣濃度NaCl溶液重復(fù)溶解與析出DNA可去除蛋白質(zhì)C.蛋白質(zhì)提取和分離過程中進(jìn)行透析可去除溶液中DNAD.蛋白質(zhì)和DNA都能夠用電泳方法進(jìn)行分離純化第27頁

解析：A選項(xiàng)，在提取DNA時(shí)，假如是用動物細(xì)胞則需要用蒸餾水漲破，假如是用植物細(xì)胞則不能，而是用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。用2mol／LNaCl溶液溶解DNA，然后過濾出蛋白質(zhì)，再降低NaCl溶液濃度，析出DNA。DNA和蛋白質(zhì)樣品都是帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動，移動距離都和樣品分子量相關(guān)。C中透析用以除去小分子物質(zhì)，DNA是大分子物質(zhì)。D是常規(guī)方法，如用十二烷基磺酸鈉，能夠依據(jù)其分子大小及所帶電荷性質(zhì)進(jìn)行分離純化。

答案：BD第28頁

名師點(diǎn)睛：提取DNA第一步是材料選取，其目標(biāo)是一定要選取DNA含量較高生物材料，不然會因?yàn)樵囼?yàn)過程中或多或少損失而造成檢測困難；第二步是DNA釋放和溶解，這一步是試驗(yàn)成功是否關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)DNA全部溶解；第三步是DNA純化，即依據(jù)DNA溶解特征、對酶及高溫耐受性不一樣等特征，最大程度地將DNA與雜質(zhì)分開；最終一步是對DNA進(jìn)行判定，這是對整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果檢測。第29頁熱點(diǎn)訓(xùn)練在采取雞血為材料對DNA進(jìn)行粗提取試驗(yàn)中，若需深入提取雜質(zhì)較少DNA，能夠依據(jù)原理是（）A.在物質(zhì)量濃度為0.14mol／L氯化鈉溶液中DNA溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴條件下會染成藍(lán)色C.DNA不溶于酒精而細(xì)胞中一些物質(zhì)易溶于酒精D.質(zhì)量濃度為0.1g／mL檸檬酸鈉溶液含有抗凝血作用第30頁

解析：不溶于酒精溶液，不過細(xì)胞中一些蛋白質(zhì)則溶于酒精，利用這一原理，能夠?qū)NA與蛋白質(zhì)深入地分離。

答案：C第31頁走進(jìn)試驗(yàn)室

第32頁基礎(chǔ)再現(xiàn)

1.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一個(gè)體外快速擴(kuò)增DNA片段技術(shù)，它能以極少許DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份DNA拷貝。被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病診療、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等各方面。試驗(yàn)課題：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段第33頁2.PCR技術(shù)參加組成在DNA復(fù)制中作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制模板4種脫氧核苷酸合成子鏈原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物3′端開始連接脫氧核苷酸第34頁（1）細(xì)胞內(nèi)參加DNA復(fù)制各種組成成份及其作用①解旋酶：打開DNA雙鏈。②DNA母鏈：提供DNA復(fù)制模板。③4種脫氧核苷酸：合成子鏈原料。④DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈。⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物3′端開始連接脫氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈一段堿基序列互補(bǔ)配對。用于PCR引物長度通常為20~30個(gè)核苷酸）。第35頁（2）DNA合成方向DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫校ǔNA羥基末端稱為3′端，而磷酸基團(tuán)末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，所以，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈經(jīng)過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物3′端開始延伸DNA鏈，DNA合成方向總是從子鏈5′端向3′端延伸。(3）在80~100℃溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性；當(dāng)溫度遲緩降低后，兩條彼此分離DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈。PCR利用了DNA熱變性原理，經(jīng)過控制溫度來控制雙鏈解聚與結(jié)合。第36頁（3）在80~100℃溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性；當(dāng)溫度遲緩降低后，兩條彼此分離DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈。PCR利用了DNA熱變性原理，經(jīng)過控制溫度來控制雙鏈解聚與結(jié)合。（4）TaqDNA聚合酶應(yīng)用，處理了高溫造成DNA聚合酶失活問題，促成了PCR技術(shù)自動化；尋找目標(biāo)菌株時(shí)，要依據(jù)它對生存環(huán)境要求，到對應(yīng)環(huán)境中去尋找；試驗(yàn)室中微生物篩選，是人為提供有利于目標(biāo)菌株生長條件，同時(shí)抑制或阻止其它微生物生長。第37頁（5）PCR反應(yīng)條件：穩(wěn)定緩沖液環(huán)境、DNA模板、分別于兩條模板鏈結(jié)合兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱DNA聚合酶、能嚴(yán)格控制溫度改變溫控設(shè)備。（6）PCR普通要經(jīng)歷三十屢次循環(huán)，每次循環(huán)能夠分為變性（９５℃）、復(fù)性（５５℃）和延伸（７２℃）三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)產(chǎn)物也作為模板參加反應(yīng)。DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間DNA序列，使這段固定長度序列呈指數(shù)擴(kuò)增。第38頁過程設(shè)計(jì)1.按配方將所需試劑擺放在試驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）。2.用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）。3.蓋嚴(yán)離心管口蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）。4.將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）。5.將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀循環(huán)程序（反應(yīng)）。第39頁易錯(cuò)歸納1.PCR試驗(yàn)很輕易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。出現(xiàn)假陰性結(jié)果常見原因有：TaqDNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)建立欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠，等等。當(dāng)試驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性情況時(shí)，應(yīng)首先在原來擴(kuò)增產(chǎn)物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循環(huán)。為了預(yù)防假陰性結(jié)果出現(xiàn)，在選取TaqDNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高、質(zhì)量好酶。同時(shí)，在提取DNA模板時(shí)，應(yīng)尤其注意防止提取物中含有抑制酶活性污染物，如酚、氯仿等存在。盡TaqDNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有機(jī)試劑污染。PCR擴(kuò)增先決條件以及特異性高低，很大程度上取決于引物與靶DNA互補(bǔ)情況，尤其需要確保引物3′端與靶基因互補(bǔ)。第40頁2.PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量靶基因污染都會造成非目標(biāo)DNA片段大量擴(kuò)增，所以模板DNA污染是PCR假陽性結(jié)果主要原因。另外，樣品中存在靶基因同源序列也可能造成假陽性結(jié)果。為了防止因污染而造成假陽性結(jié)果，PCR操作時(shí)要注意做到：隔離操作區(qū)，分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性吸頭等。第41頁精題演練1.以下相關(guān)PCR描述，不正確是（）A.是一個(gè)酶促反應(yīng)B.引物決定了擴(kuò)增特異性C.擴(kuò)增產(chǎn)量按y＝（1＋X）nD.擴(kuò)增對象是氨基酸序列2.PCR反應(yīng)需要條件為緩沖溶液、DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐熱DNA聚合酶，為何？________________________________________。在PCR反應(yīng)中，與解旋酶作用相同操作是：_____________。第42頁

解析：PCR是一個(gè)體外快速擴(kuò)增DNA片段技術(shù)，它以極少許DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原料，在引物作用下使DNA聚合酶從引物3′端連接脫氧核苷酸，短時(shí)間內(nèi)快速復(fù)制上百萬份DNA拷貝，其擴(kuò)增產(chǎn)量為y＝（1＋X）n，y代表DNA片段擴(kuò)增后拷貝數(shù)，X表示平均每次擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)，擴(kuò)增對象是DNA序列。

答案：D2.PCR反應(yīng)本質(zhì)是DNA復(fù)制，其需要條件類似于生物體內(nèi)DNA復(fù)制95℃變性

第43頁課時(shí)作業(yè)

第44頁1.在哪個(gè)溫度范圍內(nèi)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開（）A.10~20℃B.80~100℃C.20~30℃D.40~60℃

解析：蛋白質(zhì)大多不能忍受60~80℃高溫，而DNA在80℃以上才會變性。

答案：B第45頁2.在制備雞血細(xì)胞液過程中，加入檸檬酸鈉目標(biāo)是（）A.預(yù)防凝血B.加緊DNA析出C.加緊DNA溶解D.加速凝血

解析：檸檬酸鈉作用是利用檸檬酸根離子與血漿中Ca2+離子結(jié)合成檸檬酸鈉，降低Ca2+離子濃度，使相關(guān)凝血酶活性降低。所以檸檬酸鈉是抗凝血物質(zhì)，預(yù)防凝血，有利于雞血細(xì)胞液制備。

答案：AD第46頁3.DNA粗提取試驗(yàn)材料中有三次過濾：（1）過濾用蒸餾水稀釋過雞血細(xì)胞液；(2)