氣體成分分析高效液相色譜法

關(guān)于氣體成分分析高效液相色譜法第1頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五概述（一）高效液相色譜的發(fā)展

液相色譜法（liquidchromatography，LC）是最早（1903年）發(fā)明的，此之前紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。

20世紀(jì)60年代后期，液相色譜得到了迅速的發(fā)展。特別是填料制備技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進(jìn)，使液相色譜分析實(shí)現(xiàn)了高效化和高速化。液相色譜法于1969年商品化。這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱為高效液相色譜法（HPLC），也稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法。

第2頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，例如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)?，F(xiàn)在，HPLC的應(yīng)用范圍已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)氣相色譜，位居色譜法之首。第3頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五高效色譜的類型HPLC分配色普法離子色譜法吸附色譜法凝膠色譜法第4頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五HPLC按分離機(jī)理的分類第5頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五液相色譜儀器高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)

最基本組件線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)和全自動(dòng)控制系統(tǒng)等配置組件第6頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

輸液泵將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過(guò)進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入,流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱,在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)或吸附力大小的不同而被分離，并依次隨流動(dòng)相流至檢測(cè)器，檢測(cè)到的信號(hào)送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)記錄、處理或保存。圖8-1

液相色譜儀的工作過(guò)程第7頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五輸液泵

◆流量準(zhǔn)確可調(diào)。對(duì)于一般的分析工作而言，流動(dòng)相的流速在0.5-2mL/min，輸液泵的最大流量一般為5-10mL/min。輸液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。

◆耐高壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到30-60MPa的高壓。

◆液流穩(wěn)定。輸液泵輸出的液流應(yīng)無(wú)脈動(dòng)，或配套脈沖抑制器。

1.對(duì)輸液泵的基本要求第8頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五◆泵的死體積小。為了快速更換溶劑和適于梯度洗脫，泵的死體積通常要求小于0.5mL。泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。第9頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

▲輸出液恒定的因素恒壓泵恒流泵

▲工作方式氣動(dòng)泵機(jī)械泵螺旋傳動(dòng)注射泵單活塞往復(fù)泵雙活塞往復(fù)泵往復(fù)式隔膜泵2.輸液泵第10頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五第11頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

●單活塞往復(fù)泵：在活塞柱的一端有一偏心輪，偏心輪連在電動(dòng)機(jī)上，電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)偏心輪轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，活塞柱則隨之左右移動(dòng)。在活塞的另一端有上下兩個(gè)單向閥，各有1-2個(gè)藍(lán)寶石或陶瓷球，由其起閥門的作用?！旅娴膯蜗蜷y與流動(dòng)相連通，為活塞的溶液入口；▲上面的單向閥與色譜柱相連，為活塞的溶液出口?！钊蛲庖苿?dòng)時(shí)，出口單向閥關(guān)閉，入口單向閥打開(kāi)，溶液（流動(dòng)相）抽入活塞缸?！钊蚶镆苿?dòng)時(shí)，入口單向閥關(guān)閉，出口單向閥打開(kāi)，流動(dòng)相被壓出活塞缸，流向色譜柱。圖8-2(1)活塞型往復(fù)泵第12頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

有一個(gè)精心設(shè)計(jì)的偏心凸輪，用同步電機(jī)或變速直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)偏心凸輪，偏心凸輪再推動(dòng)兩活塞作往復(fù)運(yùn)動(dòng)。偏心凸輪短半徑端對(duì)應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的下單向閥打開(kāi)吸入流動(dòng)相，同時(shí)，半徑端所對(duì)應(yīng)的另一活塞被推入，使其上單向閥打開(kāi)，并將流動(dòng)相送至色譜柱。兩活塞交替伸縮，往復(fù)運(yùn)動(dòng)，這樣避免單活塞泵液流脈沖的問(wèn)題。

不必使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗，但缺點(diǎn)是設(shè)備成本較高，流量調(diào)節(jié)也比單活塞泵復(fù)雜。圖8-3優(yōu)點(diǎn)：構(gòu)造：雙活塞往復(fù)泵第13頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五隔膜型往復(fù)泵也是一種恒流泵，一塊隔膜將泵缸分為兩部分，一部分充滿了油，另一部分充滿了流動(dòng)相?；钊c油接觸，當(dāng)活塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)時(shí)，隔膜受到油壓的作用，對(duì)流動(dòng)相部分產(chǎn)生“吸引”或“推壓”，使流動(dòng)相部分的單向閥吸液或排液，從而獲得穩(wěn)定的液流。通過(guò)調(diào)節(jié)泵活塞的沖程即可進(jìn)行流量調(diào)節(jié)。

隔膜泵的活塞不直接與流動(dòng)相接觸，故不存在活塞密封墊磨損對(duì)流動(dòng)相的污染。隔膜泵的死體積?。s0.1mL），因此，更換流動(dòng)相后平衡快，有利于梯度洗脫。隔膜泵的缺點(diǎn)是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，價(jià)格較貴，和單活塞機(jī)械往復(fù)泵一樣，也產(chǎn)生脈沖，也需要配置阻尼裝置來(lái)消除脈沖。圖8-4(2)隔膜型往復(fù)泵第14頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

泡沫為什么要脫氣

噪音峰基線起伏排氣費(fèi)時(shí)熒光淬滅

pH變化。第15頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五脫氣方法超聲波振蕩惰性氣體鼓泡吹掃真空脫氣圖8-5第16頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五梯度洗脫裝置

在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。

1.為什么要進(jìn)行梯度洗脫？第17頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

在液相色譜中流速（壓力）梯度和溫度梯度效果不大，而且還會(huì)帶來(lái)一些不利影響，因此，液相色譜中通常所說(shuō)的梯度洗脫是指流動(dòng)相梯度，即在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相的組成或濃度。

2.梯度洗脫操作第18頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五★線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度

★線性梯度：

在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。

梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。第19頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。只要通過(guò)梯度程序控制器控制每臺(tái)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。使用了兩臺(tái)高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對(duì)較高，而且只能實(shí)現(xiàn)二元梯度操作。圖8-6主要優(yōu)點(diǎn)：主要缺點(diǎn)：第20頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。比例閥在泵在常壓（低壓）下混合，混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置。來(lái)自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后的四種溶液進(jìn)入比例閥，混合后從一根輸出管進(jìn)入泵體。多元梯度泵的流路可以部分空置。圖8-7主要裝置第21頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

進(jìn)樣器

進(jìn)樣器是將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置，分手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式。

密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣時(shí)引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小?，F(xiàn)在采用的手動(dòng)進(jìn)樣器幾乎都是耐高壓、重復(fù)性好和操作方便的六通閥進(jìn)樣器，其原理與氣相色譜中的相同。

特點(diǎn)第22頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五色譜柱構(gòu)成色譜填料色譜柱管色譜柱1.色譜柱的構(gòu)成圖8-8第23頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

在硬臺(tái)面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開(kāi)垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺(tái)面墩10-20次。

又稱淤漿填充法，使用專門的填充裝置。圖8-9

2.色譜柱的填充干法填充濕法填充第24頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

常稱作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對(duì)分離不起明顯的作用，只是作為功能基團(tuán)的載體。常用來(lái)作基質(zhì)的有硅膠和有機(jī)高分子聚合物微球。3.填料的結(jié)構(gòu)基質(zhì)第25頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

是通過(guò)化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對(duì)樣品分子的保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)。如圖8-10是硅膠基質(zhì)的冠醚大分子固定相的結(jié)構(gòu)示意圖，功能層冠醚分子吸附或鍵合在硅膠基質(zhì)的表面。功能層第26頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

微孔型（或凝膠型）大孔型（全多孔型）薄殼型表面多孔型圖8-113.填料的物理結(jié)構(gòu)第27頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與自動(dòng)控制單元

又稱色譜工作站。它可對(duì)分析全過(guò)程（分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài)）進(jìn)行在線顯示，自動(dòng)采集、處理和儲(chǔ)存分析數(shù)據(jù)。一些配置了積分儀或記錄儀的老型號(hào)液相色譜儀在很多實(shí)驗(yàn)室還在使用，但近年新購(gòu)置的色譜儀，一般都帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，使用非常方便。

數(shù)據(jù)控制系統(tǒng)第28頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

將各部件與控制單元連接起來(lái)，在計(jì)算機(jī)上通過(guò)色譜軟件將指令傳給控制單元，對(duì)整個(gè)分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，從而使整個(gè)分析過(guò)程全自動(dòng)化。也有的色譜儀沒(méi)有設(shè)計(jì)專門的控制單元，而是每個(gè)單元分別通過(guò)控制部件與計(jì)算機(jī)相連，通過(guò)計(jì)算機(jī)分別控制儀器的各部分。

自動(dòng)控制單元第29頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五液相色譜分離模式吸附色譜原理固定相流動(dòng)相基于被測(cè)組分在固定相表面具有吸附作用，且各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留和實(shí)現(xiàn)分離。固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑。弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物第30頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

硅羥基呈微酸性，易與氫結(jié)合，是吸附的活性點(diǎn).。流動(dòng)相溶劑在吸附劑表面形成單分子或雙分子吸附層，當(dāng)樣品分子進(jìn)入色譜柱，樣品主要靠氫鍵結(jié)合力吸附到硅羥基上，與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附點(diǎn)。樣品分子反復(fù)地被吸附，又反復(fù)地被流動(dòng)相分子頂替解吸，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)而在柱中向前移動(dòng)。因?yàn)椴煌臉悠贩肿釉诠潭ㄏ啾砻娴奈侥芰Σ煌?，因而吸?解吸的速度不同，被洗脫的時(shí)間也就不同，使得各組分相互分離。

應(yīng)用分離過(guò)程吸附色譜在早期的HPLC中應(yīng)用得最多，現(xiàn)在，很多以前用吸附色譜分離的物質(zhì)被更方便和更有效的化學(xué)鍵合相反相分配色譜所代替。由于硅羥基活性點(diǎn)在硅膠表面常按一定幾何規(guī)律排列，因此吸附色譜用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法。如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。

第31頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五（一）分配色譜

原理

基于樣品分子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同鍵合固定相以化學(xué)鍵合將功能分子結(jié)合到惰性載體上。極性鍵合固定相鍵合在載體表面的功能分子極性基團(tuán)的有機(jī)分子第32頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五非極性鍵合固定相鍵合在載體表面的功能分子是非極性有機(jī)分子。正相HPLC由極性固定相和非極性流動(dòng)相所組成的HPLC體系。反相HPLC

非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系第33頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五（二）凝膠色譜（gelchromatography）

以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受固定相孔徑大小的影響而達(dá)到分離的分離模式。樣品分子與固定相之間不存在相互作用力（吸附、分配和離子交換等）。比固定相孔徑大的溶質(zhì)分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，迅速流出色譜柱，不能被分離。比固定相孔徑小的分子進(jìn)入孔內(nèi)而產(chǎn)生保留，溶質(zhì)分子體積越小，進(jìn)入固定相孔內(nèi)的機(jī)率越大，停留（保留）的時(shí)間也就越長(zhǎng)圖8-12原理第34頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五◆固定相：化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無(wú)機(jī)多孔材料。◆流動(dòng)相：

在凝膠色譜中，流動(dòng)相的作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動(dòng)相粘度?！裟z過(guò)濾色譜（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。◆凝膠滲透色譜（gelpermeationchromatography,GPC）：

以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。第35頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五（三）離子色譜（ionchromatography,IC）

IEC使用的是低交換容量的離子交換劑，這種交換劑的表面有離子交換基團(tuán)。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽(yáng)離子的分離，帶正電荷的交換基團(tuán)可以用于陰離子的分離。圖8-131離子交換色譜法第36頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

ICE的分離機(jī)理是以樹(shù)脂的Donnan排斥為基礎(chǔ)的分配過(guò)程。分離陰離子用強(qiáng)酸性高交換容量的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，分離陽(yáng)離子用強(qiáng)堿性高交換容量的陰離子交換樹(shù)脂。圖8-142離子排斥色譜法第37頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

離子對(duì)色譜(IPC)也稱離子相互作用色譜，是在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)木哂信c被測(cè)離子相反電荷的離子，即"離子對(duì)試劑"，使之與被測(cè)離子形成中性的離子對(duì)化合物，此離子對(duì)化合物在反相色譜柱上被保留。保留的大小主要取決于離子對(duì)化合物的解離平衡常數(shù)和離子對(duì)試劑的濃度。離子對(duì)色譜也可采用正相色譜的模式，即可以用硅膠柱，但不如反相色譜效果好，多數(shù)情況下采用反相色譜模式，所以也常稱反相離子對(duì)色譜。3離子對(duì)色譜法第38頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五紫外-可見(jiàn)光二極管陣列熒光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器示差折光蒸發(fā)光散射檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)技術(shù)第39頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五第40頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。

很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力，因此UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于其對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。

紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器第41頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五用UV-VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長(zhǎng)，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸收的流動(dòng)相第42頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

以光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。二極管陣列UV-VIS檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使所有波長(zhǎng)的光在接受器上被檢測(cè)。圖8-15二極管陣列檢測(cè)器第43頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

◆原理：基于樣品組分的折射率與流動(dòng)相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來(lái)時(shí)，會(huì)引起流動(dòng)相折射率的變化，這種變化與樣品組分的濃度成正比。

示差折光檢測(cè)法也稱折射指數(shù)檢測(cè)法。對(duì)于那些無(wú)紫外吸收的有機(jī)物（如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴）是比較適合的。在凝膠色譜中是必備檢測(cè)器。

RI檢測(cè)器根據(jù)其設(shè)計(jì)原理可分為反射型（根據(jù)Fresnel定律）、折射型（根據(jù)Snell定律）和干涉型三種類型。

示差折光檢測(cè)器第44頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

◆原理：許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機(jī)胺、維生素、激素、酶等，被一定強(qiáng)度和波長(zhǎng)的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的熒光。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機(jī)化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測(cè)。熒光檢測(cè)器◆特點(diǎn)：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。而且所需樣品量很小，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。第45頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

◆原理：基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。電導(dǎo)檢測(cè)器是離子色譜中必備的檢測(cè)器。

◆電導(dǎo)檢測(cè)器的構(gòu)成：由電導(dǎo)池、測(cè)量電導(dǎo)率所需的電子線路、變換靈敏度的裝置和數(shù)字顯示儀等幾部分組成，電導(dǎo)池是其核心。

◆電導(dǎo)池的結(jié)構(gòu)：檢測(cè)體積可達(dá)到微升甚至納升級(jí)。其基本結(jié)構(gòu)是在柱流出液中放置兩根電極，然后通過(guò)適當(dāng)?shù)碾娮泳€路測(cè)量溶液的電導(dǎo)。電導(dǎo)檢測(cè)器第46頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五◆電導(dǎo)檢測(cè)器工作原理：電導(dǎo)池工作時(shí)，電極間及電極附近溶液中所發(fā)生的電化學(xué)過(guò)程可以用圖8-18表示。當(dāng)向電導(dǎo)池的兩個(gè)電極施加電壓時(shí)，溶液中的陰離子向陽(yáng)極移動(dòng)，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)。在電解質(zhì)溶液中的離子數(shù)目和離子的移動(dòng)速率決定溶液的電阻大小，離子的遷移率或單位電場(chǎng)中離子的速率取決于離子的電荷及其大小、介質(zhì)類型、溶液溫度和離子濃度。離子的遷移速率取決于施加電壓的大小。所施加的電壓既可以是直流電壓，也可以是正弦波或方波電壓。當(dāng)施加的有效電位確定后，即可測(cè)量出電路中的電流值，即能測(cè)出電導(dǎo)值。圖8-18第47頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

◆構(gòu)成：ELSD是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測(cè)器。由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測(cè)器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。◆流程：色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過(guò)加熱漂移管時(shí)，流動(dòng)相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器第48頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五◆適用范圍：適合無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測(cè)器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。圖8-19

第49頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五其它色譜方法

超臨界流體：指高于臨界壓力和臨界溫度時(shí)的一種物質(zhì)狀態(tài)，它既不是氣體，也不是液體，但它兼具氣體的低粘度和液體的高密度以及介于氣體和液體之間的較高擴(kuò)散系數(shù)等特征。

SFC：以超臨界流體作流動(dòng)相，以固體吸附劑（如硅膠）或鍵合在載體（或毛細(xì)管壁）上的有機(jī)高分子聚合物作固定相的色譜方法。

1.超臨界流體色譜第50頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五▲常用流動(dòng)相：

超臨界狀態(tài)下的、氧化亞氮、乙烷、三氟甲烷等。最常用，因?yàn)樗呐R界溫度低（31℃）、臨界壓力適中（7.29MPa）、無(wú)毒、便宜，但其缺點(diǎn)是極性太低，對(duì)一些極性化合物的溶解能力較差，所以，通常要用另一臺(tái)輸液泵往流動(dòng)相中添加1-5％的甲醇等極性有機(jī)改性劑。

第51頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五▲色譜柱：液相色譜的填充柱和氣相色譜的毛細(xì)管柱都可以使用，但由于超臨界流體的強(qiáng)溶解能力，所使用的毛細(xì)管填充柱的固定相必須交聯(lián)▲應(yīng)用：從理論上講，SFC既可以象液相色譜一樣分析高沸點(diǎn)和難揮發(fā)樣品，也可象氣相色譜一樣分析揮發(fā)性成分。不過(guò)，超臨界流體色譜更重要的應(yīng)用是用來(lái)作分離和制備，即超臨界流體萃取。第52頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis,CE）：以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以電解質(zhì)為電泳介質(zhì)，以毛細(xì)管為分離通道，樣品組分依據(jù)淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種色譜方法。它有多種分離模式，可以采用液相色譜中的各種檢測(cè)方法。CE既可以分離帶電荷的溶質(zhì)，也可以通過(guò)毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜等分離模式分析中性溶質(zhì)，CE的高分離效率、高檢測(cè)靈敏度，樣品用量極少等特點(diǎn)使它在生物醫(yī)藥樣品的分析中顯示出突出的優(yōu)越性。

2.毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜第53頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

毛細(xì)管電色譜（capillaryelectrochromatography,CEC）：以電滲流（或電滲流結(jié)合高壓輸液泵）為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的微柱色譜法。CEC是液相色譜與毛細(xì)管電泳相結(jié)合的產(chǎn)物，它的分離機(jī)理包含有電泳遷移和色譜固定相的保留機(jī)理，一般而言，溶質(zhì)與固定相間的相互作用對(duì)分離起主導(dǎo)作用。所用色譜柱為填充了HPLC填料的填充型毛細(xì)管柱和管內(nèi)壁涂漬了固定相功能分子的開(kāi)管毛細(xì)管柱。CEC還處在發(fā)展階段，目前主要應(yīng)用在藥物、手性化合物和多環(huán)芳烴的分離分析。另外CEC與質(zhì)譜聯(lián)用既可解決LC/MS的分離效率不高的問(wèn)題，又可克服CE/MS中質(zhì)量流量太小的缺陷。

第54頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五3親和色譜定義：利用蛋白質(zhì)或生物大分子等樣品與固定相上生物活性配位體之間的特異親和力進(jìn)行分離的液相色譜方法。固定相：將具有生物活性的配位體以共價(jià)鍵結(jié)合到不溶性固體基質(zhì)上制得。生物活性配位體：常用的有酶（如底物及其類似物）、輔酶（如類固醇）、抗體（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。

第55頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

基質(zhì)：通常為凝膠，許多無(wú)機(jī)和有機(jī)聚合物都可形成凝膠，如瓊脂糖衍生物、多孔玻璃。

分離過(guò)程：在分離過(guò)程中涉及疏水相互作用、靜電力、范德華力和立體相互作用。在鍵合了某類配體的親和色譜柱上加入含生物活性大分子的樣品，只有柱中配位體有明顯親和性的生物大分子才會(huì)被吸附，這些生物分子只有在改變流動(dòng)相的組成時(shí)才會(huì)被洗脫。

應(yīng)用：親和色譜主要用于蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)的分離與制備。第56頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

以激光的輻射壓力為驅(qū)動(dòng)力，將待分離組分（或物質(zhì)顆粒）按幾何尺寸大小予以分離的一種色譜分離技術(shù)。

激光色譜是1995年剛剛提出的新的色譜方法，盡管尚無(wú)商品儀器，但可預(yù)言其在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要作用，如分離高分子聚合物微球、生物細(xì)胞、生物大分子、肽、DNA、線粒體。從理論上講，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)蛋白質(zhì)分子的檢測(cè)。3激光色譜原理應(yīng)用第57頁(yè)，共79頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)30分，星期五

欲分離的粒子隨流動(dòng)相（粒子溶液本身）以一定的流速流經(jīng)毛細(xì)管，將一定功率的激光束聚焦于毛細(xì)管的出口，激