細(xì)胞培養(yǎng)緒論課件

細(xì)胞培養(yǎng)第一頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論第一章緒論

第二頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

細(xì)胞是一切生命現(xiàn)象的基石和載體，事實(shí)上人體諸多的奧秘，包括生理的和病理的都是從細(xì)胞的活動(dòng)中揭示出來(lái)。細(xì)胞的信息傳遞、代謝、增殖、遺傳、變異、分化、疾病、衰老和死亡等無(wú)一不是整個(gè)機(jī)體生命過(guò)程的反映，甚至是縮影。細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞學(xué)的創(chuàng)立(chuànglì)是“十九世紀(jì)三大發(fā)現(xiàn)之一”；“每一個(gè)生物學(xué)問題的關(guān)鍵最終必然從細(xì)胞中去尋找”。研究細(xì)胞有多種方式、多條途徑以及不同層次，但最重要的是對(duì)單個(gè)或群體細(xì)胞的觀察與分析。其中細(xì)胞培養(yǎng)幾乎可以最直接、最簡(jiǎn)單和最準(zhǔn)確地反第三頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論映生命的各種活動(dòng)規(guī)律，以及部分地提供在機(jī)體中發(fā)生的各種信息。細(xì)胞培養(yǎng)是一門技術(shù)，包含有諸多方面的知識(shí)，涉及細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)與植物學(xué)、病原學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、生物工程學(xué)甚至光學(xué)、物理學(xué)等學(xué)科，因此學(xué)習(xí)細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)有一定的其他(qítā)學(xué)科的知識(shí)，操作時(shí)刻不忘“無(wú)菌”概念。

第四頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論一、體外培養(yǎng)的概念體外培養(yǎng)技術(shù)是一門以模擬體內(nèi)生長(zhǎng)條件為基礎(chǔ)而建立的“活體(huótǐ)”實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其相對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)，具有能夠簡(jiǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境、明確生長(zhǎng)條件、便于施加實(shí)驗(yàn)因素、容易獲得活體(huótǐ)直接觀測(cè)結(jié)果以及方便控制培養(yǎng)產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。第五頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

體外培養(yǎng)(invitroculture)：是將活體結(jié)構(gòu)成分(如活體組織、活體細(xì)胞或活體器官(qìguān)等)甚或活的個(gè)體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下使之存活和生長(zhǎng)發(fā)育的方法。按照體外培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分，可將體外培養(yǎng)人為分為：組織培養(yǎng)(tissueculture)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)器官培養(yǎng)(organculture)第六頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論組織培養(yǎng):指從生物體內(nèi)取出活的組織(多指組織塊）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。組織培養(yǎng)的對(duì)象在體外可以發(fā)生分化并保持組織的結(jié)構(gòu)和功能，但不具備器官的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)：指將活細(xì)胞(尤其(yóuqí)是分散的細(xì)胞)在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。細(xì)胞培養(yǎng)強(qiáng)調(diào)在培養(yǎng)過(guò)程中分散的細(xì)胞不在形成組織。包括單細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞克隆化培養(yǎng)。器官培養(yǎng)：指從生物體內(nèi)取出活的器官(一般是胚胎器官)

、器官的一部分在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。器官培養(yǎng)的對(duì)象在體外環(huán)境下也可能發(fā)生一定程度的分化，但始終保持器官的基本結(jié)構(gòu)和功能特征。事實(shí)上，三種培養(yǎng)方法沒有截然的界限。第七頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論第八頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)組織不能在體外長(zhǎng)期維持(wéichí)其結(jié)構(gòu)和功能，培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代，細(xì)胞出現(xiàn)單一化現(xiàn)象——趨向單一類型的細(xì)胞——最終成為細(xì)胞培養(yǎng)。同樣細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)也是相互依存的，而不是各自為政，表現(xiàn)為一定的“組織”特征，故組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)為同義詞。是否有體內(nèi)培養(yǎng)(invivoculture)？第九頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

體內(nèi)培養(yǎng)(invivoculture)：將活體結(jié)構(gòu)成分(如活體組織、活體細(xì)胞、活體器官等)甚至(shènzhì)活的個(gè)體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在其他生物體內(nèi)讓其生長(zhǎng)和發(fā)育的方法。最常見的體內(nèi)培養(yǎng)方式就是移植(trans-Plantation)。第十頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論二、體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷史

19世紀(jì)(shìjì)后葉實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)的興起拉開了體外培養(yǎng)技術(shù)的序幕，一些著名實(shí)驗(yàn)如下：

●1859年，法國(guó)解剖學(xué)家Vulpain最早嘗試將蛙胚尾部組織切下，放到普通水內(nèi)進(jìn)行“培養(yǎng)”，結(jié)果觀察到了生長(zhǎng)和分化現(xiàn)象。

●1885年，德國(guó)人Roux用溫?zé)岬纳睇}水在體外使雞胚髓板組織存活了數(shù)天，被認(rèn)為是體外培養(yǎng)的萌芽實(shí)驗(yàn)，他首次提出組織培養(yǎng)這一概念。

●1887年，Arnold將赤楊髓質(zhì)小片在蛙的體液中浸過(guò)，然后將木片分別種植到蛙的皮下或腹腔內(nèi)，木片被白細(xì)胞浸潤(rùn)后，于種植后不同時(shí)間將木片取出并置于溫鹽水中，觀察到有白細(xì)胞從木片遷移到鹽水中，且能短期存活。

第十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

●1897年，Loeb首次在含有少量血漿凝塊的試管中培養(yǎng)成年兔的肝、腎、甲狀腺與卵巢植塊，發(fā)現(xiàn)這些(zhèxiē)植塊在3d內(nèi)仍能保持正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。被認(rèn)為是器官培養(yǎng)的最早嘗試。

●1903年，Jolly用懸滴法將蠑螈的白細(xì)胞在體外維持存活了近一個(gè)月時(shí)間。

●1906年，Beebe和Ewing以蓋片懸滴培養(yǎng)法用動(dòng)物血清培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細(xì)胞在體外存活了約72h.

第十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論（一）體外培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立●1907年，實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)家RHarrison在研究神經(jīng)突起的起源時(shí)進(jìn)行了一項(xiàng)著名的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：蛙胚髓管部的小片組織

營(yíng)養(yǎng)成分：蛙的淋巴液

實(shí)驗(yàn)方法(fāngfǎ)：蓋玻片覆蓋凹窩懸滴培養(yǎng)法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將蛙胚髓管部的小片組織在體外培養(yǎng)了數(shù)周之久，并觀察到有神經(jīng)突起從種植的神經(jīng)組織塊長(zhǎng)出。

貢獻(xiàn)：Harrison的工作較為完善地建立了體外培養(yǎng)活體組織的培養(yǎng)體系，第一次較為系統(tǒng)地觀察了體外培養(yǎng)活體組織的結(jié)果。被公認(rèn)為是體外培養(yǎng)技術(shù)的開始，標(biāo)志著體外培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立，標(biāo)志著蓋玻片懸滴培養(yǎng)法的建立，標(biāo)志著神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的開始，也標(biāo)志著神經(jīng)突起是由神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出的這一重大理論的誕生。

第十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論第十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

●

1910年，ACarrel在沒有抗生素的情況下，僅靠小心細(xì)致的無(wú)菌操作，連續(xù)培養(yǎng)雞胚心臟植塊長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久。Carrel對(duì)體外培養(yǎng)的貢獻(xiàn)：

◆將無(wú)菌操作觀念引入體外培養(yǎng)過(guò)程中。

◆將培養(yǎng)組織包埋技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及繼續(xù)培養(yǎng)(也稱傳代或繼代(jìdài)培養(yǎng))等許多重要的培養(yǎng)條件和方法引入蓋玻片懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)，從而完善了Harrison的方法。

◆發(fā)現(xiàn)雞胚浸液能明顯地促進(jìn)多種細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。

◆設(shè)計(jì)卡氏培養(yǎng)瓶減少了污染，擴(kuò)大了細(xì)胞生存空間。第十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

1910年，美國(guó)醫(yī)生MTBurrows對(duì)懸滴培養(yǎng)法的改進(jìn):

①用血漿凝塊替代蛙淋巴凝塊包埋要培養(yǎng)的組織，延長(zhǎng)了組織在體外存活的時(shí)間。

②與Carrel合作，致力于發(fā)展哺乳動(dòng)物組織的培養(yǎng)，證明體外培養(yǎng)細(xì)胞的壽命可以因傳代而延長(zhǎng)。

③胚胎浸液與血漿混合使用，培養(yǎng)物可以活的更好。通過(guò)Carrel等學(xué)者的工作，使得體外連續(xù)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和傳代成為可能?，F(xiàn)在一般認(rèn)為(rènwéi)體外培養(yǎng)技術(shù)是從Harrison和Carrel真正開始的。

第十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論●1925年，Maximov對(duì)懸滴培養(yǎng)法作了改進(jìn)，創(chuàng)造了“雙蓋玻片法”，可以更好地防止污染，也更適用于神經(jīng)組織的培養(yǎng)?！駜晌幻绹?guó)科學(xué)家W.H.Lewis和M.R.Lewis最先試用已知成分的合成培養(yǎng)基取代(qǔdài)不能準(zhǔn)確確定其成分的天然培養(yǎng)基，由于他們和其它許多科學(xué)家在此后30多年的努力，最終發(fā)展出許多合成培養(yǎng)基。●劍橋大學(xué)Strangeways實(shí)驗(yàn)室的HonorFell完善了組織和器官，乃至整個(gè)胚胎的體外培養(yǎng)方法(表玻皿器官培養(yǎng)法)。借此保持它們正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，并防止從外植物新長(zhǎng)出的細(xì)胞生長(zhǎng)紊亂。Fell及其同事使用此技術(shù)培養(yǎng)骨和關(guān)節(jié)組織，為我們提供了大量有關(guān)這些組織發(fā)育的知識(shí)。第十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論（二）體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展發(fā)展主要包括：探討體外培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件試圖(shìtú)建立化學(xué)成分明確的人工合成培養(yǎng)基配方以代替成分不明確的天然物質(zhì)。最終導(dǎo)致人工合成培養(yǎng)基的誕生。試圖培養(yǎng)不同類別的生物體組織細(xì)胞1913年，Steinhard以血漿凝塊懸滴培養(yǎng)法分離培養(yǎng)痘苗病毒，為體外培養(yǎng)技術(shù)在病毒學(xué)上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1915年，Goldschmidt最早進(jìn)行無(wú)脊椎動(dòng)物組織的體外培養(yǎng)，成功培養(yǎng)了鱗翅目昆蟲組織。建立不同的培養(yǎng)技術(shù)第十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論發(fā)展時(shí)期：以20世紀(jì)50年代為界分為三個(gè)時(shí)期50年代前是培養(yǎng)技術(shù)在多個(gè)(duōɡè)領(lǐng)域廣泛發(fā)展的時(shí)期1933年，GOGey創(chuàng)立了旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法，并以此建立了許多細(xì)胞系。如1951年Gey等以腫瘤組織為材料成功建立了Hela細(xì)胞系。1948年，KKSanford創(chuàng)立了分離細(xì)胞培養(yǎng)法，第一次成功地從單層細(xì)胞分離出單個(gè)細(xì)胞，使得建立遺傳性狀相同的細(xì)胞株成為可能。1949年，Polge等發(fā)現(xiàn)了甘油能夠用于保護(hù)低溫下貯存的細(xì)胞。第十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論50年代是培養(yǎng)技術(shù)迅猛發(fā)展時(shí)期，多種培養(yǎng)技術(shù)相繼被建立1950年，JFMorgan等提出199配方。1951年，JEShannon和Earle建立T瓶（Earle瓶）培養(yǎng)法。CMPomerat改良和設(shè)計(jì)了結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且易于消毒的灌流小室，使得體外培養(yǎng)的細(xì)胞能在不斷更新的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。1954年，Earle等建立了懸浮培養(yǎng)法。1955年，HEagle等建立著名的Eagle培養(yǎng)基配方。1957年，Dulbecco等開始采用(cǎiyòng)胰蛋白酶消化處理來(lái)分離細(xì)胞的方法以及應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，使得體外培養(yǎng)單層細(xì)胞成為可能。1959年，Lovelock等發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)冷凍保護(hù)劑----二甲基亞砜。1960年，GBarski等在兩種不同類型的細(xì)胞混合培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞間存在自發(fā)融合現(xiàn)象。第二十頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論第二十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論50年代后是體外培養(yǎng)技術(shù)與生命科學(xué)其它技術(shù)結(jié)合發(fā)展的新時(shí)期，誕生(dànshēng)了多種培養(yǎng)的應(yīng)用技術(shù)

以體外培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)、微生物制藥技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染與細(xì)胞融合以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化等細(xì)胞工程技術(shù)。1967年，ALVanWezel創(chuàng)立了微載體技術(shù)用于體外大規(guī)模培養(yǎng)。1972年，RAKnazek等創(chuàng)立了中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管”—中空纖維給體外培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件。標(biāo)志著體外培養(yǎng)技術(shù)從過(guò)去以二維生長(zhǎng)條件跨越到以三維生長(zhǎng)條件進(jìn)行體外培養(yǎng)的新階段。

第二十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

現(xiàn)代組織培養(yǎng)的三個(gè)階段第一階段懸滴培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)法具有簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，其次由于培養(yǎng)基中有纖維蛋白構(gòu)成的支架，可供細(xì)胞向四面八方生長(zhǎng)，培養(yǎng)物是立體的。在此環(huán)境中，細(xì)胞不僅能增殖生長(zhǎng)，也能發(fā)生分化，如心肌發(fā)生搏動(dòng)等。缺陷：空間狹小、氣體不足、培養(yǎng)液少、難以大量繁殖細(xì)胞，觀察不方便等。第二階段單層培養(yǎng)單層細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)(tǐnèi)細(xì)胞比仍然有很大差距(缺少細(xì)胞基質(zhì)、血液供應(yīng)、調(diào)控因子)

。細(xì)胞只有長(zhǎng)和寬二維結(jié)構(gòu)，大多細(xì)胞會(huì)失去原體內(nèi)時(shí)立體的形態(tài)，也是細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生改變的主要原因。細(xì)胞在形態(tài)、功能上與體內(nèi)時(shí)不同，多數(shù)不能充分表達(dá)原基因產(chǎn)物。第三階段三維培養(yǎng)(立體培養(yǎng))為培養(yǎng)細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的支架系統(tǒng)，創(chuàng)建與原體內(nèi)類似的條件，不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖，也可使細(xì)胞發(fā)生分化和表達(dá)體內(nèi)時(shí)的某些產(chǎn)物。第二十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

現(xiàn)代組織培養(yǎng)的重要標(biāo)志：

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培養(yǎng)液的改變

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培養(yǎng)容器的改變

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培養(yǎng)方法的改進(jìn)：

◆1948年Sanford創(chuàng)立了單細(xì)胞分離培養(yǎng)法

◆

1957年蛋白酶消化組織，分離細(xì)胞(xìbāo)

◆液體培養(yǎng)基的應(yīng)用

●

細(xì)胞培養(yǎng)用的多種材料都已商品化、規(guī)范化和系列化?！?/p>

低溫冷凍技術(shù)的應(yīng)用，可將已建立的多種細(xì)胞系和細(xì)胞株長(zhǎng)期凍存。第二十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

●

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)更加廣泛地用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究(如分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞工程等學(xué)科均與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)密切相關(guān))如：

◆應(yīng)用理化因素誘發(fā)出遺傳缺陷細(xì)胞株。

◆利用(lìyòng)細(xì)胞技術(shù)，用雜交瘤細(xì)胞制備McAb

◆用細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)環(huán)境中可疑致癌物，癌基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。

◆基因工程的生產(chǎn)手段，用于生產(chǎn)多種生物制品。第二十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

（三）我國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展20世紀(jì)30年代細(xì)胞培養(yǎng)傳入我國(guó)，50年代以后組織培養(yǎng)在我國(guó)逐漸開展起來(lái)(qǐlái)。李繼侗、沈同(銀杏胚胎的培養(yǎng))、羅宗洛和羅士偉(玉米根尖生長(zhǎng)錐的培養(yǎng))是植物組織培養(yǎng)的先驅(qū)者。細(xì)胞學(xué)家張鈞、鮑鑒清和楊敷海等則最早將動(dòng)物組織培養(yǎng)引入我國(guó)。病毒分離培養(yǎng)：湯飛凡、郭輝玉、顧方舟等昆蟲組織培養(yǎng)：高尚蔭、劉年翠等腫瘤培養(yǎng)：曾毅、鄂征、潘瓊婧、何申、姚開泰等神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)：鮑璇、邵文釗、郭畹華等干細(xì)胞培養(yǎng)：姚鑫、吳祖澤等第二十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論三、體外培養(yǎng)技術(shù)的主要類別按照體外培養(yǎng)的對(duì)象(duìxiàng)，可分為全部培養(yǎng)和部分培養(yǎng)兩大類：全部培養(yǎng)：指對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)象一般是微小的生物個(gè)體，如微生物、寄生蟲等。部分培養(yǎng)：指對(duì)生物個(gè)體的一部分進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)第二十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論四、體外培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用在組織學(xué)與胚胎學(xué)上的應(yīng)用：培養(yǎng)胚胎器官，研究其分化和發(fā)育過(guò)程。是研究胚胎發(fā)生、發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)現(xiàn)象、發(fā)育潛能、胚胎致畸作用、環(huán)境誘變等衍生(yǎnshēnɡ)、演化生長(zhǎng)行為及其機(jī)制的重要手段。在細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)用：廣泛由于細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生理、細(xì)胞遺傳學(xué)研究。腫瘤學(xué)方面的研究：腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性研究腫瘤發(fā)病機(jī)制研究異種移植研究第二十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論在微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)在免疫學(xué)方面的應(yīng)用：抗體的產(chǎn)生、單克隆抗體的制備在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：藥物篩選、細(xì)胞毒性和活性檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞與微生物大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐上的應(yīng)用：疫苗、單克隆抗體、干擾素、激素、生長(zhǎng)因子、酶制劑等在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：以培養(yǎng)細(xì)胞移植修復(fù)骨和軟骨缺損、體外受精(tǐwàishòujīnɡ)產(chǎn)生試管嬰兒、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞移植、器官移植等。第二十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論五、對(duì)體外培養(yǎng)技術(shù)的評(píng)價(jià)

●能長(zhǎng)時(shí)間直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)，是多學(xué)科進(jìn)行科學(xué)研究的對(duì)象和工具，如細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)等。

●供研究的細(xì)胞種類極為廣泛，從低等生物到人，或正常組織或腫瘤組織細(xì)胞，而且便于記錄(通過(guò)攝影、閉路電視和攝電影等方式)

●易施加(shījiā)理化因素和生物因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。如研究某種實(shí)驗(yàn)因素對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)作用，只需在培養(yǎng)液中有針對(duì)性地加入或刪除該成分即可。

第三十頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

●可同時(shí)方便獲得大量細(xì)胞類型單一、細(xì)胞周期同步、生物學(xué)性狀基本相同并對(duì)實(shí)驗(yàn)因素反應(yīng)一致的細(xì)胞群。

●

能夠進(jìn)行(jìnxíng)大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)。利用體外培養(yǎng)技術(shù)可以大量繁殖動(dòng)物細(xì)胞或微生物以生產(chǎn)生物制品。

●

與體內(nèi)環(huán)境相比，體外培養(yǎng)細(xì)胞在一定程度上失去了組織聯(lián)系及相互作用，缺乏在體內(nèi)時(shí)的血運(yùn)和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)作用，因此不能將體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一并推至體內(nèi)，即不能輕易下結(jié)論。第三十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論1.Anchorage-dependentcellsorcultures(貼壁依賴性細(xì)胞或培養(yǎng)物)：體外培養(yǎng)的細(xì)胞只有貼附在不起化學(xué)作用的物體的表面時(shí)才能生長(zhǎng)、生存或維持功能。2.Apoptosis(細(xì)胞凋亡)：是指細(xì)胞內(nèi)死亡程序的啟動(dòng)而導(dǎo)致細(xì)胞自殺的過(guò)程，因此也常稱為程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)。細(xì)胞凋亡與機(jī)體正常發(fā)育、形態(tài)形成以及多余細(xì)胞的清除等生理(shēnglǐ)過(guò)程密切相關(guān)，所以被認(rèn)為是一種積極的生理(shēnglǐ)性死亡。六、組織培養(yǎng)常用(chánɡyònɡ)術(shù)語(yǔ)第三十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

3.Cellculture(細(xì)胞培養(yǎng))：細(xì)胞在體外條件下的生長(zhǎng)。4.Cellfusion(細(xì)胞融合)：體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)試劑、病毒或物理方法誘發(fā)，使同種或不同種的2個(gè)或2個(gè)以上體細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞的過(guò)程。5.cellgenerationtime(細(xì)胞一代時(shí)間)：是指單個(gè)細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時(shí)間間隔(jiàngé)?？山柚@微鏡電影照相術(shù)來(lái)精確確定。6.Primaryculture（原代培養(yǎng)）：是指直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。第三十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

7.cellline(細(xì)胞系)：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系。8.Clone(克隆)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞通過(guò)有絲分裂形成的細(xì)胞群體(qúntǐ)，他們的遺傳特性相同。9.Confluence(匯合)：指在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞彼此匯合形成單層，注意與細(xì)胞融合的區(qū)別。

第三十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

10.Contactinhibition(接觸抑制)：當(dāng)一個(gè)貼壁生長(zhǎng)(shēngzhǎng)的體外正常細(xì)胞生長(zhǎng)(shēngzhǎng)至與另一個(gè)細(xì)胞相互接觸時(shí)，便停止了分裂增殖，相互雖然緊密接觸，但不形成交叉重疊生長(zhǎng)(shēngzhǎng)，也不再進(jìn)入S期。11.Invitromalignanttransformation(體外惡性轉(zhuǎn)化)：細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中獲得了致瘤性，當(dāng)把這種細(xì)胞接種于適當(dāng)?shù)膭?dòng)物，可以產(chǎn)生腫瘤，即異種動(dòng)物接種致瘤實(shí)驗(yàn)。12.Invitrotransformation(體外轉(zhuǎn)化)：細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生與原代細(xì)胞形態(tài)、抗原、增殖或其他特性的可遺傳的變化，但不一定具有致瘤性。第三十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

13.Minimalmedium(最低限度培養(yǎng)基)：能滿足大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖需要的最簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基。14.Organculture(器官培養(yǎng))：是指維持整個(gè)器官或器官的一部分在體外生存和生長(zhǎng)，并一定(yīdìng)程度上保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能的方法。15.Passage(Subculture，傳代或傳代培養(yǎng))：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到更多培養(yǎng)瓶的過(guò)程。第三十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論16.Saturationdensity(飽和密度)：在特定條件下，培養(yǎng)容器能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止(tíngzhǐ)增殖。在貼壁培養(yǎng)中以每平方厘米的細(xì)胞數(shù)表示，而懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則以每立方厘米的細(xì)胞數(shù)表示。17.HeLacell來(lái)源于子宮頸癌組織(美國(guó)黑人婦女HenriettaLacks)的上皮細(xì)胞系，為體外最早建立的人類癌細(xì)胞系。第三十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

1951年，美國(guó)非裔煙農(nóng)HenriettaLacks因?qū)m頸癌病逝于巴爾的摩一家醫(yī)院，當(dāng)時(shí)她只有31歲。在未告知的情況下，科學(xué)家以她的子宮頸癌切除組織，成功培育出第1種體外可無(wú)限增殖的人類細(xì)胞系。很快“海拉細(xì)胞”(HeLacells)細(xì)胞就開始從巴爾的摩運(yùn)往世界各地。62年過(guò)去了---這是拉克斯女士壽命的兩倍---她的細(xì)胞承擔(dān)了超過(guò)74,000項(xiàng)研究課題，其中很多已在細(xì)胞生物學(xué)、疫苗(yìmiáo)、試管嬰兒、癌癥研究和許多藥物等方面結(jié)出了碩果，造就了產(chǎn)值龐大的相關(guān)產(chǎn)業(yè)。HeLa細(xì)胞是科學(xué)史上最著名且最有價(jià)值的人類細(xì)胞，不過(guò)未來(lái)取得“海拉細(xì)胞”的難度會(huì)提高。第三十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論第三十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論第四十頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論拉克斯女士身后留下的孩子，現(xiàn)在已有孫輩和曾孫輩，他們中很多人還生活在巴爾的摩或附近地區(qū)。設(shè)在德國(guó)的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)的科學(xué)家今年3月發(fā)布(fābù)了HeLa細(xì)胞系一個(gè)支系的全基因組序列，可供公開下載。包括會(huì)暴露出拉克斯后代的某些特征。這類信息可能會(huì)透露疾病傾向，像是酗酒、阿茲海默癥或是躁郁癥，并可能會(huì)使個(gè)人遭到保險(xiǎn)公司拒保壽險(xiǎn)或失能保險(xiǎn)。在拉克斯家屬提出抗議后，這些資料已不再“公諸于世”。第四十一頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

另一項(xiàng)由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)資助、華盛頓大學(xué)(UniversityofWashington)進(jìn)行的研究即將在nature上發(fā)表。這兩項(xiàng)研究都未曾讓拉克斯家庭知悉。美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的官員現(xiàn)在承認(rèn)，研究院在最初申請(qǐng)資金對(duì)海拉細(xì)胞(xìbāo)基因組測(cè)序時(shí)，就應(yīng)該聯(lián)系拉克斯家族。而在拉克斯家族提出反對(duì)后，他們也沒有及時(shí)處理該問題。歐洲研究者們撤下此前發(fā)布的公共數(shù)據(jù)，華盛頓大學(xué)的論文發(fā)表也被叫停。柯林斯以及美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院負(fù)責(zé)科學(xué)、普及和政策副主任凱茜·L·哈德遜(KathyL.Hudson)三次前往巴爾的摩與拉克斯的家人見面，并就研究和接下來(lái)應(yīng)該怎么辦進(jìn)行了討論。第四十二頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論這起事件引發(fā)拉克斯家族與NIH對(duì)話，8月8日NIH宣布，已和HenriettaLacks的后代達(dá)成協(xié)議：兩項(xiàng)研究所得出的數(shù)據(jù)應(yīng)該被儲(chǔ)存在該研究院的基因型和表型數(shù)據(jù)庫(kù)，想要使用數(shù)據(jù)的研究者可以進(jìn)行申請(qǐng)，獲得權(quán)限，而且必須每年提交研究報(bào)告。NIH一個(gè)被稱為“海拉基因組數(shù)據(jù)權(quán)限獲取工作小組”的組織會(huì)對(duì)這些申請(qǐng)進(jìn)行審查，小組中將有拉克斯的兩名家族成員。根據(jù)協(xié)議，拉克斯家族不會(huì)獲得海拉基因組研究所產(chǎn)生的任何可能(kěnéng)商業(yè)產(chǎn)品帶來(lái)的利益。簽訂上述協(xié)議后，華盛頓大學(xué)的研究人員便可以發(fā)表其研究結(jié)果了。他們的分析在幾個(gè)方面超過(guò)了歐洲的研究。最重要的是，他們精確地說(shuō)明了海拉細(xì)胞DNA中每一個(gè)基因的具體位置。

第四十三頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論即研究人員要使用HeLa細(xì)胞做研究，必須(bìxū)向NIH申請(qǐng)，并且遵守兩名拉克斯家屬參與的小組規(guī)范條款，并將研究成果貢獻(xiàn)到資料庫(kù)。NIH院長(zhǎng)柯林斯(FrancisCollins)告訴記者：“這是具歷史性的新協(xié)議?！边@項(xiàng)協(xié)議將“保護(hù)家屬權(quán)益，同時(shí)也加深他們對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究的投入”。第四十四頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

18.Suspensionculture(懸浮培養(yǎng))：細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖的一種培養(yǎng)方法。19.Tissueculture(組織培養(yǎng))：組織在體外條件(tiáojiàn)下保存或生長(zhǎng)。借此組織結(jié)構(gòu)或功能得以在體外保持，亦可能在體外維持其分化。20.Transfection(轉(zhuǎn)染)：用生物學(xué)的、物理的或化學(xué)的方法將目的基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)方法。21.Lipofectin：一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，用該試劑包裹DNA可形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，再通過(guò)細(xì)胞膜融合可將DNA轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。第四十五頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論22.Cellcycle：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)相過(guò)程。分4個(gè)時(shí)期，即DNA合成期(S期)、有絲分裂期(M期)、有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期(G1期)以及(yǐjí)DNA復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期(G2)。若某種原因細(xì)胞不再沿細(xì)胞周期運(yùn)行，而進(jìn)入休眠狀態(tài)稱為G0期。第四十六頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論23.細(xì)胞株(cellstrain)：是由具有某些特性與標(biāo)志的細(xì)胞選擇或克隆化而派生的亞系，這些(zhèxiē)特性或標(biāo)志在隨后的培養(yǎng)中必須保持下去。第四十七頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

24.Stemcell(干細(xì)胞)：具有繼續(xù)增殖(zēngzhí)與分化潛能的細(xì)胞，其中胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcell，ESC)可形成機(jī)體所有各種類型的組織和細(xì)胞，甚至發(fā)育成一個(gè)完整的胚胎，故又稱全能性(totipotency)干細(xì)胞。隨著細(xì)胞分化，這種分化潛能逐漸受到局限，只能分化形成有限細(xì)胞類型的細(xì)胞稱為多能性(multipotency)干細(xì)胞，最終成為單能干細(xì)胞(Monopotencystemcell)或定向干細(xì)胞(directional).第四十八頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

克隆羊多利(Dolly)的誕生(dànshēng)

1997年2月，英國(guó)Roslin研究所克隆羊多利(Dolly)的誕生揭示一個(gè)全新概念：由成年機(jī)體的一個(gè)體細(xì)胞核，可以復(fù)制一個(gè)基因完全相同的新生命個(gè)體。克隆羊的誕生，預(yù)示著動(dòng)物將成為人類的藥物制造廠。第四十九頁(yè)，共五十五頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

在培育多利的過(guò)程中，科學(xué)家采用體細(xì)胞克隆技術(shù)，主要分四個(gè)步驟進(jìn)行：①?gòu)囊恢涣鶜q雌性的芬蘭多塞特(FinnDorset)白面綿羊(稱之為A)的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞。②從一頭蘇格蘭黑面母綿羊(稱之為B)的卵巢