細(xì)胞生物學(xué) 第十二章 細(xì)胞增殖及其調(diào)控

第十二章細(xì)胞增殖及其調(diào)控●細(xì)胞增殖(cellproliferation)的意義●細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂●細(xì)胞周期調(diào)控1細(xì)胞增殖(cellproliferation)的意義◆細(xì)胞增殖(cellproliferation)是細(xì)胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的基礎(chǔ)?！魡渭?xì)胞生物細(xì)胞增殖導(dǎo)致生物個體數(shù)量的增加?！舳嗉?xì)胞生物由一個單細(xì)胞(受精卵)分裂發(fā)育而來，細(xì)胞增殖是多細(xì)胞生物繁殖基礎(chǔ)?！舫审w生物仍然需要細(xì)胞增殖，主要取代衰老死亡的細(xì)胞，維持個體細(xì)胞數(shù)量的相對平衡和機體的正常功能。 ◆機體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴細(xì)胞增殖。2第一節(jié)細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂●細(xì)胞周期(cellcycle)概述●有絲分裂(Mitosis)●減數(shù)分裂(Meiosis)

3第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控(Cell-CycleControl)

●細(xì)胞周期檢驗點(CellCycleCheckpoint)●細(xì)胞周期的調(diào)控子——異二聚體蛋白激酶●MPF●芽殖酵母的研究●裂殖酵母的研究

●周期蛋白

(Cyclin)的發(fā)現(xiàn)●MPF組成鑒定

●周期蛋白(Cyclin)●CDK和CDKI------細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)阻遏物●細(xì)胞周期調(diào)控方式●影響細(xì)胞周期調(diào)控的其它因素4一、細(xì)胞周期(cellcycle)概述

●細(xì)胞周期●細(xì)胞周期中各個不同時相及其主要事件●細(xì)胞周期長短測定●細(xì)胞周期同步化●特異的細(xì)胞周期5二、有絲分裂(mitosis)●前期(prophase)●前中期(prometaphase)●中期(metaphase)●后期(anaphase)

●末期(telophase)●胞質(zhì)分裂(Cytokinesis)6胞質(zhì)分裂(Cytokinesis)●動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂●植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂7三、減數(shù)分裂(Meiosis)●減數(shù)分裂概念與過程：●減數(shù)分裂特點●脊椎動物配子發(fā)生過程●減數(shù)分裂的意義8細(xì)胞周期◆概念：

從一次細(xì)胞分裂開始到下一次細(xì)胞分裂開始，或從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束，稱為一個細(xì)胞周期。

◆細(xì)胞周期時相組成◆細(xì)胞周期時間◆根據(jù)增殖狀況，細(xì)胞分類三類9細(xì)胞周期時相組成·間期(interphase):G1phase，Sphase，G2phase·Mphase:有絲分裂期(Mitosis),胞質(zhì)分裂期(Cytokinesis)

細(xì)胞沿著G1→S→G2→M→G1周期性運轉(zhuǎn)，在間期細(xì)胞體積增大(生長)，在M期細(xì)胞先是核分裂，接著胞質(zhì)分裂，完成一個細(xì)胞周期。10細(xì)胞周期時間·不同細(xì)胞的細(xì)胞周期時間差異很大·S+G2+M的時間變化較小，細(xì)胞周期時間長短主要差別在G1期·有些分裂增殖的細(xì)胞缺乏G1、G2期11根據(jù)增殖狀況，細(xì)胞分類三類·連續(xù)分裂細(xì)胞(cyclingcell)·休眠細(xì)胞(Go細(xì)胞)·終末分化細(xì)胞

G0期細(xì)胞和終末分化細(xì)胞的界限有時難以劃分，有的細(xì)胞過去認(rèn)為屬于終末分化細(xì)胞，目前可能被認(rèn)為是G0期細(xì)胞。12細(xì)胞周期中不同時相及其主要事件◆G1期◆S期◆G2期◆M期13G1期

·與DNA合成啟動相關(guān)，開始合成細(xì)胞生長所需要的多種蛋白質(zhì)、RNA、碳水化合物、脂等，同時染色質(zhì)去凝集。14G2期·DNA復(fù)制完成，在G2期合成一定數(shù)量的蛋白質(zhì)和RNA分子15M期·M期即細(xì)胞分裂期，真核細(xì)胞的細(xì)胞分裂主要包括兩種方式，即有絲分裂(mitosis)和減數(shù)分裂(meiosis)。遺傳物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)分配給子細(xì)胞。16S期

·DNA復(fù)制與組蛋白合成同步，組成核小體串珠結(jié)構(gòu)17細(xì)胞周期長短測定◆脈沖標(biāo)記DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂指數(shù)觀察測定法

(Percentageoflabelledmitosis，PLM)

◆流式細(xì)胞儀測定法(FlowCytometry)◆縮時攝像技術(shù)， 可以得到準(zhǔn)確的細(xì)胞周期時間及分裂間期和分裂期的準(zhǔn)確時間。18細(xì)胞周期同步化◆自然同步化，如有一種粘菌的變形體plasmodia，某些受精卵早期卵裂

◆人工選擇同步化◆藥物誘導(dǎo)法◆條件依賴性突變株在細(xì)胞周期同步化中的應(yīng)用：將與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的條件依賴性突變株轉(zhuǎn)移到限定條件下培養(yǎng)，所有細(xì)胞便被同步化在細(xì)胞周期中某一特定時期。19人工選擇同步化·有絲分裂選擇法：用于單層貼壁生長細(xì)胞。優(yōu)點是細(xì)胞未經(jīng)任何藥物處理，細(xì)胞同步化效率高。缺點是分離的細(xì)胞數(shù)量少?！っ芏忍荻入x心法：根據(jù)不同時期的細(xì)胞在體積和重量上存在差別進行分離。優(yōu)點是方法簡單省時，效率高，成本低。缺點是對大多數(shù)種類的細(xì)胞并不適用。20藥物誘導(dǎo)法·DNA合成阻斷法─G1/S-TdR雙阻斷法：最終將細(xì)胞群阻斷于G1/S交界處。優(yōu)點是同步化效率高，幾乎適合于所有體外培養(yǎng)的細(xì)胞體系。缺點是誘導(dǎo)過程可造成細(xì)胞非均衡生長·

分裂中期阻斷法：通過抑制微管聚合來抑制細(xì)胞分裂器的形成，將細(xì)胞阻斷在細(xì)胞分裂中期。優(yōu)點是操作簡便，效率高。缺點是這些藥物的毒性相對較大21特異的細(xì)胞周期

特異的細(xì)胞周期是指那些特殊的細(xì)胞所具有的與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期相比有著鮮明特點的細(xì)胞周期。

◆爪蟾早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期◆酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期◆植物細(xì)胞的細(xì)胞周期◆細(xì)菌的細(xì)胞周期22爪蟾早期胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期·細(xì)胞分裂快,無G1期,G2期非常短,S期也短(所有復(fù)制子都激活),

以至認(rèn)為僅含有S期和M期·無需臨時合成其它物質(zhì)·子細(xì)胞在G1、G2期并不生長，越分裂體積越小

·細(xì)胞周期調(diào)控因子和調(diào)節(jié)機制與一般體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的 細(xì)胞周期基本是一致的23酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期·酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期在時相和調(diào)控方面相似·酵母細(xì)胞周期明顯特點:

酵母細(xì)胞周期持續(xù)時間較短；封閉式細(xì)胞分裂，即細(xì)胞分裂時核膜不解聚；紡錘體位于細(xì)胞核內(nèi)；在一定環(huán)境下，也進行有性繁殖芽殖酵母和裂殖酵母24植物細(xì)胞的細(xì)胞周期·植物細(xì)胞的細(xì)胞周期與動物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四個時期?！ぶ参锛?xì)胞不含中心體，但在細(xì)胞分裂時可以正常組裝紡錘體?！ぶ参锛?xì)胞以形成中板的形式進行胞質(zhì)分裂25細(xì)菌的細(xì)胞周期·

慢生長細(xì)菌細(xì)胞周期過程與真核細(xì)胞周期過程有一定相似之處。其DNA復(fù)制之前的準(zhǔn)備時間與G1期類似。分裂之前的準(zhǔn)備時間與G2期類似。再加上S期和M期，細(xì)菌的細(xì)胞周期也基本具備四個時期

·

細(xì)菌在快速生長情況下，如何協(xié)調(diào)快速分裂和最 基本的DNA復(fù)制速度之間的矛盾26前期(prophase)◆標(biāo)志前期開始的第一個特征是染色質(zhì)開始濃縮

(condensation)形成有絲分裂染色體(mitoticchromosome）◆第二個特征細(xì)胞骨架解聚，有絲分裂紡錘體(mitoticspindle)開始裝配◆Golgi體、ER等細(xì)胞器解體，形成小的膜泡27·這種染色體由兩條染色單體(chromatid)構(gòu)成

·在前期末，染色體主縊痕部位形成一種蛋白復(fù) 合物稱為動粒(kinetochore)28

間期動物細(xì)胞含一個MTOC，即中心體，在

S期末，兩個中心粒在各自垂直的方向復(fù)制出一個中心粒，形成兩個中心體。當(dāng)前期開始時，

2個中心體移向細(xì)胞兩極，并同時組織微管生長，由兩極形成的微管通過微管結(jié)合蛋白在正極末端相連，最后形成有絲分裂紡錘體。29前中期(prometaphase) ◆核膜破裂成小的膜泡，這一過程是由核纖層蛋白中 特異的Ser殘基磷酸化導(dǎo)致核纖層解體 ◆紡錘體微管與染色體的動粒結(jié)合，捕捉住染色體 每個已復(fù)制的染色體有兩個動粒，朝相反方向，保 證與兩極的微管結(jié)合；紡錘體微管捕捉住染色體后， 形成三種類型的微管◆不斷運動的染色體開始移向赤道板。細(xì)胞周期也由前中期逐漸向中期運轉(zhuǎn)。30中期(metaphase)◆所有染色體排列到赤道板(MetaphasePlate)上，標(biāo)志著細(xì)胞分裂已進入中期◆是什么機制確保染色體正確排列在赤道板上？

·著絲粒微管動態(tài)平衡形成的張力

31后期(anaphase)

◆排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離產(chǎn)生向極運動◆后期(anaphase)大致可以劃分為連續(xù)的兩個階段，即后期A和后期B

·后期A，動粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)生兩極運動

·后期B，極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉長，介導(dǎo)染色體向極運動32末期(telophase)◆染色單體到達兩極，即進入了末期（telophase）,

到達兩極的染色單體開始去濃縮◆核膜開始重新組裝◆Golgi體和ER重新形成并生長◆核仁也開始重新組裝，RNA合成功能逐漸恢復(fù),

有絲分裂結(jié)束33動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂◆胞質(zhì)分裂(cytokinesis)開始于細(xì)胞分裂后期，在赤道板周圍細(xì)胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為

分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體極性微管和鈣離子濃度升高的變化有關(guān) ◆胞質(zhì)分裂開始時，大量肌動蛋白和肌球蛋白在中體處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細(xì)胞，稱為

收縮環(huán)（contractilering)。收縮環(huán)收縮、收縮環(huán) 處細(xì)胞膜融合并形成兩個子細(xì)胞34植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂 ◆與動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂不同的是，植物細(xì)胞胞質(zhì)分裂是因為在細(xì)胞內(nèi)形成新的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁而將細(xì)胞分開35減數(shù)分裂概念與過程◆概念：減數(shù)分裂是細(xì)胞僅進行一次DNA復(fù)制，隨后進行兩次分裂，染色體數(shù)目減半的一種特殊的有絲分裂 ◆減數(shù)分裂過程36減數(shù)分裂的意義◆確保世代間遺傳的穩(wěn)定性； ◆增加變異機會，確保生物的多樣性，增強生物適應(yīng)環(huán)境變化的能力?！魷p數(shù)分裂是生物有性生殖的基礎(chǔ)，是生物遺傳、生物進化和生物多樣性的重要基礎(chǔ)保證。37減數(shù)分裂特點◆遺傳物質(zhì)只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，導(dǎo)致染色體數(shù)目減半◆S期持續(xù)時間較長◆同源染色體在減數(shù)分裂期I(MeiosisI)配對聯(lián)會、基因重組◆減數(shù)分裂同源染色體配對排列在中期板上,第一次分列時,同源染色體分開38減數(shù)分裂前S期與有絲分裂前S期長度比較39·前期I分為細(xì)線期，偶線期，粗線期，雙線期，終變期等五個階段·形成聯(lián)會復(fù)合體(SynaptonemalComplex,SC)·同源染色體間遺傳物質(zhì)重組,產(chǎn)生新的基因組合40細(xì)胞周期調(diào)控對于多細(xì)胞有機體的正常發(fā)育是非常關(guān)鍵的，失去控制的細(xì)胞最終將導(dǎo)致癌變。到20世紀(jì)80年代末，細(xì)胞周期中的主要事件的分子機理才基本弄清楚。研究發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制和有絲分裂是細(xì)胞周期中的兩個關(guān)鍵調(diào)控事件。這些事件的主要調(diào)控子是一類數(shù)量很少的異二聚體蛋白激酶。這些激酶通過對核DNA復(fù)制和有絲分裂過程中所涉及到的一些蛋白的特殊位點進行磷酸化，來調(diào)節(jié)這些蛋白的活性，并進一步調(diào)控細(xì)胞周期。異二聚體蛋白激酶的調(diào)控亞基被稱為周期蛋白(cyclins),它們在整個細(xì)胞周期中時而增加，時而減少呈周期性變化。異二聚體蛋白激酶的催化亞基被稱為周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinases,Cdks)，它們在與周期蛋白結(jié)合前是沒有活性的。每一種Cdk催化亞基可與不同種的周期蛋白結(jié)合形成周期蛋白-Cdk復(fù)合體(cyclin-Cdkcomplex)，并且由其中的周期蛋白決定哪一些蛋白將被周期蛋白-Cdk復(fù)合體磷酸化。

41二、細(xì)胞周期檢驗點(checkpoint)

◆細(xì)胞周期檢驗點是細(xì)胞周期調(diào)控的一種機制,

主要是確保周期每一時相事件的有序、全部完成并與外界環(huán)境因素相聯(lián)系

◆細(xì)胞周期檢驗點及其作用

G1期檢驗點：酵母——Start；動物細(xì)胞——RestrictionPoint42三、 MPF

(Maturation-promotingfactor，

Mitosis-promotingfactor)●MPF(Maturation-promotingfactor，

Mitosis-promotingfactor)的發(fā)現(xiàn)及其生化實質(zhì)

43MPF的發(fā)現(xiàn)及其生化實質(zhì)◆細(xì)胞融合與PCC(Prematurechromosomalcondense)

◆爪蟾卵子成熟過程

◆MPF的發(fā)現(xiàn)44G2／M期轉(zhuǎn)化與CDKl激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用

◆隨Cyclin濃度變化而變化◆功能：啟動細(xì)胞從G2期進入M期的相關(guān)事件

·激酶與磷酸酶的調(diào)節(jié)，活化的MPF可使更多的MPF活化◆細(xì)胞周期調(diào)控因子之間的代償◆細(xì)胞周期調(diào)控因子對生物個體和器官的發(fā)育也起調(diào)節(jié)作用45Cyclin-Cdk復(fù)合物的多樣性及細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)◆Cyclin-Cdk復(fù)合物的多樣性

Cyclin-Cdk---調(diào)控細(xì)胞周期的引擎：不同的周期蛋白與不同的CDK結(jié)合，構(gòu)成不同的Cyclin-Cdk；不同的Cyclin-Cdk在不同的時相表現(xiàn)活性，影響不同的下游事件?！鬐2／M期轉(zhuǎn)化與CDKl激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用◆M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期轉(zhuǎn)化

◆G1Cyclin-Cdk復(fù)合物對Rb蛋白磷酸化而調(diào)控G1檢驗點◆每個細(xì)胞周期DNA只能復(fù)制一次

◆DNA復(fù)制延擱檢驗點參與調(diào)控S/G2/M期轉(zhuǎn)化◆細(xì)胞周期調(diào)控模型總結(jié)46Cyclin-Cdk復(fù)合物的多樣性 G1S G2/MCyclin-CdkCyclin-CdkCyclin-CdkBuddingYeastCLN1,2,3-CDC28CLB5,,(3,4)-CDC28CLB1,2(3,4)-CDC28FissionYeastCIG1-CDC2CIG2-CDC2CIG13-CDC2HigherEukaryotesCyclinD1,2,3-CDK4/6CyclinA-CDK2CyclinB-CDC2CyclinE1,2-CDK2G1SubstratesSSubstratesG2/MSubstratesGrowthandMorphogenesisDNAReplicationMitosis47M期周期蛋白的多泛素化（polyubiquitination）泛素依賴性途徑APC（AnaphasePromotingComplex）Cdc20和Mad2蛋白位于動粒上，在染色體結(jié)合有絲分裂紡錘體前將不能從動粒上釋放，由于Mad2與Cdc20結(jié)合而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結(jié)合后，APC才有活性，才啟動細(xì)胞向后期轉(zhuǎn)換。APC主要介導(dǎo)兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開始去凝集，核膜重建?！糁芷诩?xì)胞M-Cyclin的調(diào)控48細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)的阻遏

(細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)的負(fù)調(diào)控)◆細(xì)胞至少可通過兩種不同機制阻遏細(xì)胞周期的運轉(zhuǎn)：

Cdk抑制蛋白(CDKI)阻止Cyclin-Cdk復(fù)合物的裝配或活性；周期調(diào)控系統(tǒng)組分停止合成?！鬋DKI包括CIP/KIP家族和INK4家族，其作用是抑制Cyclin-Cdk復(fù)合物的裝配或活性，而將細(xì)胞阻止在不同的檢驗點。如DNA受損后，細(xì)胞將停留于G1Checkpoint讓DNA修復(fù)或者凋亡

◆周期調(diào)控系統(tǒng)組分停止合成，如G0細(xì)胞，大部分Cyclin和Cdk都消失，這在多細(xì)胞生物尤其明顯。495051ExperimentaldemonstrationofthecoordinatedSynthesisofDNAandhitones.52535455565758596061

.

MTbehaviorduringformationofthemetaphaseplate.Initially,MTfromoppositepolesaredifferentinlength.Experimentaldemonstrationoftheimportanceofmecha-nicaltensioninmetaphasecheckpointcontrol.626364656667686970a.ElectronmicrographofSCofhumanpachytenebivalent.

(K:kinetochore;arrow:recombinationnodules);

b.SchematicdiagramofSC;

c.ElectronmicrographofSCaftertreatmentwithDNasetoremovechromasomalfibers.71減數(shù)分裂前期I期間的不同階段中染色體聯(lián)會和去聯(lián)會的過程（引自Alberts,etal.，2002）（A）展示一個二價體。聯(lián)會發(fā)生在偶線期，消失在雙線期；（B）一個百合花的粗線期聯(lián)會電鏡圖。7273Visibleevidenceofcrossingover747576人M期細(xì)胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)PCC：提示M期細(xì)胞存在誘導(dǎo)PCC的因子；77處于第六期的爪蟾卵母細(xì)胞（RD前期I），具GV。

78（a）非洲爪蟾的卵母細(xì)胞發(fā)育至G2期時滯留達8個月之久，當(dāng)被雄蛙刺激后，雌蛙卵巢細(xì)胞分泌孕酮，刺激卵母細(xì)胞進入減數(shù)分裂期。當(dāng)?shù)竭_減數(shù)分裂中期II時，成為成熟的卵，并滯留在這個期，直到遇到精子完成受精，并開始卵裂。（b）用滯留在減數(shù)分裂中期II的成熟卵的胞質(zhì)，顯微注射到滯留在G2期的卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，即使沒有孕酮的刺激，也可以誘導(dǎo)后者進入減數(shù)分裂，并成為成熟的卵。從而證明M期胞質(zhì)中包含有活性因子——MPF。

798081CDK1的調(diào)節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase82838485

細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化是細(xì)胞增殖的重要生命活動之一。細(xì)胞能否成功地實現(xiàn)由G1期向S期轉(zhuǎn)化，標(biāo)志著該細(xì)胞能否復(fù)制其DNA和其他與細(xì)胞分裂有關(guān)的生物大分子，進而完成細(xì)胞分裂。細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化主要受G1期Cdk激酶所控制。在哺乳動物細(xì)胞中，G1期周期蛋白主要包括周期蛋白D、E和A。與G1期周期蛋白結(jié)合的Cdk激酶主要包括Cdk2、Cdk4和Cdk6等。周期蛋白D主要與Cdk4和Cdk6結(jié)合，而周期蛋白E則與Cdk2結(jié)合。周期蛋白A常常被劃分為M期周期蛋白，但周期蛋白A也可以與Cdk2結(jié)合而使后者表現(xiàn)激酶活性，提示周期蛋白A可能參與調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)化過程。（1）周期蛋白D的調(diào)控細(xì)胞在生長因子的刺激下，G1期周期蛋白D表達，并與Cdk4、Cdk6結(jié)合，形成周期蛋白D-Cdk4/6復(fù)合體，它們不能使組蛋白H1磷酸化。對周期蛋白D-Cdk激酶的底物還不很清楚，目前只知道Rb是它的底物之一。Rb是G1/S期轉(zhuǎn)化的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。在G1期的晚期階段，周期蛋白D-Cdk4/6通過磷酸化使Rb失活。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F可以促進許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和Cdk1的基因。86（2）周期蛋白E的調(diào)控周期蛋白E在G1期的晚期開始合成，并一直持續(xù)到細(xì)胞進入S期。當(dāng)細(xì)胞進入S期后，周期蛋白E很快即被降解。周期蛋白E與Cdk2結(jié)合成復(fù)合體，呈現(xiàn)Cdk2激酶活性。因此，周期蛋白E-Cdk2激酶活性峰值時間為G1期晚期到S期的早期階段。大量實驗證實，周期蛋白E-Cdk2激酶活性為S期啟動所必需。如用非洲爪蟾卵提取物進行細(xì)胞核重建和DNA復(fù)制實驗，如果事先將周期蛋白E從卵提取物中用免疫沉淀方法去除，重建的細(xì)胞核不能復(fù)制DNA。也有一些證據(jù)顯示，周期蛋白E在腫瘤細(xì)胞中的含量比在正常細(xì)胞中要高得多。在細(xì)胞中提高周期蛋白E的表達，該細(xì)胞則快速進入S期，而且對生長因子的依賴性降低。87（3）周期蛋白A的調(diào)控周期蛋白A也可以與Cdk2結(jié)合，形成周期蛋白A-Cdk2激酶。周期蛋白A的合成開始于Gl/S轉(zhuǎn)化時期。進入S期后，周期蛋白A-Cdk2激酶成為該時期主要的Cdk激酶。目前有實驗顯示周期蛋白A-Cdk2與DNA復(fù)制有關(guān)。到達S期的一定時期，G1期周期蛋白通過泛素化途徑降解，但與M期周期蛋白的降解有所不同。G1期周期蛋白的降解需要G1期Cdk激酶活性的參與以及特殊的E2和E3。G1期周期蛋白分子中不含有破壞框序列，而是含有PEST序列（脯-谷-絲-蘇氨酸序列）

。PEST序列對G1期周期蛋白降解起促進作用。88899091

泛素通過與泛素激活酶E1的半胱氨酸殘基在C-末端形成一個硫酯鍵而被激活。接著，泛素被從E1轉(zhuǎn)移到E2的半胱氨酸殘基上，E2被稱為泛素結(jié)合酶。然后，E2與泛素連接酶E3一起將泛素通過共價連接加到靶蛋白的賴氨酸殘基上，進行多泛素化。最后，被標(biāo)記的靶蛋白被蛋白酶體迅速降解。9293949596979899100芽殖酵母的研究

對芽殖酵母來說，允許溫度(permissivetemperature)常常位于20～23°C之間，限定溫度或非允許溫度(restrictivetemperatureornonpermissivetemperature)通常為35～37°C。突變體最基本的特點是，在允許溫度條件下，可以正常分裂繁殖，而在限定溫度條件下，則不能正常分裂繁殖。這種在限定溫度下失去正常分裂繁殖能力的現(xiàn)象，是由于某個基因發(fā)生突變而引起的。不同的突變體，發(fā)生突變的基因不同；在限定溫度下，細(xì)胞在細(xì)胞周期中所停留的時期以及細(xì)胞所表現(xiàn)出的形態(tài)結(jié)構(gòu)也常常是不同的。因而可以對不同突變體的基因變化和基因表達進行綜合分析。10120世紀(jì)60年代末，LelandHartwell已經(jīng)意識到利用遺傳學(xué)的方法研究細(xì)胞周期的可能性。開始以芽殖酵母作為實驗材料。在一系列實驗中，利用阻斷在不同細(xì)胞周期階段的溫度敏感突變株分離出了一百多個與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene，cdc)，包括芽殖酵母的cdc28基因。cdc28基因突變，芽殖酵母細(xì)胞停留在G1／S交界處，因此也叫起始點（start）。

cdc28基因突變成溫度敏感型時就不能出芽，這表明Cdc28蛋白對于進入S期非常關(guān)鍵。最初對cdc28基因的序列進行分析推測，Cdc28蛋白與已知的蛋白激酶同源。事實上，Cdc28蛋白也是第一個被分離的顯示有蛋白激酶活性的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白。分析發(fā)現(xiàn)cdc28基因與裂殖酵母cdc2基因高度同源，而Cdc28蛋白與Cdc2蛋白功能相似。最后證明它們都是Cdk激酶。10220世紀(jì)70年代中期，PaulNurse等以裂殖酵母為實驗材料，同樣發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞周期調(diào)控基因。裂殖酵母與芽殖酵母是遠(yuǎn)親，它們早在10億年前就開始分別進行各自的進化歷程。cdc2基因是裂殖酵母細(xì)胞中最重要的基因之一。cdc基因突變導(dǎo)致細(xì)胞停留在G2/M交界處。cdc2基因也是第一個被分離出來的cdc基因。Cdc2蛋白是一種相對分子質(zhì)量為34×103的蛋白，被表示為p34cdc2

。裂殖酵母的研究103另外，在芽殖酵母中cdc28基因是繼裂殖酵母cdc2基因之后，第二個被分離出來的cdc基因。Cdc28蛋白也是一種相對分子質(zhì)量為34×103的蛋白，表示為p34cdc28。p34cdc2和p34cdc28是的同源物，都是蛋白激酶，都在G2/M轉(zhuǎn)換過程中起著中心調(diào)節(jié)作用。同時，p34cdc28對G1/S轉(zhuǎn)換，也是必需的。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，不管是p34cdc2，或者是p34cdc28，其本身并不具有激酶活性，只有當(dāng)其與有關(guān)蛋白結(jié)合后，其激酶活性才能夠表現(xiàn)出來。例如，p34cdc2必須和另一種蛋白p56cdc13結(jié)合，才具有激酶活性。1041983年TimothyHunt以海膽卵為材料，對細(xì)胞周期調(diào)控進行著深入的研究。用海洋無脊椎動物和兩棲類的卵為實驗材料進行這類實驗，好處在于卵的量比較大，而且在胚胎發(fā)育的早期，細(xì)胞分裂是同步化的。他首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期進程變化而變化，在每一輪間期開始合成，G2/M時達到高峰，M結(jié)束后突然消失，下輪間期又重新合成，故命名為周期蛋白(cyclin)。隨后，這些周期蛋白很快便被分離和克隆出來，并被證明廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中。進一步研究證明，周期蛋白為誘導(dǎo)細(xì)胞進入M期所必需。而且，各種生物之間的周期蛋白在功能上有著廣泛的互補性。將海膽周期蛋白B的mRNA引入到非洲爪蟾卵非細(xì)胞體系中，其翻譯產(chǎn)物可以誘導(dǎo)該非細(xì)胞體系進行多次細(xì)胞周期循環(huán)。實驗結(jié)果提示周期蛋白可能參與MPF的功能調(diào)節(jié)。105

雖然MPF最早是從蛙的卵細(xì)胞定名的，但是在所有動物細(xì)胞的其它實驗中也發(fā)現(xiàn)了MPF，說明這種活性因子是普遍存在的。由于MPF的純化比較困難，所以對它的純化分離研究了很多年。直到1988年，JamesMaller實驗室的Lohka等人才用柱層析從非洲爪蟾卵中純化了MPF，經(jīng)鑒定含有p32和p45兩種蛋白。當(dāng)MPF的基本構(gòu)成被確認(rèn)以后，JamesMaller實驗室和PaulNurse實驗室立即開始合作，很快便證明MPF中的p32可以被p34cdc2特異抗體所識別，并且p34cdc2多肽片段可以增強MPF活性，表明兩者為同源物。接著JamesMaller實驗室和TimothyHunt實驗室開始合作，并很快證明MPF的另一種主要成分為周期蛋白B。序列分析證明，周期蛋白B與p45為同源物。至此，MPF的生化成分便被確定下來，它含有兩個不同亞基組成的異二聚體蛋白復(fù)合體，一個作為催化亞基Cdk，一個作為調(diào)控亞基周期蛋白。106MPF催化亞基Cdk分子只有與調(diào)控亞基周期蛋白結(jié)合后，才能表現(xiàn)出它的蛋白激酶活性，可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。所以MPF的活性是隨著細(xì)胞周期中周期蛋白濃度的變化而變化的。當(dāng)周期蛋白的濃度低時，Cdk分子由于缺少與之結(jié)合的底物而失去激酶活性。當(dāng)周期蛋白的濃度高時，Cdk分子被激活產(chǎn)生激酶活性，促使細(xì)胞進入有絲分裂。

107裂殖酵母PaulNurse芽殖酵母LelandHartwell

Genecdc2cdc28Proteinp34cdc2p34cdc28同源物p34cdc2+p56cdc13

有活性MPF=p32+p45（爪蟾）JamesMallerp32和p34cdc2同源物-----------p45和p56cdc13？？？海膽TimHunt：p45=cyclinB=p56cdc13◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependentproteinkinase)形成的復(fù)合物。MPF=p34cdc2+cyclinB108TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2001"fortheirdiscoveriesofkeyregulatorsofthecellcycle"2001年10月8日，由于美國人Leland

Hartwell、英國人PaulNurse和Timothy

Hunt在細(xì)胞周期調(diào)控機理研究領(lǐng)域中所做出的貢獻，而共同榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。109CDK

當(dāng)cdc2和cdc28基因分別被分離出來后，一些科學(xué)家便立即著手它們同源基因的分離工作。結(jié)果成功分離到了10多個cdc2相關(guān)基因。通過基因序列和蛋白質(zhì)功能分析，證明它們是cdc2同源基因。也有的不僅在序列方面與cdc2有一定差異，在蛋白質(zhì)功能方面也表現(xiàn)出一定的特殊性。但這些基因相應(yīng)的蛋白質(zhì)含有兩個共同的特點：一個是它們含有一段類似的氨基酸序列，另一個是它們都可以與周期蛋白結(jié)合，并將周期蛋白作為其調(diào)節(jié)亞基，進而表現(xiàn)出蛋白激酶活性。因而，它們被統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，Cdk)，簡稱Cdk。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名的Cdk包括Cdc2、Cdk2、Cdk3、Cdk4、Cdk5、Cdk6、Cdk7和Cdk8等。由于Cdc2第一個被發(fā)現(xiàn)，而其他幾個Cdk則是通過與其相比較而得來，因而Cdc2，被命名為Cdk1。不同的Cdk所要求結(jié)合的周期蛋白不同；在細(xì)胞周期中執(zhí)行的調(diào)節(jié)功能也不相同。各種Cdk分子都含有一段類似的Cdk激酶結(jié)構(gòu)域(Cdkkinasedomain)。與Cdkl相比，其他幾種Cdk激酶結(jié)構(gòu)域的保守程度有所不同。但是，在Cdk激酶結(jié)構(gòu)域中，有一小段序列則相當(dāng)保守，即PSTAIRE序列，此氨基酸序列意指：脯-絲-蘇-丙-異亮-精-谷。據(jù)認(rèn)為，此序列與周期蛋白結(jié)合有關(guān)。此外，也發(fā)現(xiàn)一些重要位點。對這些位點進行磷酸化修飾，將對Cdk激酶活性起重要調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞內(nèi)存在多種因子，對Cdk分子結(jié)構(gòu)進行修飾，參與Cdk激酶活性的調(diào)節(jié)。110

作為調(diào)控亞基周期蛋白不僅起激活Cdk的作用，而且還決定了Cdk激酶在何時、何處、將何種底物磷酸化，從而維持正常細(xì)胞周期的運行。至今已經(jīng)從各種生物體中克隆分離了數(shù)十種周期蛋白。這些周期蛋白在細(xì)胞周期內(nèi)表達的時期有所不同，所執(zhí)行的功能也多種多樣。

周期蛋白有的只在G1期表達并只在Gl期和S期轉(zhuǎn)化過程中執(zhí)行調(diào)節(jié)功能，所以常被稱為G1期周期蛋白；有的雖然在間期表達和積累，但到M期時才表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能，所以常被稱為M期周期蛋白。各種周期蛋白之間有著共同的分子結(jié)構(gòu)特點，但也各有特性。首先，它們均含有一段相當(dāng)保守的氨基酸序列，稱為周期蛋白框(cyclinbox)。周期蛋白框約含有100個左右的氨基酸殘基。周期蛋白框介導(dǎo)周期蛋白與Cdk結(jié)合。不同的周期蛋白框識別不同的Cdk，組成不同的周期蛋白-Cdk復(fù)合體，表現(xiàn)出不同的Cdk激酶活性。

M期周期蛋白的分子結(jié)構(gòu)含有另一個特點。在這些蛋白質(zhì)分子的近N端含有一段由9個氨基酸組成的特殊的序列，稱為破壞框(destructionbox)，RXXLGXIGX(X代表不完全保守氨基酸)。在破壞框之后，為一段約40個氨基酸組成的賴氨酸富集區(qū)。破壞框主要參與由泛素(ubiquitin)介導(dǎo)的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子中不含破壞框，但其C端含有一段特殊的PEST序列（脯-谷-絲-蘇氨酸序列）與其降解有關(guān)。111(a)所有M期周期蛋白靠近N-末端都有一個同源破壞框。非洲爪蟾三種M期周期蛋白破壞框中都包含著保守氨基酸殘基（Arg、Leu、Gly、Ile、Gly）；其它氨基酸殘基不完全保守。(b)晚后期，多個泛素分子被一個接一個地加到M期周期蛋白上靠近破壞框C端的賴氨酸殘基上。多泛素化后的M期周期蛋白被蛋白酶體迅速降解。112E3通常是一種多蛋白復(fù)合體，從非洲爪蟾卵中分離得到可以降解周期蛋白B的E3，至少含有15個不同的亞基?？梢詫期周期蛋白進行多泛素化的E3又被稱為后期促進復(fù)合體（anaphase-promotingcomplex，APC）。APC指導(dǎo)E2-泛素復(fù)合體到達M期周期蛋白的破壞框，然后激發(fā)泛素轉(zhuǎn)移到破壞框C-端側(cè)的一個賴氨酸殘基上。進一步的泛素化循環(huán)，結(jié)果形成可被蛋白酶體識別的多泛素鏈。通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建了不含破壞框的突變周期蛋白，不能被迅速降解。113TheNobelPrizeinChemistry2004"forthediscoveryofubiquitin-mediatedproteindegradation"AaronCiechanover

AvramHershko

IrwinRose

泛素被稱為蛋白質(zhì)的“死亡之吻”（“KissofDeath”）。

114

除G1期Cdk激酶活性之外，細(xì)胞內(nèi)還存在其他多種因素對DNA復(fù)制起始活動進行綜合調(diào)控。首先，DNA復(fù)制起始點（originsofreplication）的識別，是DNA復(fù)制調(diào)控中的重要事件之一。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從酵母細(xì)胞到高等哺乳類細(xì)胞，都包含有一種稱為起始點識別復(fù)合體(Originrecognitioncomplex，ORC)的蛋白質(zhì)。ORC含有6個亞單位，分別為ORCl~6。ORC識別DNA復(fù)制起始位點并與之結(jié)合，是DNA復(fù)制起始所必需的。其次，Cdc6和Cdc45也是DNA復(fù)制所必需的調(diào)控因子。如果將Cdc6和Cdc45去除，DNA就不能起始復(fù)制。115

在20世紀(jì)80年代末，提出了一種“DNA復(fù)制執(zhí)照因子學(xué)說”（DNAreplication-licensingfactortheory）。人們早巳知道，在整個細(xì)胞周期中DNA復(fù)制一次，而且只能一次。是什么因素控制細(xì)胞“在一個細(xì)胞周期中DNA復(fù)制一次，而且只能一次”呢？為此，JulianBlow和RonLaskey通過實驗提出，在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)存在一種執(zhí)照因子，對細(xì)胞核染色質(zhì)DNA復(fù)制“發(fā)執(zhí)照”(1icensing)。在M期，細(xì)胞核膜破裂，胞質(zhì)中的執(zhí)照因子與染色質(zhì)接觸并結(jié)合，使染色質(zhì)獲得DNA復(fù)制所必需的執(zhí)照。細(xì)胞通過G1期后進入S期，D