基因工程和基因組學(xué)

1、關(guān)于基因工程與基因組學(xué)第1頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四第一節(jié) 基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相關(guān)技術(shù)四、基因工程的發(fā)展應(yīng)用第2頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四一、基因工程概述遺傳工程（genetic engineering），也稱生物工程，利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。核心是利用重組DNA技術(shù)，在分子水平上操作修飾改變生物體遺傳結(jié)構(gòu)?；蚬こ蹋╣ene engineering）：利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA

2、分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。第3頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四二、基因工程的工具酶內(nèi)切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNA polymerase）RNA聚合酶（RNA polymerase）反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease），也稱限制性酶(restriction enzyme), 能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。第4頁，共52頁，20

3、22年，5月20日，5點54分，星期四Eco R 屬名 種名 菌株名 序號（一）限制性核酸內(nèi)切酶第5頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四常見內(nèi)切酶第6頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四（二） DNA連接酶連接5磷酸和3OH，形成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的缺刻。如： Ecoli DNA連接酶 T4 DNA連接酶 第7頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四 載體(vector)將外源DNA片段運送進(jìn)宿主細(xì)胞(host cell)進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運載工具稱為載體。載體也是DNA分子。常用的載體有細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。經(jīng)改造的黏粒(c

4、osmid)、噬粒(phagemid)都要經(jīng)過人工改造。細(xì)菌人工染色體（BAC）、酵母菌人工染色體（YAC）和人類人工染色體（HAC） 第8頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四噬菌體載體YAC（1Mb）第9頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四載體的基本條件有獨立的復(fù)制原點(ori)，能獨立地自我復(fù)制，而且能帶動外源DNA一起復(fù)制。具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA 片段。載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限制酶來說只能有一個。具有一個選擇標(biāo)記基因。第10頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四獲得外源DNA片段（分）限制性內(nèi)切酶切

5、割外源DNA片段與載體（切）外源DNA片段與載體連接（接）重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）重組子的篩選與鑒定（篩）目的基因的確認(rèn)與分析三、基因工程的流程及相關(guān)技術(shù)第11頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四第12頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四（一）外源DNA片段的分離方法構(gòu)建基因組文庫分離法差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因第13頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四1.構(gòu)建基因組文庫分離法 用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個受體菌的群體，即構(gòu)成了這種生物的基因組文庫。若只儲存某生物基因組的部分遺

6、傳信息，即構(gòu)成部分基因組文庫。供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段分別連接到載體上，構(gòu)成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息。保存、篩選第14頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四差別顯示分析基本流程2.差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）第15頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四3、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）套式PCR（2）反向PCR（3）不對稱PCR（4）錨定PCR（5）長程PCR（6）反轉(zhuǎn)錄PCR第16頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四4、 人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列

7、推測DNA序列將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合成基因。第17頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四通過用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割，連接形成一個重組DNA分子 （二）、外源DNA片段與載體的切割和連接第18頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四（三）、重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞 1.重組DNA轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞 熱激轉(zhuǎn)化法 電穿孔轉(zhuǎn)化法2.重組DNA轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第19頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四重組DNA感受態(tài)細(xì)胞 冰浴混合、靜置42C 熱激加入培養(yǎng)基擴(kuò)培轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA

8、攝入DNA（1）熱激轉(zhuǎn)化法第20頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四感受態(tài)細(xì)胞 電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV 25F 脈沖控制器200-400 質(zhì)粒DNA 混合加入培養(yǎng)液37 中速震蕩涂板（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法第21頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四2.重組DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法第22頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四（四）重組子的篩選與鑒定 核酸雜交PCR檢測測序生物學(xué)活性檢測1.插入抗性失活2.藍(lán)白斑篩選第23頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四1.插入失活篩選法第24頁，共52頁，2022年

9、，5月20日，5點54分，星期四藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒第25頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四四、基因工程的發(fā)展應(yīng)用1、基因工程是生物科學(xué)基礎(chǔ)研究的重要手段2、利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物已取得很大進(jìn)展并在生產(chǎn)上應(yīng)用3、利用基因工程獲得大量重組的蛋白、疫苗藥物4、利用基因工程進(jìn)行不同物種之間的基因傳遞提供了可能。 轉(zhuǎn)基因動植物-“生物工廠”5、疾病診斷與基因治療6、環(huán)境保護(hù)第26頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四第27頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四4. 利用基因工程改良動物第28頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四

10、推薦幾本參考書：1、基因工程原理與方法，孫樹漢編，人民軍醫(yī)出版社2、基因工程原理，吳乃虎編，科學(xué)出版社（側(cè)重原理）3、現(xiàn)代基因工程技術(shù)導(dǎo)論，陳章良編，科學(xué)出版社（側(cè)重應(yīng)用）4、分子克隆(第三版)，J. Sambrook et al. 科學(xué)出版社（具體的實驗方法，分子生物學(xué)研究的圣經(jīng)）第29頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四第二節(jié) 基因組學(xué)一、基因組學(xué)概述二、基因組圖譜的構(gòu)建三、基因組圖譜的應(yīng)用四、后基因組學(xué)第30頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四基因組(genome)泛指一個有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍

11、體）DNA。 一、基因組學(xué)概念及范疇基因組學(xué)(genomics)就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能。第31頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四基因組學(xué)研究的最終目標(biāo)獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關(guān)系闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律第32頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四基因組學(xué)研究內(nèi)容 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 功能基因組學(xué)(functional genomics) 比較基因組學(xué)(comparative genomics) 第33頁，共52頁

12、，2022年，5月20日，5點54分，星期四結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics） 基因定位 基因組作圖 測定核苷酸序列第34頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四遺傳圖（連鎖圖）物理圖轉(zhuǎn)錄圖序列圖二、基因組圖譜的構(gòu)建基因組計劃的第一個環(huán)節(jié)：構(gòu)建基因組圖譜第35頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四1.遺傳圖 連鎖圖(linkage map)，是指基因標(biāo)志在染色體上的遺傳距離，即確定各基因在基因組中的相對位置和排列順序。 遺傳距離通常由基因在四分體時期染色體交換過程中分離的頻率厘摩（cM）來表示。第36頁，共52頁，2022年，5月20日，5

13、點54分，星期四遺傳標(biāo)記（Genetic marker）指可識別的等位基因。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。類型： 形態(tài)標(biāo)記（morphological marker） 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytological marker) 生化標(biāo)記(biochemical marker) 分子標(biāo)記(molecular marker)第37頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四第38頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四2.、物理圖 以已知核苷酸序列的DNA片斷（序列標(biāo)簽位點, STS）為“路標(biāo)”，以堿基對作為基本

14、測量單位（圖距）的基因組圖。 DNA上兩點的實際距離，即確定基因在染色體上的實際排列順序，從而對基因定位。第39頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四3、轉(zhuǎn)錄圖 以EST（expressed sequence tag ，表達(dá)序列標(biāo)簽）為標(biāo)記，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離繪制的圖譜。第40頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四4.、序列圖 序列圖是指整個人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖，既包括可轉(zhuǎn)錄序列，也包括非轉(zhuǎn)錄序列，是轉(zhuǎn)錄序列、調(diào)節(jié)序列和功能未知序列的總和。 這是人類基因組計劃最繁重、耗時最多的工作。第41頁，共52頁，2022年，5月20日，5

15、點54分，星期四CREDIT: JOE SUTLIFF Science, Vol 291: 1221.Fishing in a More Effective Way!第42頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四人類基因組計劃1990，美國國立衛(wèi)生研究所和能源部投資30億，啟動了人類基因組計劃，預(yù)計15年時間完成人類基因組全部序列的測定1996，完成標(biāo)記密度為0.6cM的人類基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類基因組圖譜的修訂版2002，完成測序工作第43頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四國際人類基因組測序協(xié)作組（

16、公共計劃組）由6個國家、20個研究中心的2000多位科學(xué)工作者組成。國家承擔(dān)的測序任務(wù)美國54%英國33%日本7%法國2.8%德國2.2%中國1%第44頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四 1999年9月 中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃，負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的1%，負(fù)責(zé)第3號染色體3千萬核苷酸的序列測定工作。中國是繼美、英、日、德、法之后第6個國際人類基因組計劃參與者，也是參與這一計劃的唯一發(fā)展中國家。第45頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四人類基因組計劃1%測序中國實驗室第46頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四2000年6月2

17、6日 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖，標(biāo)志著人類在解讀自身“生命之書”的路上邁出了重要一步。第47頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四HGP對人類基因面貌的新發(fā)現(xiàn)基因數(shù)量少得驚人人類基因組中存在“熱點”和大片“荒漠”三分之一為“垃圾”DNA種族歧視毫無根據(jù)男性基因突變比例更高第48頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四 2000年是基因組之年，完成了人類基因組的工作框架圖，完成了一系列模式生物和微生物的基因組序列分析。 2000 年 12 月美、英等國科學(xué)家宣布繪出擬南芥基因組的完整圖譜，這是人類首次全部破譯出一種植物的基因序列。第49頁，共52頁，2022年，5月20日，5點54分，星期四三、后基因組學(xué)（postgenomics) 完成一個生物體全部基因組測序后即進(jìn)入功能基因組學(xué)階段，也稱后基因組階段詳盡分析