基因工程基本操作步驟

1、關(guān)于基因工程的基本操作步驟第1頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四1、基因工程包括哪些步驟？3、基因工程中的核心環(huán)節(jié)是哪一步？4、基因表達載體導入到受體細胞有哪些方法？5、目的基因?qū)胧荏w細胞就會成功表達嗎？ 如何檢測和鑒定？2、什么是目的基因？獲取的方法有哪些方法？ 思考討論問題：第2頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四第3頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細胞四、目的基因的檢測與鑒定第4頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四 主

2、要是指編碼蛋白質(zhì)的基因(一）目的基因 目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。一、目的基因的獲取第5頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四（二）獲取目的基因的方法1、從基因文庫中直接獲取2、PCR技術(shù)擴增3、化學方法直接人工合成第6頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四1、從基因文庫中直接獲?。?）基因文庫的概念部分基因文庫： 基因組DNA文庫： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫含有一種生物的全部基因只包含了一種生物的部

3、分基因，如:cDNA文庫第7頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四（2）基因文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫方法一：直接分離法第8頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導入受體菌中儲存與運載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶方法二：反轉(zhuǎn)錄法-cDNA的合成流程圖解第9頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四PCR技術(shù)多聚酶鏈式反應(yīng)PCR擴增儀DNA半保留復制的基本原理一段已知目的基因的核苷

4、酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因原理：前提：條件：第10頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四利用PCR技術(shù)擴增目的基因第11頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四53GG TC35 AGCC53引物GG高溫變性低溫退火中溫延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；53 AG 引物2.引物與單鏈互補結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。第12頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成3、人工合成

5、第13頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四 核心二、基因表達載體的構(gòu)建功能：使目的基因進入受體細胞并有效表達，而且要能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。第14頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四基因表達載體的構(gòu)建 1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。 2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒） 目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第15頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四編碼區(qū)非編

6、碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子 啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。 RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì). 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。終止子第16頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子A G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CRNA聚合酶A G G U C A C G U C G第17頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分

7、，星期四基因表達載體的組成：b、目的基因a、啟動子c、終止子d、標記基因e、復制原點第18頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四1、下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成 A. B. C. D.小試牛刀第19頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四2、1997年，科學家將動物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達成功。請據(jù)右下圖回答問題。(1)此圖表示的是采取_合成基因的方法獲取_基因的過程。(2) 圖中DNA是以為_ _ 模板，

8、形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的目的基因。人工 目的 控制胰島素合成的信使RNA 小試牛刀第20頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四(3) 圖中代表 ，它往往含 基因，以便對目的基因的檢測。重組DNA分子 標記 第21頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四常用的受體細胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。三、目的基因?qū)胧荏w細胞第22頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2、基因槍法3

9、、花粉管通道法第23頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖第24頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四將目的基因?qū)雱游锛毎姆椒@微注射法第25頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四將目的基因?qū)胛⑸锛毎椒ㄋ拗骷毎ù竽c桿菌）感受態(tài)細胞（大腸桿菌）Ca2+第26頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四四、目的基因的檢測與鑒定首先：其次：最后：還要：要檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交技術(shù) 分子探針檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)個體生物學水平的鑒定第2

10、7頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四 不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。 受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。第28頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應(yīng)變化的個體進一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。第29頁，共31頁，2022年，5月20日，5點56分，星期四3（2010江蘇高考，27題，8分）下