醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)院炭疽診斷

1、 醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)院炭疽診斷范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了炭疽的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于全國(guó)各級(jí)各類(lèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)及其醫(yī)務(wù)人員對(duì)炭疽的診斷。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求衛(wèi)健委可感染人類(lèi)的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定衛(wèi)健委人間傳染的病原微生物名錄術(shù)語(yǔ)和定義炭疽 anthrax 是由炭疽芽胞桿菌引起的一種人獸共患急性傳染病，主要為食草動(dòng)物（牛、羊、馬等）的傳染病。人主要通過(guò)接觸患炭疽的動(dòng)物或污染的動(dòng)物

2、制品、環(huán)境獲得感染而患病。主要表現(xiàn)為皮膚炭疽，少數(shù)為肺炭疽和腸炭疽，可以繼發(fā)敗血癥及腦膜炎。除皮膚炭疽病死率較低外，其他各型炭疽的病死率均較高。診斷依據(jù)流行病學(xué)史發(fā)病前14 d以內(nèi)，接觸過(guò)疑似炭疽的病、死動(dòng)物或其殘??；食用過(guò)疑似炭疽的病、死動(dòng)物肉類(lèi)或其制品；吸入可疑炭疽芽胞桿菌污染的粉塵；從事與毛皮等畜產(chǎn)品密切接觸或與炭疽芽胞桿菌研究、使用相關(guān)的職業(yè)；在可能被炭疽芽胞污染的地區(qū)從事養(yǎng)殖、放牧、耕耘或挖掘等活動(dòng)。生活在證實(shí)存在炭疽的地區(qū)內(nèi)或在發(fā)病前14 d內(nèi)到達(dá)過(guò)該類(lèi)地區(qū)。臨床表現(xiàn)及分型皮膚炭疽在手、前臂、面、頸等暴露部位的局部皮膚出現(xiàn)不明原因的斑疹、丘疹、水皰，周?chē)M織腫脹及浸潤(rùn)，繼而中央壞死

3、形成潰瘍性黑色焦痂，焦痂周?chē)つw發(fā)紅，腫脹，疼痛不顯著，稍有癢感。典型皮膚損害表現(xiàn)為具有黑痂的淺潰瘍，周邊有小水皰，附近組織較為廣泛的非凹陷性水腫。除皮損外，患者多出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)痛、全身不適以及局部淋巴結(jié)和脾腫大等癥狀和體征。少數(shù)嚴(yán)重病例，局部呈大片水腫和壞死。腸炭疽發(fā)熱，腹脹，腹部劇烈疼痛，腹瀉，通常為血樣便或血水樣便?？捎袗盒摹I吐，嘔吐物中可含血絲及膽汁?？砂橛邢酪酝獍Y狀和體征。肺炭疽高熱，呼吸困難，可有胸痛及咳嗽，咳極黏稠血痰。肺部體征常只有散在的細(xì)濕羅音。胸部X線的主要表現(xiàn)為縱隔影增寬，胸腔積液。腦膜炎型炭疽劇烈頭痛，嘔吐，頸項(xiàng)強(qiáng)直，繼而出現(xiàn)譫妄、昏迷、呼吸衰竭，腦脊液多為

4、血性。多繼發(fā)于4.2.14.2.3，也可能直接發(fā)生。敗血癥型炭疽高熱、寒戰(zhàn)，感染性休克與彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）表現(xiàn)，皮膚出現(xiàn)出血點(diǎn)或大片淤斑，腔道出血，迅速出現(xiàn)呼吸與循環(huán)衰竭。多繼發(fā)于4.2.14.2.3，也可能直接發(fā)生。實(shí)驗(yàn)室檢查來(lái)自于患者或尸體的標(biāo)本中，細(xì)菌分離培養(yǎng)獲得炭疽芽胞桿菌（見(jiàn)附錄A、附錄B）?；颊唠p份血清抗炭疽特異性抗體出現(xiàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上升高（見(jiàn)附錄C）。來(lái)自于患者或尸體的標(biāo)本中，顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)大量?jī)啥似烬R呈串聯(lián)狀排列的革蘭陽(yáng)性大桿菌。來(lái)自于患者或尸體的標(biāo)本中，炭疽芽胞桿菌特異性核酸片段檢測(cè)陽(yáng)性（見(jiàn)附錄D）。免疫層析法檢測(cè)患者臨床標(biāo)本炭疽芽胞桿菌抗原或抗體陽(yáng)性（

5、見(jiàn)附錄E）。暴露動(dòng)物標(biāo)本或暴露環(huán)境標(biāo)本中分離到炭疽芽胞桿菌。診斷原則根據(jù)流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查等進(jìn)行診斷。診斷疑似病例具有4.1中的任何一條，并具有4.2.14.2.5的臨床表現(xiàn)之一者。臨床診斷病例符合下列一項(xiàng)可診斷為臨床診斷病例：疑似病例，并具有4.3.34.3.6中任何1項(xiàng)者。具有明確的流行病學(xué)史，并具有典型的皮膚損害者。確診病例符合下列一項(xiàng)可診斷為確診病例：疑似病例或臨床診斷病例，并具備4.3.1或4.3.2中任何1項(xiàng)者。疑似病例或臨床診斷病例，并具備4.3.34.3.6中任何2項(xiàng)者。鑒別診斷皮膚炭疽炭疽病灶早期有明顯水腫，有癢無(wú)痛，并不化膿?？膳c癤、蜂窩織炎、恙蟲(chóng)病的焦痂、羊

6、痘、鼻疽、鼠疫、土拉熱、丹毒、梅毒硬下疳、膿性潰瘍相鑒別?；颊叩穆殬I(yè)和病畜接觸史可供參考。腸炭疽腸炭疽早期應(yīng)與食物中毒、出血性壞死性腸炎、痢疾、急腹癥相鑒別。肺炭疽肺炭疽黏性血痰與大葉性肺炎之泡沫狀鐵銹色痰相鑒別，并與肺鼠疫、鉤端螺旋體病肺彌漫性出血型相鑒別。胸膜炎的積液為血性黏稠液。（規(guī)范性附錄）炭疽標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸患者標(biāo)本的采集采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)遵循的原則盡可能在抗生素治療開(kāi)始前采集標(biāo)本。除必要時(shí)并在具備操作條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，不得用解剖的方式獲取標(biāo)本。所需的血液與組織標(biāo)本，均應(yīng)以穿刺方式取得。血液標(biāo)本所有疑似病例，都應(yīng)無(wú)菌操作采集血液標(biāo)本5 mL，用于顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原和核酸檢測(cè)，并留取血

7、清做抗體檢測(cè)。首份血清標(biāo)本應(yīng)在急性期（發(fā)病14 d內(nèi)）采集，采集7 d后應(yīng)再次采集血液標(biāo)本5 mL，留取恢復(fù)期血清做抗體檢測(cè)。皮膚病灶標(biāo)本在水皰期，用兩根無(wú)菌棉簽蘸取水皰液；在潰瘍期，用兩根生理鹽水濕潤(rùn)的無(wú)菌棉簽在皮損處涂抹；在焦痂期，用兩根生理鹽水濕潤(rùn)的無(wú)菌棉簽在焦痂處反復(fù)涂抹。標(biāo)本用于顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原和核酸檢測(cè)。糞便與嘔吐物標(biāo)本表現(xiàn)消化道癥狀的疑似病例收集糞便或嘔吐物標(biāo)本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無(wú)菌容器中。標(biāo)本用于顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原和核酸檢測(cè)。痰標(biāo)本表現(xiàn)為呼吸道癥狀的疑似病例收集其痰液標(biāo)本，用于顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原和核酸檢測(cè)。腦脊液標(biāo)本表現(xiàn)腦膜刺激癥狀的疑似病例，腰

8、椎穿刺獲取腦脊液，標(biāo)本量1 mL2 mL。用于顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原和核酸檢測(cè)。尸體標(biāo)本死亡病例可通過(guò)穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實(shí)質(zhì)性臟器獲得組織標(biāo)本。用于顯微鏡檢查、培養(yǎng)、抗原和核酸檢測(cè)。動(dòng)物標(biāo)本及環(huán)境標(biāo)本的采集可獲得的動(dòng)物組織標(biāo)本血液、肉類(lèi)、內(nèi)臟等，視具體情況采集，用于培養(yǎng)。環(huán)境標(biāo)本采集病死動(dòng)物血液污染的土壤、水、其他物品等，用于培養(yǎng)。標(biāo)本采集生物安全要求標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)采取傳染病二級(jí)防護(hù)措施，使用醫(yī)用防護(hù)口罩、醫(yī)用乳膠手套、工作帽、醫(yī)用防護(hù)服、防護(hù)鞋，必要時(shí)佩戴防護(hù)眼罩/面罩。標(biāo)本保存要求用于培養(yǎng)和核酸檢測(cè)的標(biāo)本于28冷藏保存，低溫運(yùn)輸。用于血清抗體檢測(cè)的血清標(biāo)本于-20 以下冷凍保存，保

9、持冷凍運(yùn)輸。運(yùn)輸要求標(biāo)本或菌株運(yùn)輸應(yīng)按照衛(wèi)健委可感染人類(lèi)的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定執(zhí)行。運(yùn)輸包裝按國(guó)際民航組織文件Doc9284危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則的要求，炭疽芽胞桿菌菌株或活菌培養(yǎng)物，應(yīng)按UN2814的要求包裝和空運(yùn)，其他相關(guān)樣本均按UN3373的要求包裝和空運(yùn)；通過(guò)其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。（規(guī)范性附錄）炭疽細(xì)菌學(xué)檢查生物安全要求應(yīng)按照GB 19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求和衛(wèi)健委人間感染的病原微生物名錄要求執(zhí)行。顯微鏡檢查所有來(lái)自患者或尸體的標(biāo)本，都應(yīng)首先立即涂片，革蘭染色，進(jìn)行顯微鏡檢查。如發(fā)現(xiàn)大量?jī)啥似烬R的革蘭陽(yáng)性大桿菌，即可作為診斷依據(jù)。細(xì)菌

10、分離培養(yǎng)標(biāo)本處理皮膚病灶標(biāo)本、血液、腦脊液、痰液、尸檢標(biāo)本、動(dòng)物組織等標(biāo)本直接涂布血平板或營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，血液標(biāo)本也可直接接種血培養(yǎng)瓶。環(huán)境標(biāo)本、糞便及嘔吐物標(biāo)本，用兩倍量蒸餾水或生理鹽水制成懸液，經(jīng)自然沉淀除去粗大顆粒物后，所得的懸液取1 mL于65加熱15 min20 min后，取100 L200 L涂布平板。挑選可疑菌落上述平板在37孵育8 h24 h后，檢查是否長(zhǎng)出可疑的炭疽芽胞桿菌菌落。炭疽芽胞桿菌菌落的形態(tài)為：灰白色、不透明、圓形或不規(guī)則形狀、表面呈毛玻璃樣，低倍鏡下菌落呈卷發(fā)狀。血平板上不溶血或微溶血。炭疽芽胞桿菌鑒定將上述可疑菌落挑出，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴一滴

11、診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素藥敏紙片。37孵育8 h24 h后，在滴噬菌體處有透明噬菌斑，青霉素藥敏紙片周?chē)忻黠@的抑菌環(huán)，便可判定接種物為炭疽芽胞桿菌。可疑菌落也可進(jìn)行核酸檢測(cè)，檢出炭疽芽胞桿菌特異性核酸片段可判定為炭疽芽胞桿菌（見(jiàn)附錄D）。（資料性附錄）炭疽血清學(xué)檢查標(biāo)本要求需采集患者急性期和恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行檢測(cè)。急性期血清應(yīng)在首次檢視病人時(shí)采集，血清分離后置-20以下保存，待獲得恢復(fù)期血清后，兩份血清一同進(jìn)行抗體檢查。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法試劑選擇可使用商品化試劑盒，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，也可按以下步驟進(jìn)行操作。試劑準(zhǔn)備ELISA包被液（0.01 M PBS，pH7

12、.4）稱取8 g NaCl，0.2 g KCl，3.58 g Na2HPO412H2O，0.3 g KH2PO42H2O，加雙蒸水900 mL左右，用HCl/NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，最后定容至1 000 mL，15 psi（1.05 kg/cm2）高壓蒸汽滅菌。洗滌液吸取5 mL Tween-20加入995 mL 0.01 M PBS中，混勻。血清稀釋液取0.1 M PBS 20 mL，加雙蒸水160 mL，加脫脂奶粉10 g，加1 mL Tween-20，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用雙蒸水定容至200 mL。4保存，兩周內(nèi)使用。ELISA稀釋液除Tween-20的含量為0.1%外，其他成

13、分與使用要求同血清稀釋液。顯色液3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液即用型。顯色終止液（0.5 M H2SO4）取2.72 mL濃度為98%的濃硫酸，緩慢加入90 mL水中，混勻，加水定容至100 mL。酶標(biāo)板包被本方法檢測(cè)目標(biāo)為患者血液內(nèi)針對(duì)炭疽芽胞桿菌保護(hù)性抗原的抗體，使用保護(hù)性抗原包被酶標(biāo)板。也可使用其他炭疽芽胞桿菌特異抗原成分包被酶標(biāo)板，操作方法可按不同試劑盒說(shuō)明進(jìn)行調(diào)整。將抗原用ELISA包被液稀釋至1.0 g/mL，酶標(biāo)板所用各反應(yīng)孔加入100 L，置4包被過(guò)夜，不用封閉，7 d內(nèi)使用。臨用前用洗滌液洗滌3次，每次3 min。加入待檢血清C.2.4.1樣品初篩實(shí)驗(yàn)血清標(biāo)本用血

14、清稀釋液稀釋至1:50加入酶標(biāo)板，兩孔平行檢測(cè)，每孔100 L。每板做試劑、陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照孔，各3孔平行檢測(cè)。酶標(biāo)板置37濕盒中孵育60 min。甩干孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌液300 L洗滌3次，每次3 min。C.2.4.2復(fù)判實(shí)驗(yàn)初篩實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的血清標(biāo)本進(jìn)行復(fù)判實(shí)驗(yàn)。待檢血清首先用血清稀釋液稀釋至1:50，將稀釋好的血清加入酶標(biāo)板A排（每孔100 L），使用兩孔平行檢測(cè)，再用ELISA稀釋液倍比稀釋至G排。每板做試劑、陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照孔，各3孔平行檢測(cè)。酶標(biāo)板置37濕盒中孵育60 min。甩干孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌液300 L洗滌3次，每次3 min。酶標(biāo)抗體反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入用E

15、LISA稀釋液稀釋的工作濃度辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗人IgG 100 L，置37濕盒孵育60 min。再用洗滌緩沖液洗滌3次，每孔300 L，每次3 min。顯色于各反應(yīng)孔中加入顯色液100 L，置暗處30 min。每孔加入顯色終止液100 L，終止顯色。結(jié)果判斷終止顯色后30 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處，以試劑對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。陰性血清和陽(yáng)性血清的OD值應(yīng)在質(zhì)控要求的范圍內(nèi)。被檢孔OD值大于陰性血清2.5倍的血清，定義為陽(yáng)性，對(duì)應(yīng)的最大稀釋度，定義為陽(yáng)性滴度。（資料性附錄）炭疽芽胞桿菌的核酸檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)炭疽芽胞桿菌特異基因目標(biāo)基因從標(biāo)本中檢測(cè)炭疽芽胞桿菌核酸

16、時(shí)，以炭疽芽胞桿菌毒素基因和莢膜合成相關(guān)基因作為目標(biāo)基因，也可選擇其他特異性基因。試劑選擇可使用商品化試劑盒，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，也可按以下步驟進(jìn)行。參考引物參考引物序列見(jiàn)表D.1。合成的引物通常為凍干產(chǎn)品，開(kāi)蓋前應(yīng)進(jìn)行短暫離心，使用時(shí)需要溶解并稀釋成儲(chǔ)備液。按照10 L/nmol的量加入純水，即可配制成100 M儲(chǔ)存液，用時(shí)取少量稀釋10倍即為工作濃度（10 M）。PCR用參考引物序列目標(biāo)基因引物名稱序列（5 to 3）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（bp）保護(hù)性抗原基因pagA FATTTGCGGTAACACTTCACT923pagA RAGACCGTGACAATGATGGAA莢膜合成相關(guān)基因capW F

17、CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGC1242capW RCGGATTGTATATGGAGTGGG模板制備試劑盒法 原始標(biāo)本使用商品化基因組DNA提取試劑盒，具體操作方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。煮沸法已經(jīng)分離培養(yǎng)的細(xì)菌菌落使用煮沸法進(jìn)行簡(jiǎn)易模板制備。細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37培養(yǎng)18 h24 h； 刮取菌苔1接種環(huán)（約2 L5 L）放入裝有800 L純水或TE的1.5 mL離心管內(nèi)，混勻；100加熱10 min；12 000 g離心10 min；吸取上清用0.22 m濾器過(guò)濾；濾液即為PCR模板。PCR反應(yīng)體系一次總量25 L的反應(yīng)體系包含：酶和緩沖液（2）12.5 L，上游引物（10 M）和

18、下游引物（10 M）各1 L，待測(cè)模板1 L5 L，用純水補(bǔ)足體積至25 L。反應(yīng)設(shè)立質(zhì)控參數(shù)：使用純水作為陰性對(duì)照；用已知炭疽芽胞桿菌模板作為陽(yáng)性對(duì)照。加樣順序：首先加入陰性對(duì)照，然后加待測(cè)模板，最后加入陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增95預(yù)變性5 min；95變性1 min，55退火1 min，72延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)分析PCR產(chǎn)物各取5 L與1 L上樣緩沖液混勻，加入1%瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi)，每塊膠上加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)13孔，每孔5 L，6 V/cm 電泳40 min。結(jié)果判讀在紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，當(dāng)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照成立時(shí)，如

19、炭疽芽胞桿菌的毒素基因和莢膜合成相關(guān)基因擴(kuò)增陽(yáng)性，則表明待測(cè)標(biāo)本陽(yáng)性。當(dāng)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照不成立時(shí)，需更換試劑重新進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-Time PCR）檢測(cè)炭疽芽胞桿菌特異基因目標(biāo)基因同D.1.1。試劑選擇可使用商品化試劑盒，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，也可按以下步驟進(jìn)行。參考引物和探針序列參考引物和探針序列見(jiàn)表D.2，引物和探針稀釋方法同D.1.2。Real-Time PCR參考引物和探針序列目標(biāo)基因引物探針名稱序列（5 to 3）長(zhǎng)度（bp）GC含量（%）Tm值（）保護(hù)性抗原基因上游引物pagA-FGCGACCGTACTTGAATTCGAA2147.652.4下游引物

20、pagA-RTGCGTCGTTCTTTGATATTGGT2240.951.1探針pagA-PTCCTGCAGATACACTCC1752.969.4莢膜合成相關(guān)基因上游引物cap-FATGGTAACCCTTGTCTTTGAATTGT2536.058.0下游引物cap-RTTGAATTCCGTGGTATTGGAGTT2339.158.4探針cap-PTTTGCAATTAATCCTGGAACAA2231.869.6注：探針5端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)模板制備同D.1.3。Real-Time PCR反應(yīng)體系一次20 L的反應(yīng)體系包含：酶和緩沖液（2）10 L，上游引物（10 M）和下游引物（10 M）各0.4 L，探針溶液（10 M）0.4 L，待測(cè)模板1 L5 L，用純水補(bǔ)足體積至20 L。反應(yīng)設(shè)立質(zhì)控參數(shù)：使用純水作為陰性對(duì)照；用已知炭疽芽胞桿菌模板作為陽(yáng)性對(duì)照。加樣順序：首先加入陰性對(duì)照，然后加待測(cè)模板，最后加入陽(yáng)性對(duì)照。Real-Time PCR擴(kuò)增一般使用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，參考程序如下：95預(yù)變性5 min；擴(kuò)增反應(yīng)95 1