酶工程化學(xué)修飾

酶工程化學(xué)修飾酶分子化學(xué)修飾——在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)物質(zhì)，特別是一些有生物相容性的物質(zhì)進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這些化學(xué)物質(zhì)稱為修飾試劑，酶化學(xué)修飾主要用于基礎(chǔ)酶學(xué)的研究和疾病治療。酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域在基礎(chǔ)酶學(xué)研究上探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動(dòng)酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶分子的拓?fù)鋵W(xué)以及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài)酶的固定化技術(shù)酶純度的分析與檢測(cè)在疾病治療上—克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性—消除或降低酶的抗原性—有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶部位在工業(yè)上的應(yīng)用—酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低—反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長(zhǎng)導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。——大多數(shù)的化學(xué)修飾的目的在于人為地改變天然酶的某些性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性甚創(chuàng)造出新的活性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍?！附?jīng)過修飾后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的變化，概括起來有：

—１提高生物活性（包括某些在修

飾后對(duì)效應(yīng)物的反應(yīng)性能改變）

—２增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性；

—３針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能

力，解除免疫原性；

—４產(chǎn)生新的催化能力。

主要內(nèi)容第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾方法第二節(jié)酶化學(xué)修飾的基本要求第三節(jié)修飾酶的化學(xué)性質(zhì)

酶的化學(xué)修飾的基本原理——大量研究表明，酶分子表面外形的不規(guī)則、各原子間極性和電荷的不同、各氨基酸殘基間相互作用等使酶分子結(jié)構(gòu)的局部形成了一種包含了酶活性部位的微環(huán)境，不管這種微環(huán)境是極性的還是非極性的，都直接影響到酶活性部位氨基酸殘基的電離狀態(tài)，并為活性部位發(fā)揮催化作用提供合適的條件?！烊幻阜肿又械倪@種微環(huán)境是可以通過人為的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑?，通過對(duì)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)、酶分子的功能基團(tuán)等進(jìn)行化學(xué)修飾或改造，就可以獲得結(jié)構(gòu)或性能更合理的修飾酶?！附?jīng)過化學(xué)修飾后，除了能減少由于內(nèi)部平衡力被破壞而引起的酶分子伸展打開外，還可能會(huì)在酶分子的表面形成一層“緩沖外殼”，能在一定程度上抵御外界環(huán)境的電荷、極性等變化對(duì)酶分子的影響，進(jìn)而維持酶活性部位微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，使酶分子能在更廣泛的條件下發(fā)揮作用?！富瘜W(xué)修飾的基本原則都是充分利用化學(xué)修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，或直接或間接地經(jīng)過一定的活化過程與酶分子中的某種氨基酸殘基（通常選擇非酶活必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而對(duì)酶分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造?！诿傅幕瘜W(xué)修飾過程中需要涉及被修飾酶、修飾劑的性質(zhì)以及修飾反應(yīng)條件的選擇。一般在開始設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾反應(yīng)時(shí)須對(duì)被修飾酶的活性部位、穩(wěn)定條件、側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)等應(yīng)盡可能全面掌握。

在此基礎(chǔ)上選擇合適的化學(xué)修飾劑進(jìn)行化學(xué)修飾，在選擇化學(xué)修飾劑時(shí)，除了需要考慮修飾劑的種類、修飾劑上的反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目和位置以及修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法和條件以外，還需要考慮修飾劑的分子量等其它可能會(huì)影響修飾反應(yīng)的因素。值得注意的是酶的修飾反應(yīng)一般總是盡可能在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，需要盡可能少破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，以提高酶和修飾劑的結(jié)合率和酶活回收率。酶的化學(xué)修飾反應(yīng)條件主要包括

——體系中酶與修飾劑的分子比例、

——反應(yīng)體系（包括溶劑性質(zhì)、鹽濃

度以及pH等）

——反應(yīng)溫度和時(shí)間等

一般來說，修飾反應(yīng)條件隨酶的性質(zhì)、修飾劑的種類、修飾反應(yīng)的類型等的不同而不同，一個(gè)合適的修飾反應(yīng)需要由大量的實(shí)驗(yàn)來予以確定。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法

——酶的表面修飾

——酶分子的內(nèi)部修飾

——與輔因子相關(guān)的修飾

——金屬酶的金屬取代酶的表面修飾

——化學(xué)固定化

——酶的小分子修飾作用

——酶的大分子修飾作用

——大分子非共價(jià)修飾

——大分子共價(jià)修飾

——分子內(nèi)交聯(lián)

——分子間交聯(lián)

——脂質(zhì)體包埋

——反相膠團(tuán)微囊化：酶的表面修飾（一）化學(xué)固定化

——一般是直接通過酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。（二）酶的小分子修飾作用

——主要是利用一些小分子修飾試劑，通過共價(jià)結(jié)合來修飾酶的一些基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有乙基、糖基和甲基等。酶的表面修飾（三）酶的大分子修飾作用

——非共價(jià)修飾

——共價(jià)修飾大分子非共價(jià)修飾

——利用一些大分子試劑通過與酶非共價(jià)相互作用，對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)

——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通過氫鍵固定于酶分子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶活力；另外一些蛋白質(zhì)可以通過相互作用，排除分子表面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。大分子共價(jià)修飾：

——利用一些可溶性大分子，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。例如用聚乙二醇共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（SOD），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。（四）分子內(nèi)交聯(lián)

——增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。（五）分子間交聯(lián)—利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。（六）脂質(zhì)體包埋

——一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問題。脂質(zhì)體是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過與細(xì)胞膜的融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。（七）反相膠團(tuán)微囊化—近年來發(fā)展起來的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高。—一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性。

加H2O

疏水尾部

親水頭部

加酶液

SPEEE

圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布——酶分子的內(nèi)部修飾

—非催化活性基團(tuán)的修飾

—酶蛋白主鏈的修飾

—催化活性基團(tuán)的修飾

—肽鏈伸展后的修飾（一）非催化活性基團(tuán)的修飾

——通過對(duì)非催化殘基的修飾可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力；通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核的，也可以是親電子的，還可以是可氧化殘基。（二）酶蛋白主鏈的修飾

——主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主聯(lián)進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。（三）催化活性基團(tuán)的修飾

——通過選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為化學(xué)突變法。（四）肽鏈伸展后的修飾

——酶蛋白經(jīng)過脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊。三、與輔因子相關(guān)的修飾

對(duì)依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：

——如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的

,可以將輔因子共價(jià)結(jié)合于酶分

子上；

——引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子四、金屬酶的金屬取代

——酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性等。第二節(jié)酶化學(xué)修飾的基本要求一、被修飾酶的性質(zhì)（一）酶的穩(wěn)定性：（二）酶活性中心的狀況：（三）酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)與反應(yīng)性二、修飾反應(yīng)的條件：（一）pH與離子強(qiáng)度（二）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間（三）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例一、被修飾酶的性質(zhì)（一）酶的穩(wěn)定性—包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及pH，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。（二）酶活性中心的狀況—包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。（三）酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)與反應(yīng)性1、對(duì)巰基的化學(xué)修飾：—常用的修飾試劑有烷化劑、汞試劑和Ellman試劑等。2、氨基的化學(xué)修飾：—常用的修飾試劑有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化試劑、丹磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯（PITC)等。3、羧基的化學(xué)修飾：—水溶性羰二亞胺或氨化反應(yīng)、硼氟化三甲鋅鹽反應(yīng)、甲醇-鹽酸酯化反應(yīng)等。4、咪唑基的修飾反應(yīng)：—焦碳酸二乙酯反應(yīng)、碘代反應(yīng)、碘化反應(yīng)等。5、吲哚基的化學(xué)修飾：—2-羥基-5-硝基芐溴、光敏試劑、4-硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾：—H2O2、光敏試劑、碘代乙酰胺等7、二硫鍵的化學(xué)修飾：—2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過甲酸等。8、酚基的化學(xué)修飾：—N-乙酰咪唑、碘化反應(yīng)、四硝基甲烷、偶氮化試劑、二異丙基氟磷酸。9、胍基的化學(xué)修飾：—丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛等。二、修飾反應(yīng)的條件

——修飾反應(yīng)應(yīng)盡量在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性必需基團(tuán)，修飾率高，活力回收要高（一）pH與離子強(qiáng)度：

——pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同，其反應(yīng)性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在不同pH下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成不同的產(chǎn)物。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。（二）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間

——嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可以減少或消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（三）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

——酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。第三節(jié)修飾酶的性質(zhì)

迄今，已有100多種蛋白質(zhì)（其中許多是酶）被修飾后在很多領(lǐng)域中顯出許多優(yōu)良特性。修飾酶的性質(zhì)改變主要表現(xiàn)為

——穩(wěn)定性提高

——體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)

——免疫原性和毒性降低或消除

——膜滲透性提高

——在體內(nèi)的生物分布與代謝行

為和藥用酶的療效得以改善

——在有機(jī)溶劑中的溶解度

——耐有機(jī)溶劑變性的能力提高等

例：

大腸桿菌L-天冬酰胺酶作為治療淋巴性白血病、惡性淋巴腫瘤的酶制劑已在國(guó)外應(yīng)用于臨床，并且是治療急性淋巴性白血病治療指數(shù)最高的藥物。缺點(diǎn)：

由于它來源于微生物，對(duì)人而言是一種外源性蛋白，有較強(qiáng)的免疫原性，臨床上常見進(jìn)行性免疫反應(yīng)和全身性過敏反應(yīng)，而限制了其臨床應(yīng)用。改進(jìn)方法

——利用聚乙二醇修飾后的天冬酰胺酶不僅可降低或消除酶的抗原性，而且可以提高酶的抗蛋白水解的能力，延長(zhǎng)酶在體內(nèi)半衰期，提高藥效。結(jié)果

美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)的用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病的培門冬酶（Pegaspargase,商品名為Oncaspar）即為L(zhǎng)-天冬酰胺酶的聚乙二醇螯合物，該產(chǎn)品已于1994年首先在美國(guó)上市。①熱穩(wěn)定性——一般來說，經(jīng)過化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高?！饕怯捎谛揎椩噭┑亩鄠€(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較

酶

修飾劑

修飾酶

天然酶

處理?xiàng)l件(℃/時(shí)間)

殘留酶活(%)腺苷脫氫酶

胰蛋白酶

過氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素37/100min100/30min50/10min100/30min37/48h37/24h701004664409020998009550②體內(nèi)半衰期

——經(jīng)過化學(xué)修飾后很多酶的抗蛋白水解酶、抗抑制劑和抗失活因子的能力以及對(duì)熱穩(wěn)定性都有增加和提高，也就相應(yīng)提高了酶在生物體內(nèi)的半衰期，這一點(diǎn)對(duì)提高藥用酶的療效至關(guān)重要。天然酶與修飾酶在生物體內(nèi)半衰期的比較酶修飾劑半衰期或酶活殘留率(%)/時(shí)間天然酶修飾酶羧肽酶C精氨酸酶-淀粉酶谷氨酰胺酶-天門冬酰胺酶L-天門冬酰胺酶尿酸酶-葡萄糖苷酶超氧化岐化酶尿激酶氨基己糖苷酶A精氨酸酶酰苷脫氨酶L-天門冬酰胺酶過氧化氫酶右旋糖酐右旋糖酐右旋糖酐糖肽聚丙氨酸白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白PVPPEGPEGPEGPEGPEG3.5h1.4h16%/2h1h3h4h10min6min20min5min1h30min2h0%/6h18%/3h17h12h75%/2h8.2h21h20h3h4h90min35min12h28h24h10%/8h65%/3h③修飾酶的抗原性

——由于酶分子結(jié)構(gòu)上除了有蛋白水解酶的作用位點(diǎn)（蛋白水解酶“切點(diǎn)”）外，還有一些可以組成抗原決定簇的氨基酸殘基，當(dāng)酶作為異源蛋白進(jìn)入機(jī)體后就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體與抗原之間的反應(yīng)，這一反應(yīng)不但能使酶失活，而且還會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的傷害，甚至?xí)＜鄙?。解決的方法

——有抗原性的天然酶可以通過化學(xué)修飾使酶分子中的一些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑之間通過共價(jià)鍵相互結(jié)合，從而破壞了酶分子中抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使天然酶的抗原性降低，甚至完全消除。原理

——大分子的修飾劑還有可能起到“遮蓋”天然酶上的抗原決定簇以阻礙抗原與抗體之間的結(jié)合反應(yīng)。通過化學(xué)修飾后修飾酶的抗原性變化酶修飾劑修飾酶的抗原性變化胰蛋白酶過氧化氫酶精氨酸酶酰苷脫氨酶尿酸酶谷氨酰胺酶-天門冬酰胺酶超氧化岐化酶L-天門冬酰胺酶超氧化岐化酶L-天門冬酰胺酶-葡萄糖苷酶尿酸酶尿酸氧化酶核糖核酸酶鏈激酶胰蛋白酶L-天門冬酰胺酶PEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白PEG聚DL-丙氨酸PEG聚DL-丙氨酸聚DL-丙氨酸消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除消除降低消除降低降低

值得指出的是，并不是所有的修飾劑都能在對(duì)酶進(jìn)行修飾后就消除或降低天然酶的抗原性，有些修飾劑在降低和消除天然酶的抗原性上并沒有作用。

例如，包括右旋糖酐在內(nèi)的多糖類物質(zhì)就不容易消除或降低天然酶的抗原性。

目前比較公認(rèn)的在消除或降低天然酶抗原性的修飾劑主要有PEG和人血清白蛋白。④最適pH

——部分酶經(jīng)過化學(xué)修飾后，其催化的最適pH會(huì)發(fā)生變化，修飾酶的最適pH與天然酶的最適pH相比往往不同，且有些酶的最適pH會(huì)有一定的范圍，更適合于酶的應(yīng)用，尤其是在生理或臨床應(yīng)用上有較大的意義。

天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸酶吲哚-3-鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0例1：

——來源于豬肝的天然尿酸酶的最適pH值為10.5，在pH為7.4的生理環(huán)境中酶活損失達(dá)90%~95%，不適合直接應(yīng)用；

——如果用白蛋白進(jìn)行修飾后，修飾酶的最適pH范圍擴(kuò)大，在pH為7.4時(shí)仍有60%的酶活得以保留；

——與天然尿酸酶比較，修飾酶就更有利于在生理?xiàng)l件的機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用。例2：

——天然的吲哚-3-鏈烷羥化酶經(jīng)過修飾后，修飾酶的最適pH從3