實驗八-凝膠過濾分離高鐵血紅蛋白與高鐵氰化鉀課件

實驗八

凝膠過濾分離高鐵血紅蛋白與高鐵氰化鉀實驗八

凝膠過濾分離高鐵血紅蛋白與高鐵氰化鉀了解凝膠層析的原理及應(yīng)用通過血紅蛋白脫鹽實驗，初步掌握凝膠層析技術(shù)實驗?zāi)康牧私饽z層析的原理及應(yīng)用實驗?zāi)康哪z過濾層析：

是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離，也稱分子篩層析、排阻層析實驗原理凝膠過濾層析：是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用

單個凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。交聯(lián)葡聚糖的凝膠顆粒單個凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不分子篩效應(yīng)：

大分子在前，小分子在后分子篩效應(yīng)：

高鐵血紅蛋白分子量大(MetHb，紅褐色，Mw=64500)，完全排阻Hb﹢K3Fe(CN)6MetHb

高鐵氰化鉀分子量小(K3Fe(CN)6，黃色，Mw=327.25)

，可完全進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，從而達(dá)到分離的目的

高鐵血紅蛋白分子量大(MetHb，紅褐色，Mw=6450交聯(lián)葡聚糖高鐵血紅蛋白與高鐵氰化鉀混合物高鐵血紅蛋白高鐵氰化鉀交聯(lián)葡聚糖高鐵血紅蛋白與高鐵氰化鉀混合物高鐵血紅蛋白高鐵氰化

利用特制的半透膜把大小分子分開的方法，截止分子量一般為一萬臨床應(yīng)用：血液透析

透析液濃縮的蛋白混合樣品透析袋開始透析處于平衡狀態(tài)透析法：利用特制的半透膜把大小分子分開的方法，截止分子量一般

鉬酸銨+氨基萘酚磺酸+磷酸鹽鉬藍(lán)（藍(lán)色）

15%三氯醋酸+蛋白質(zhì)變性、沉淀鉬酸銨鉬藍(lán)（藍(lán)色）15%三氯醋酸+蛋白質(zhì)變性、沉淀實驗器材與試劑

層析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力攪拌器

血紅蛋白溶液交聯(lián)葡聚糖G-25

0.4%K3Fe(CN)6

氨基萘酚磺酸試劑

鉬酸銨試劑

15%三氯醋酸0.1M磷酸緩沖液實驗器材與試劑層析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力攪拌器實驗步驟凝膠的處理G-25顆粒(5g)蒸餾水室溫溶脹去除雜質(zhì)10倍體積的蒸餾水浸泡(過夜)實驗步驟凝膠的處理G-25顆粒(5g)蒸餾水室溫溶脹去除雜裝柱固定在鐵架上加入緩沖液沒過砂芯將凝膠緩緩注入管內(nèi)自然沉降至柱床高度達(dá)20cm以上不可露出創(chuàng)面蓋濾紙層析管洗凈、排出管中氣泡關(guān)閉出口關(guān)閉出口打開出口裝柱固定在鐵架上加入緩沖液沒過砂芯將凝膠緩緩注入管內(nèi)自然沉裝柱要求:連續(xù)均勻無氣泡無分層床面平整裝柱要求:連續(xù)

層析柱穩(wěn)定后接儲液瓶，打開出口，用兩倍于床體積的緩沖液洗脫平衡(5-10min)，不可露出床面，關(guān)閉出口平衡層析柱穩(wěn)定后接儲液瓶，打開出口，用兩倍加樣準(zhǔn)備血紅蛋白(3滴)與K3Fe(CN)6(8滴)混合液自距床面1mm高處靠壁緩慢、均勻加入至液面降至與凝膠面相平放掉多余緩沖液至剛露出床面打開出口加樣準(zhǔn)備血紅蛋白(3滴)與K3Fe(CN)6(8滴)混合洗脫與收集至洗脫液剛好流入床面再加洗脫液至3-4cm高連接儲液瓶調(diào)節(jié)活塞（1滴/5秒）進(jìn)行洗脫緩慢加入樣品量體積的洗脫液（不沖破膠面）打開出口關(guān)閉出口收集紅褐色的MetHb色帶洗脫與收集至洗脫液剛好流入床面再加洗脫液至3-4cm高連接帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠用洗耳球從層析柱下口慢慢將柱中的凝膠吹至小燒杯中回收洗脫與收集將黃色的K3Fe(CN)6色帶完全洗脫后，用2~3倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠用洗耳球從層析柱下口慢慢將柱中的凝膠吹至小燒杯中回收洗脫與將MetHb洗脫液裝入透析袋將透析袋口用止水夾密封

打開磁力攪拌器，透析30分鐘

將透析袋懸入裝有蒸餾水的燒杯中透析將MetHb洗脫液裝入透析袋將透析袋口用止水夾密封打開磁力

磷酸鹽的鑒定試劑量鉬酸銨試劑氨基萘酚磺酸試劑反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)蒸餾水15滴2滴3滴？透析后杯內(nèi)蒸餾水10滴2滴3滴？鑒定磷酸鹽的鑒定試劑量鉬酸銨試劑氨基萘酚磺反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)

蛋白質(zhì)的鑒定試液量15%三氯醋酸反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)蒸餾水40滴20滴？透析后杯內(nèi)蒸餾水40滴20滴？透析袋內(nèi)溶液10滴5滴？蛋白質(zhì)的鑒定試液量15%三氯醋酸反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)蒸餾水4

裝柱后檢查凝膠是否均勻，若有氣泡或分層時，加入緩沖液攪動后靜置或者重新裝柱，保持柱床面平整；洗脫時流速不可太快或太慢；透析袋中的液體不可裝滿，否則會將透析袋脹破。注意事項裝柱后檢查凝膠是否均勻，若有氣泡或分層時，加入緩沖液攪動后磷酸鹽的鑒定試劑量鉬酸銨試劑氨基萘酚磺酸試劑反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)蒸餾水15滴2滴3滴透析后杯內(nèi)蒸餾水10滴2滴3滴無藍(lán)色實驗結(jié)果磷酸鹽的鑒定試劑量鉬酸銨試劑氨基萘酚磺酸試劑反應(yīng)結(jié)果透析

蛋白質(zhì)的鑒定試液量15%三氯醋酸反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)蒸餾水40滴20滴透析后杯內(nèi)蒸餾水40滴20滴透析袋內(nèi)溶液10滴5滴無無有沉淀蛋白質(zhì)的鑒定試液量15%三氯醋酸反應(yīng)結(jié)果透析前杯內(nèi)蒸餾水

MetHb的相對分子量較大，直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動，流程較短，移動速度快，首先流出MetHb的相對分子量較大，直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔

K3Fe(CN)6的相對分子質(zhì)量較小，直徑小于凝膠網(wǎng)孔可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中流程較長，移動速度慢，最后流出K3Fe(CN)6的相對分子質(zhì)量較小，直徑小于凝膠網(wǎng)孔可磷酸鹽是小分子，小于透析袋孔徑的小，能夠穿過透析袋；而蛋白質(zhì)是大分子，不能透過透析袋，只能保留在袋中磷酸鹽是小分子，小于透析袋孔徑的小，能夠穿過透析袋；而蛋向凝膠柱中加入樣品時，為什么必須保持膠面平整？上樣體積為什么不能太大？請解釋為什么在洗脫樣品時，流速不能太快或太慢？圓盤電泳的分子篩效應(yīng)和凝膠過濾的分子篩效應(yīng)原理上有何不同？