中藥制劑檢驗新技術(shù)課件

1、第六章 中藥制劑檢驗新技術(shù)目前，各種先進的分析技術(shù)和方法越來越多地用于中藥及其制劑，從而大大提高了藥品檢驗工作的質(zhì)量和水平。例如，指紋圖譜技術(shù)（FP）、毛細(xì)管電泳法（CE）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS）、原子吸收分光光度法（AAS）以及各種色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。其中有些已被中國藥典收載，成為法定的檢驗方法。本章將重點介紹指毛細(xì)管電泳法和超臨界流體色譜法。1第六章 中藥制劑檢驗新技術(shù)目前，各種先進的分析技術(shù)和方法 第一節(jié) 毛細(xì)管電泳法 （一）原理 毛細(xì)管電泳（CE）亦稱為高效毛細(xì)管電泳法（HPCE），是20 世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一類高效快速的分離分析方法。該法系以彈性 毛細(xì)管為分離通道，以高

2、壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分的 淌度（單位電場強度下的遷移速度）和分配行為的差異而實現(xiàn)分離，因此可將其視為經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。2 第一節(jié) 毛細(xì)管電泳法 CE分離原理圖示3CE分離原理圖示3（二）特點 高效、低耗、快速、廣譜 與HPLC比較1.柱效更高，理論板數(shù)可達(dá)105-106m-1，這主要是由于該法無固定相， 不存在傳質(zhì)差異，整個流體就像塞子似的以均速向前流動。2.分析速度更快，幾十秒至十幾分鐘內(nèi)即可完成一個試樣的分析。3.溶劑和樣品消耗極少，樣品用量僅為納升（nl）級。不需高壓泵輸液， 毛細(xì)管價格低廉，因此工作成本更低。4.通過改變操作模式和緩沖溶液的成分， 該

3、法有很大的選擇性，可對各種成分進 行有效的分離。例如，中性有機分子、 無機離子、蛋白質(zhì)等高分子化合物，甚 至整個細(xì)胞或病毒。HPLCCE4（二）特點 高效、低耗、快速、廣譜 與HPLC比較（三）分離模式（共6種） 1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） CZE又稱為自由溶液區(qū)帶電泳，系毛細(xì)管電泳中最基本、應(yīng)用最廣的一種操作模式，即將分析溶液引入毛細(xì)管進樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細(xì)管出口端，按陽離子、中性分子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。但中性組分彼此不能分離，因均隨電滲流（EOF）一起遷移。出峰時間稱為遷移時間（tm），相當(dāng)于高效液相色譜（HPLC）和氣相

4、色譜（GC）中的保留時間。CZE較適合帶電溶質(zhì)的分離，由于中性物質(zhì)均系靠電滲流遷移，不存在遷移速度的差異，故不能實現(xiàn)分離。5（三）分離模式（共6種） 1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） C2.膠束電動毛細(xì)管色譜（MEKC或MECC）該法系以膠束為假固定相的一種電動色譜。 當(dāng)操作緩沖液加入大于其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、膽酸等，這時表面活性劑就聚集形成膠束（假固定相），其親水端朝外，憎水非極性核朝內(nèi)，溶質(zhì)則在水和膠束兩相間分配，各溶質(zhì)因分配系數(shù)存在差別而被分離。對于常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS），進樣后極強親水性組分不能

5、進入SDS膠束，隨操作緩沖液流過檢測器（容量因子k=0）；極強憎水性組分則進入SDS膠束的核中不再回到水相，最后到達(dá)檢測器(k=)。其分離原理見下圖。62.膠束電動毛細(xì)管色譜（MEKC或MECC）該法系以膠束為假 該法適合中性物質(zhì)的分離。因不同的溶質(zhì)在膠束中的分配系數(shù)不同，其遷移速度存在差異而實現(xiàn)分離。MECC彌補了CZE不能分離中性物質(zhì)的不足，進一步拓寬了毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍，鑒于中藥多數(shù)為離子型和中性物質(zhì)的混合體，因此MECC更適合于中藥分析。7 該法適合中性物質(zhì)的分離。因不同的溶質(zhì)在膠束中的分配系數(shù)3.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE） 該法在毛細(xì)管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠，該方法主

6、要用于分析蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子。另外還可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進行分析，稱為毛細(xì)管無膠篩分。有時將它們統(tǒng)稱為毛細(xì)管篩分電泳，下分為凝膠電泳和無膠篩分兩類。83.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）84.毛細(xì)管等速電泳（CITP） 該法采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細(xì)管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移到各個狹窄的區(qū)帶，然后依次通過檢測器。94.毛細(xì)管等速電泳（CITP）95.毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF） 將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后，毛細(xì)管中的操作電解質(zhì)溶液

7、逐漸形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自等電點（PI）時變?yōu)橹行?，形成聚焦的區(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值的辦法使溶質(zhì)通過檢測器。105.毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF）106.毛細(xì)管電色譜（CEC）該法是在毛細(xì)管電泳技術(shù)不斷發(fā)展和液相色譜理論日益完善的基礎(chǔ)上逐漸興起的。它是將細(xì)粒徑固定相填充到毛細(xì)管中或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲流驅(qū)動操作緩沖液（有時再加輔助壓力）進行分離的，包含了色譜和電泳兩種機制，其中以色譜為主，但對荷電溶質(zhì)兼有電泳作用。 該法克服了CE選擇性差和分離中性物質(zhì)困難的缺點，同時提高了液相色譜的分離效率，形成其獨特的高效、微量、快捷的特點，開辟了高效微

8、柱分離技術(shù)的新途徑。116.毛細(xì)管電色譜（CEC）該法是在毛細(xì)管電泳技術(shù)不斷發(fā)展二、儀器設(shè)備 （一）毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)（見下圖） 1.電極槽和進樣系統(tǒng) 2.清洗系統(tǒng) 3.毛細(xì)管 4.檢測器 5.鉑電極 6.電極槽 7.恒溫系統(tǒng) 8.記錄和數(shù)據(jù)處理12二、儀器設(shè)備 （一）毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)（見下圖）12 （二）主要部件及其性能 1.毛細(xì)管毛細(xì)管為彈性石英毛細(xì)管。內(nèi)徑50m和75m兩種使用較多，內(nèi)徑細(xì)的分離效果較好，但柱上檢測因光程較短，檢測限比內(nèi)徑粗的要差。毛細(xì)管長度稱為總長度，根據(jù)分離度的要求，可選用20100cm長度，進樣端至檢測器間的長度稱為有效長度。毛細(xì)管常盤放在管架上，在一定溫

9、度下操作，以控制焦耳熱，操作緩沖液的黏度和電導(dǎo)度，對測定的重復(fù)性很重要。 13 （二）主要部件及其性能 1.毛細(xì)管13 2.直流高壓電源 一般采用0-30kV（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約300A電流，具有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。 3.電極和電極槽 兩個電極槽里放入操作緩沖液，分別插入毛細(xì)管的進口端與出口端以及鉑電極，鉑電極接至直流高壓電源，正負(fù)極可切換。多種型號的儀器將樣品瓶同時用做電極槽。14 2.直流高壓電源 一般采用0-30kV（或相 4.沖洗進樣系統(tǒng) 每次進樣之前毛細(xì)管要用不同的溶液沖洗，選用自動沖洗進樣儀器較為方便。進樣方法有壓力進樣、負(fù)壓進樣、虹吸進樣和電動進樣等。進樣時

10、通過控制壓力、電壓或時間來控制進樣量。 5.檢測器 紫外檢測器，熒光檢測器，電化學(xué)檢測器，質(zhì)譜儀等均可作為CE的檢測器。其中紫外檢測器應(yīng)用最廣，它是將毛細(xì)管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)ゼs2mm一段，使石英管壁裸露，毛細(xì)管兩側(cè)各放置一個石英聚光球，使光源聚焦在毛細(xì)管上，透過毛細(xì)管到達(dá)光電池對溶質(zhì)進行檢測。 15 4.沖洗進樣系統(tǒng) 每次進樣之前毛細(xì)管要用不同的溶液沖1.檢測窗口2.毛細(xì)管3.基座4.調(diào)焦機構(gòu)5.圓形狹縫6.狹縫7.球透鏡photo沖洗裝置樣品瓶毛細(xì)管UVD電極槽電極槽161.檢測窗口2.毛細(xì)管3.基座4.調(diào)焦機構(gòu)5.圓形狹縫6.狹6.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與一般色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本相同。176

11、.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與一般色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本相同。17三、基本操作（一）準(zhǔn)備工作 1. 按照儀器操作手冊開機，預(yù)熱，輸入各項參數(shù)，如毛細(xì)管溫度、操作電壓、檢測波長、沖洗程序等。 2. 按照各品種項下的規(guī)定配制操作緩沖液。操作緩沖液須過濾和脫氣。沖洗液、緩沖液等放置于樣品瓶中，依次放入進樣器。操作緩沖液的種類、pH值和濃度，以及添加劑（用以增加溶質(zhì)的溶解度和/或控制溶質(zhì)的解離度，手性拆分等）的選定對測定結(jié)果的影響很大，應(yīng)根據(jù)初試的結(jié)進行果調(diào)整、優(yōu)化。18三、基本操作（一）準(zhǔn)備工作18四、系統(tǒng)適用性試驗 目的在于考察所配置的毛細(xì)管分析系統(tǒng)和設(shè)定的參數(shù)是否適用。測試項目和方法與高效液相色譜法或氣相色譜法

12、相同，相關(guān)的計算式和要求也相同。如重復(fù)性（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD）、容量因子（k）、毛細(xì)管理論數(shù)（n）、分離度（R）、拖尾因子（T）、線性范圍、最低檢測限（LOD）等，最低定量限（LOQ）等，可參照測定。 具體指標(biāo)應(yīng)符合各品種項下的規(guī)定。特別是進樣精度，不同荷電溶質(zhì)遷移速度的差異對分析精密度的影響。19四、系統(tǒng)適用性試驗 目的在于考察所配置的毛細(xì)管分析系統(tǒng)和設(shè)（二）毛細(xì)管的處理毛細(xì)管處理的好壞對測定結(jié)果影響很大。 未涂層新毛細(xì)管要用較濃堿液在較高溫度（例如1mol/L氫氧化鈉液在60）沖洗，使毛細(xì)管內(nèi)壁生成硅羥基，再依次0.1mol/L氫氧化鈉，水，操作緩沖液沖洗分?jǐn)?shù)分鐘。兩次進樣中間可僅用緩沖

13、液沖洗，但若發(fā)現(xiàn)分離性能改變，則開始用0.1mol/L氫氧化鈉沖洗，甚至要用濃氫氧化鈉液升溫沖洗。 凝膠毛細(xì)管，涂層毛細(xì)管，填充毛細(xì)管的沖洗則應(yīng)按照所附說明操作。 沖洗時將盛溶液樣品瓶依次置于進樣器，設(shè)定順序和時間進行。20（二）毛細(xì)管的處理毛細(xì)管處理的好壞對測定結(jié)果影響很大。20（三）進樣測試 將待測樣品溶液瓶置于進樣器中，設(shè)定操作參數(shù)，如進樣壓力（電動進樣電壓）、進樣時間、正極端或負(fù)極端進樣、操作電壓或電流、檢測器參數(shù)等，開始分析。根據(jù)初試的電泳譜圖調(diào)整儀器和操作緩沖液以獲得優(yōu)化結(jié)果。而后用優(yōu)化條件正式分析。21（三）進樣測試 將待測樣品溶液瓶置于進樣器中，設(shè)定操作參數(shù)，（四）數(shù)據(jù)處理 有

14、關(guān)CE的計算方法、公式等可參照中國藥典高效液相色譜法的有關(guān)規(guī)定，將保留時間（tR）改為遷移時間(tm)即可。22（四）數(shù)據(jù)處理 有關(guān)CE的計算方法、公式等可（五）結(jié)束工作 分析完成后用水沖洗毛細(xì)管，注意將毛細(xì)管兩端浸入水中保存，如果長久不用應(yīng)將毛細(xì)管用氮吹干，最后關(guān)機。23（五）結(jié)束工作 分析完成后用水沖洗毛細(xì)管，注（六）注意事項由于進樣方法的限制，目前毛細(xì)管電泳的精密度比用定量閥進樣的高效液相色譜法差，故定量測定以采用內(nèi)標(biāo)法為宜。 用加壓或減壓法進樣時，樣品溶液黏度會影響進樣體積，應(yīng)注意保持試樣溶液和對照品溶液黏度一致； 用電動法進樣時，被測組分因電荷不同的電歧視現(xiàn)象和溶液離子強度會影響待測

15、組分的遷移量，也要注意其影響。24（六）注意事項由于進樣方法的限制，目前毛細(xì)管電泳的精密度比用五、應(yīng)用實例山茱萸及六味地黃丸中沒食子酸的含量測定 沒食子酸為中藥山茱萸的有效成分，山茱萸為六味地黃丸藥味之一。沒食子酸在堿水中可電離成陰離子，故本法采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CZE），肉桂酸為內(nèi)標(biāo)物，測定二者中沒食子酸的含量，以控制其質(zhì)量。沒食子酸肉桂酸25五、應(yīng)用實例山茱萸及六味地黃丸中沒食子酸的含量測定 沒食（一）儀器與試劑 Unimicro毛細(xì)管電泳儀；毛細(xì)管60cm（有效長度45cm）75m；沒食子酸對照品，肉桂酸對照品，95%乙醇， 硼砂（分析純），去離子水，市售山茱萸，六味地黃丸（水蜜丸）2

16、6（一）儀器與試劑 Unimicro毛細(xì)管電泳儀；毛細(xì)（二）實驗條件 操作緩沖溶液為20mmol/L硼砂溶液，檢測波長271nm，重力進樣（10cm5s），工作電壓20kV，電泳溫度20，每次運行前依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、去離子水、操作緩沖溶液沖洗3min。27（二）實驗條件 操作緩沖溶液為20mmol/L硼砂溶液，檢測（三）測試溶液的制備對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品19.5mg于25ml量瓶中，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液；稱取肉桂酸對照品9.6mg，用95%乙醇溶解并稀釋至25ml，作為內(nèi)標(biāo)溶液。山茱萸供試品溶液的制備 將山茱萸藥材剪碎，稱取5g，加

17、95%乙醇50ml，浸泡12小時，加熱回流提取2小時，過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并提取液，減壓濃縮至10ml，移至50ml量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml并加入內(nèi)標(biāo)溶液1ml，95%乙醇稀釋定容至5ml，搖勻，即得。六味地黃丸供試品溶液的制備 取六味地黃丸粉碎后，稱取5g，提取方法同山茱萸藥材，減壓濃至10ml，以下操作同山茱萸供試品溶液的制備，即得。28（三）測試溶液的制備對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對（四）系統(tǒng)適用性試驗 在山茱萸的測定中，沒食子酸的理論板數(shù)n=179820，在六味地黃丸的測定中，沒食子酸的理論板數(shù)n=167388，沒食子酸與周圍組分分離良好，無干

18、擾組分存在。下圖為山茱萸、六味地黃丸樣品和對照品的電泳圖譜。29（四）系統(tǒng)適用性試驗29 山茱萸（A）、六味地黃丸（B）和對照品（C）的電泳圖譜 （1.肉桂酸；2.沒食子酸）30 山茱萸（A）、六味地黃丸（B）和對照品（C）的電泳圖譜 （五）方法學(xué)考察線性范圍 精密量取沒食子酸對照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml于5ml量瓶中，各加入肉桂酸內(nèi)標(biāo)液1ml，95%乙醇定容至刻度，以沒食子酸對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對其質(zhì)量濃度作圖，其線性回歸方程為 Y=0.0167X+0.1333，相關(guān)系數(shù)r=0.9993（n=7）。 精密度 山茱萸和

19、六味地黃丸峰面積的RSD分別為2.9%和2.1%（n=5）準(zhǔn)確度 山茱萸和六味地黃丸加樣回收率分別為97.4% 98.6%和99.3%102.4%。31 （五）方法學(xué)考察線性范圍 精密量取沒食子酸對照品溶液（六）樣品中沒食子酸的含量測定 取山茱萸供試品溶液和六味地黃丸供試品溶液分別測定，山茱萸中沒食子酸含量為0.225%；六味地黃丸中沒食子酸的含量為0.055%。32（六）樣品中沒食子酸的含量測定 取山茱萸供試品溶液和六第二節(jié) 超臨界流體色譜法超臨界流體色譜(supercrical fluid chromatography,SFC)是以超臨界流體作為流動相的色譜方法，是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展

20、迅速的一個色譜分支。所謂超臨界流體，是指在高于臨界壓力和臨界溫度時的一種物質(zhì)狀態(tài)。它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴散系數(shù)等特性。33第二節(jié) 超臨界流體色譜法超臨界流體色譜(supercric一、超臨界流體色譜的特點與原理principle and character of supercritical fluid chromatography1超臨界流體的特性。對于某些純物質(zhì)來說，具有三相點和臨界點，如圖所示，從圖中可以看出，物質(zhì)在三相點，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)處于臨界溫度和臨界壓力以上時，則不論施加多大壓力，氣體也不會液化，此時即非

21、氣體，也非液體，而是以超臨界流體形式存在。34一、超臨界流體色譜的特點與原理principle and 超臨界流體對于分離具有極其有用的物理性質(zhì)，這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。表對氣體、液體、和超臨界流體的有關(guān)物理性質(zhì)進行了比較。 表 氣體、液體、超臨界流體物理性質(zhì)的比較流動相密度（g/ml）擴散系數(shù)（cm2/s）粘度（g/cm.s）氣體超臨界流體液體約10-30.2-0.90.8-1.01-10-210-3-10-410-510-410-4-10-310-235 超臨界流體對于分離具有極其有用的物理性質(zhì)，這些性2.原理 SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固

22、體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離； 通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；362.原理 SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）； 超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對分離的影響??； 壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增

23、加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。 CO2流動相，當(dāng)壓力改變：7.09.0106 Pa，則： C16H34的保留時間 25min 5min。37壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對程序升壓38程序升壓38HPLC與SFC比較39HPLC與SFC比較39與GC法和HPLC法比較,因超臨界流體的粘度接近于氣相色譜的流動相,對溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以使用更高的流速洗脫，因此SFC的分離速度快于HPLC而與GC相當(dāng)；超臨界流體的擴散率介于GC和LC之間，因而峰展寬小于在氣體中。 SFC中的流動相不是惰性的傳輸介質(zhì)，這不同于GC而與LC一樣，溶質(zhì)與流動相間有相互作用，利用此點可調(diào)控選擇因子

24、當(dāng)考慮溶質(zhì)分壓時，也可利用SFC的兩重性，即被測物質(zhì)在超臨界流體中的溶解性非常接近其揮發(fā)性，而發(fā)生溫度卻較低，因此，在一定壓力下，超臨界流體溶解的分子的分壓比在氣體中高幾個數(shù)量級，這就可以實現(xiàn)對大分子、熱不穩(wěn)定性化合物、 高聚物等的有效分離。40與GC法和HPLC法比較,因超臨界流體的粘度接近于氣相色譜的二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)與流程（SFC）1.結(jié)構(gòu)流程 41二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)與流程（SFC）1.結(jié)構(gòu)流程 2.主要部件（1）SFC的高壓泵 無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量； （2）SFC的色譜柱和固定相 可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱；

25、 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；422.主要部件（1）SFC的高壓泵42色譜柱填充柱填充柱與HPLC柱相似，基于分配平衡實現(xiàn)分離，柱長可達(dá)25cm，分離柱內(nèi)徑0.5-4.6mm。使用粒徑為3-10m的填料填充。如硅膠、-NH2、-CN及C18、C8等化學(xué)鍵合相均可用于SFC。其中以極性填料的分離效果更好。SFC在手性化合物的分離上效果優(yōu)于HPLC。在實際操作中，往往會因壓力變化而產(chǎn)生較大的柱壓降，使柱入、出口處的保留時間有很大差異，所以一般采用高于超臨界壓力20%左右的壓力以減小影響。在填料的選擇上也要注意與所分析的樣品相適應(yīng)，如

26、分析極性或堿性化合物時，填料覆蓋度小，會產(chǎn)生不對稱峰。若使用“封端”填料則會得到改善。43色譜柱43填充柱在重現(xiàn)性、載樣量等方面要優(yōu)于毛細(xì)管柱，操作簡便，也有用微填充柱的，將3-10m的填料填充到內(nèi)徑幾個毫米或更小的毛細(xì)管柱中。毛細(xì)管柱較長用的填充毛細(xì)管柱內(nèi)徑0.5mm，柱長為10-30mm；開管毛細(xì)管柱主要是內(nèi)徑為50-100m化學(xué)交連的各種硅氧烷柱或其它類型的交連柱。SFC色譜柱必須借助柱箱以實現(xiàn)精確的溫度控制，范圍可以從室溫至450C，同時配低溫控制系統(tǒng)，可在-50以下工作。44填充柱在重現(xiàn)性、載樣量等方面要優(yōu)于毛細(xì)管柱，操作簡便，也有用主要部件（3）流動相 SFC的流動相：超臨界流體；

27、CO2、N2O、NH3 CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測器 可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器45主要部件（3）流動相45使用氣相色譜檢測器，以FID為多用，應(yīng)用時可將色譜柱的流出物分流，部分流出物通過限流器變?yōu)闅鈶B(tài)進入檢測器，若用FID檢測時，流動相中不能加入改進劑，否則改進劑本身將給出信號干擾測定，F(xiàn)ID對小分子量化合物可得到很好的結(jié)果，對分子量大的化合物常得不到單峰，而是一簇峰。如把檢測器加熱可使分子量大于2000的化合物獲得滿意的分離。在SFC中也可以使用氮磷檢測器（NPD）

28、、火焰光度檢測器（FPD）等。46使用氣相色譜檢測器，以FID為多用，應(yīng)用時可將色譜柱的流出使用液相色譜檢測器。在進入檢測器之前應(yīng)將超臨界狀態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)，可增加檢測的靈敏度，使譜帶變窄，而且可以在室溫下操作，UVD是用改性劑流動相的填充柱SFC的最常用的檢測方法。要求檢測器必須耐高壓。如使用毛細(xì)管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛細(xì)管構(gòu)成，內(nèi)容積在200nl左右，這樣不會影響柱效；熒光檢測器（FD）也可以如此應(yīng)用。對于填充柱，蒸發(fā)光散射檢測器也是一種常用的通用檢測器。47使用液相色譜檢測器。在進入檢測器之前應(yīng)將超臨界狀態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)三、超臨界流體色譜的流動相和改性劑（一）流動相SFC的流動相為超臨

29、界流體。超臨界流體的主要特點是在不同壓力下對各種樣品有不同的溶解能力。其溶解度隨超臨界流體密度的增加而增加。當(dāng)兩組分的溶解度常數(shù)越接近時，其互溶性就越好。有人研究認(rèn)為，幾種常用的超臨界流體的溶解能力在相同的壓力條件下順序是乙烷二氧化碳氧化亞氮三氟甲烷，在相同條件下其分離能力是：二氧化碳氧化亞氮三氟甲烷乙烷。對于SFC流動相的選擇應(yīng)綜合考慮。除溶解性能外，還要與檢測器相適應(yīng)，CO2是最常用的流動相。其臨界溫度低、壓力適中，容易操作，相對便宜，無毒無嗅，安全性好，且在190nm以上無紫外吸收。48三、超臨界流體色譜的流動相和改性劑48 在SFC中，弱極性或非極性超臨界流體流動相如CO2，對于一些極

30、性化合物的溶解能力較差。為了加強其對極性溶質(zhì)的溶解和洗脫能力，常常向其中加入一定比例的極性溶劑稱為改性劑，加入的量一般為1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分適于二氧化碳的改性劑及應(yīng)用特性。（二）改性劑49（二）改性劑49 表 常用CO2改性劑CO2改性劑檢測方法CO2改性劑檢測方法甲醇UVD MS FIDC（用量應(yīng)少于1%）脂肪二甲基亞砜乙二氧甲烷UVUV UV MSUV MS脂肪醇UV MS甲醇UV MS FID四氫呋喃UV MS 二氧化碳UV MS FID2- 基乙醇UV 水UV MS FID在分離酸性或堿性化合物時，也可以向CO2流動相中加入酸或堿，使其峰形變銳。50 表 常用CO2改性劑檢測方法CO2改性劑檢測方法甲醇U四、應(yīng)用與示例超臨界流體色譜法已被廣泛應(yīng)用于天然物，藥物，表面活性劑，高聚物，農(nóng)藥，炸藥，火箭推進劑等物質(zhì)的分離與分析.1.超臨界流體色譜法測定懷牛膝制劑中齊墩果酸的含量牛膝制劑中含有的齊墩果酸不易揮發(fā)，且含有羥基、羥基等相性基團，用GC法測定須衍生化處理后，才能測定，又因其結(jié)構(gòu)中無發(fā)色團，本自無紫外吸收，也不易被激發(fā)產(chǎn)生熒光，若用HJPLC測定無法用常規(guī)檢測器檢測，而用SFC可直接