核醫(yī)學(xué)第二講體外分析

1、體外分析 1960年美國(guó)的Berson和Yalow 將核技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合建立了放射免疫分析法，并首先用于測(cè)定血漿胰島素濃度，由于該法對(duì)醫(yī)學(xué)的巨大貢獻(xiàn)，1977年Yalow獲得了Nobel獎(jiǎng)。Yalow2體外分析以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標(biāo)記的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行的微量生物活性物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。 3體外分析技術(shù)體外放射分析非放射標(biāo)記免疫分析放射免疫分析（RIA）免疫放射分析 (IRMA)受體的放射配基結(jié)合分析(RBA)酶免疫分析(EIA)化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLA)時(shí)間分辨熒光免疫分析(TrFIA)4 Radioimmunoassay

2、,RIA 放射免疫分析5RIA的基本原理競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合反應(yīng)： 放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標(biāo)記抗原（Ag）與定量的標(biāo)記抗原（*Ag）對(duì)限量的特異性抗體（Ab）的競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合反應(yīng)。6基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag(B)(F) *Ag與Ag 免疫活性相同*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)7Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+Ag8 AgAb Ag.Ab Ag* Ag*.AbAg*與Ag由于免疫化學(xué)性質(zhì)一致，共同競(jìng)爭(zhēng)性與

3、Ab結(jié)合當(dāng)Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*與Ag之和大于Ab時(shí)，則Ag*.Ab復(fù)合物的形成受Ag含量的制約，二者之間存在函數(shù)關(guān)系，即隨著Ag濃度的增加，Ag*.Ab復(fù)合物也減少，因?yàn)锳g*對(duì)Ab的結(jié)合被Ag競(jìng)爭(zhēng)性抑制9標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制方法用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原和一定量的標(biāo)記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)；在反應(yīng)達(dá)到平衡后，利用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離B和F；分別測(cè)量B和F的放射性；用反應(yīng)變量（如B/F）作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量作為橫坐標(biāo)（即一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作一條曲線(xiàn)，就得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)反應(yīng)變量的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，這就是劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。 10Ag2550100200400800*AgAb分

4、離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？11B%標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(xiàn)12在實(shí)際的操作中，一般要設(shè)立：最大結(jié)合管（零標(biāo)準(zhǔn)管Bo）：標(biāo)準(zhǔn)抗原的量為0，只有標(biāo)記抗原和特異性抗體時(shí)，標(biāo)記抗原與抗體充分反應(yīng)后分離B和F，所測(cè)得的B的放射性為Bo。這是沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)抗原與之競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合達(dá)最大值。非特異結(jié)合管（NSB）：標(biāo)記抗原除了要和特異性抗體結(jié)合以外，還要和一些雜質(zhì)蛋白或容器的管壁等結(jié)合，對(duì)我們的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體，在相同條件下反應(yīng)后測(cè)得的放射性。RIA中的測(cè)定管13總放射性管（T）：反應(yīng)后不分離就直接測(cè)得的放射性就是總放射性。表示標(biāo)記抗原抗體復(fù)

5、合物和游離的標(biāo)記抗原的總放射性。標(biāo)準(zhǔn)管（B1Bn）：放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，再加入相同量的標(biāo)記抗原和特異抗體。一般在反應(yīng)后分離出沉淀，測(cè)定沉淀的放射性作為B。樣品管（Bx）：用同劑量的樣品代替標(biāo)準(zhǔn)管中的標(biāo)準(zhǔn)抗原，在相同條件下反應(yīng)和分離，同樣取沉淀測(cè)得其放射性，就可以在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上找到樣品的濃度。14標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)左：橫座標(biāo)為等份刻度；右：橫座標(biāo)為對(duì)數(shù)刻度 15RIA基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)抗原）標(biāo)記抗原抗體分離技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)16標(biāo)準(zhǔn)抗原的要求標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測(cè)抗原、標(biāo)記抗原具有基本相同的免疫活性，即質(zhì)同。他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)要相同，對(duì)特異性抗體的親和力要相同。并且，標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測(cè)抗原所處的介質(zhì)條件要相

6、同。17標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量要準(zhǔn)確：整個(gè)RIA分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標(biāo)準(zhǔn)抗原的量，因此標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量一定要準(zhǔn)確，即與國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品相比有良好的可比性。只有保證標(biāo)準(zhǔn)抗原的準(zhǔn)確定量，才能保證RIA分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精確度。18標(biāo)準(zhǔn)抗原必須高純度：標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)該含有盡可能少的化學(xué)雜質(zhì)，以避免雜質(zhì)對(duì)反應(yīng)和計(jì)量的影響。標(biāo)準(zhǔn)抗原的穩(wěn)定性要好：要保證在試劑盒的運(yùn)輸、儲(chǔ)存和在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該不發(fā)生降解，分離、破壞等。19標(biāo)記抗原指抗原分子中有一個(gè)或兩個(gè)原子被放射性核素所取代。 最常用的是125I，因?yàn)樗谋然疃缺容^高，標(biāo)記和測(cè)量都相對(duì)容易，且半衰期合適（60天）利于商品化。 20標(biāo)記抗原的要求質(zhì)同，即標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗

7、原、待測(cè)抗原的化學(xué)性質(zhì)和免疫活性要相同。 標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。比活度高則在允許的相同的測(cè)量統(tǒng)計(jì)誤差的前提下，所使用的標(biāo)記抗原的量必然減少，那么在反應(yīng)中與之競(jìng)爭(zhēng)的待測(cè)抗原的量也相應(yīng)減少，方法的靈敏度就提高了。但過(guò)高的比活度，也會(huì)引起諸如輻射自分解和免疫活性受損的問(wèn)題。 21標(biāo)記抗原要有足夠高的放射化學(xué)純度，一般要大于95%。放射化學(xué)純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對(duì)RIA的免疫反應(yīng)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響。由于存在放射性核素的衰變，因此在長(zhǎng)期儲(chǔ)存后的標(biāo)記抗原一般要經(jīng)過(guò)重新提純后才能再次使用。22標(biāo)記抗原的穩(wěn)定性要好：和標(biāo)準(zhǔn)抗原相比，標(biāo)記抗原由于有了放射性核素射線(xiàn)的影響，更容易發(fā)生分解。

8、在標(biāo)記抗原的儲(chǔ)存上，應(yīng)遵循標(biāo)記化合物的保存原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。23特異性抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體?？贵w的質(zhì)量之間關(guān)系到RIA分析方法的靈敏度和特異性。24多克隆抗體一般是用抗原免疫年輕、健康的純種小動(dòng)物（一般是羊或兔子）而誘發(fā)產(chǎn)生的抗血清。制備的方法成熟、簡(jiǎn)便、生產(chǎn)量大；但是里面成份復(fù)雜，免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)規(guī)律復(fù)雜。單克隆抗體是通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選制備的，成份單一、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)；但成本較高。25抗體的要求（三高）高親和力高特異性高滴度26抗體的檢測(cè)指標(biāo)1. 親和常數(shù)K（affinity constant）：親和常數(shù)反應(yīng)了抗體與抗原的親和力。K值越大，形成抗體抗原復(fù)合物速

9、度快，解離少，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精確度都好。K=結(jié)合常數(shù)k1 / 解離常數(shù)k2 。 272.交叉反應(yīng)率指抗體識(shí)別相應(yīng)抗原類(lèi)似物的能力，反應(yīng)了抗體的特異性。在生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有很多相似的類(lèi)似物，例如甲狀腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反應(yīng)率越低，則說(shuō)明抗體與抗原類(lèi)似物的交叉反應(yīng)就越小，其識(shí)別抗原類(lèi)似物的能力就越強(qiáng)，特異性就越強(qiáng)。 28常用50%置換法來(lái)測(cè)定交叉反應(yīng)的百分率。即將被測(cè)物質(zhì)和其類(lèi)似物，分別作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，比較兩者在其結(jié)合率為零管結(jié)合率（B/B0=50%）時(shí)的劑量響應(yīng)濃度，其比值即為交叉反應(yīng)百分率，也就是該抗體對(duì)被測(cè)物某種類(lèi)似

10、物的相應(yīng)活力。 293.滴度又稱(chēng)稀釋度，反映了抗血清中有效抗體的濃度。指在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)抗原存在的時(shí)候，結(jié)合50%的標(biāo)記抗原時(shí)抗血清的稀釋度。其方法就是用緩沖液將抗血清稀釋為不同的濃度，各置于試管中，然后各加一定量的標(biāo)記抗原進(jìn)行反應(yīng)，等到反應(yīng)平衡后分離B和F，測(cè)出B的放射性，算出B%，以B%為縱坐標(biāo)以抗血清的稀釋度為橫坐標(biāo)作出抗血清稀釋曲線(xiàn)，B%為50% 所對(duì)應(yīng)的抗血清滴度為工作滴度。 30RIA的分離方法指分離標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）和游離標(biāo)記抗原（F）的方法。根據(jù)使用的分離劑不同可以分為：非特異性分離方法：利用物理、化學(xué)或生物化學(xué)的方法如吸附、過(guò)濾、沉淀等。特異性分離方法：利用免疫反應(yīng)的特異性來(lái)

11、進(jìn)行分離的方法。常用的分離方法有雙抗體法 固相法等31分離方法的要求分離完全、快速。不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過(guò)程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、PH值等）的影響小。操作簡(jiǎn)便，分離劑來(lái)源豐富、價(jià)廉。32標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合方式標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是衡量待測(cè)樣品中配體濃度的客觀尺度和基準(zhǔn)反映檢測(cè)質(zhì)量的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)要最大限度地反映量效關(guān)系便于自動(dòng)化分析，使用靈活每一批分析必須做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。WHO推薦的數(shù)據(jù)處理模型是四參數(shù)單位點(diǎn)質(zhì)量作用模型和四參數(shù)logistic模型33 RIA特點(diǎn) 特異性強(qiáng)靈敏度高，可檢測(cè)10-910-12 g水平穩(wěn)定性好操作簡(jiǎn)便適于多種生物活性物質(zhì)RIA

12、測(cè)量的是免疫活性34誤差的分類(lèi)和來(lái)源 根據(jù)來(lái)源不同的誤差，可以把實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的誤差分為兩類(lèi)：系統(tǒng)誤差隨機(jī)誤差35是由于試劑、儀器或操作方法上一個(gè)固定的缺陷而造成整批結(jié)果傾向性的偏差，影響了結(jié)果的正確性。如標(biāo)準(zhǔn)品不標(biāo)準(zhǔn)、加樣器不準(zhǔn)等系統(tǒng)誤差引起的測(cè)定結(jié)果的偏差是固定的偏大或偏小。系統(tǒng)誤差是可以避免的。系統(tǒng)誤差36是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各種偶然因素造成同一樣品多次測(cè)定的結(jié)果不一致。如加樣、分離、放射性測(cè)量等誤差的出現(xiàn)是隨機(jī)的，與真實(shí)值的偏離是雙向性的，可大可小。 隨機(jī)誤差無(wú)法避免。隨機(jī)誤差37質(zhì)量控制質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來(lái)自試劑藥盒和測(cè)量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。

13、具體作用有：1檢查誤差的程度，決定測(cè)定結(jié)果的取舍。2識(shí)別誤差的來(lái)源并消除其原因。3改進(jìn)測(cè)定方法的設(shè)計(jì)以提高質(zhì)量。 38RIA質(zhì)量控制指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)量控制側(cè)重于對(duì)檢測(cè)質(zhì)量的控制，保證從樣品收集到發(fā)出結(jié)果報(bào)告的整個(gè)過(guò)程中能及時(shí)發(fā)現(xiàn)各種誤差，并分析原因，找出糾正的方法。 質(zhì)量控制的指標(biāo)包括：精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性 39精密度指同一樣品重復(fù)測(cè)定的一致程度，即測(cè)定的重復(fù)性，通常用變異系數(shù)CV和標(biāo)準(zhǔn)差SD表示CV=SD/X批內(nèi)CV：同一樣品同批測(cè)定的變異系數(shù)批間CV：同一樣品不同批次測(cè)定的變異系數(shù)RIA中應(yīng)做復(fù)管或三管40是指測(cè)量值與真值的符合程度，其偏離真值的誤差就叫做偏差。在實(shí)際

14、工作中我們用設(shè)置質(zhì)控樣品、測(cè)定回收率或進(jìn)行健全性評(píng)價(jià)的方法來(lái)判斷準(zhǔn)確度。 準(zhǔn)確度41回收率測(cè)定回收率（） （回收管測(cè)定值對(duì)照管測(cè)定值）/回收管加入的已知量100或回收率（） 回收管測(cè)定值/（對(duì)照管測(cè)定值回收管加入的已知量）100對(duì)照管：加入樣品回收管：加入樣品和已知量的分析物回收率一般為90110之間42質(zhì)量控制樣品是含有已知?jiǎng)┝看郎y(cè)物的血清樣本。質(zhì)控樣品和待測(cè)樣品為同一種物質(zhì)，具有相同的生物和免疫活性。質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)準(zhǔn)確定量并有合理的濃度范圍。通常是根據(jù)待測(cè)物在人體血清內(nèi)的正常濃度制定高、中、低三個(gè)劑量水平的質(zhì)控樣品。使用時(shí)將質(zhì)控樣品分置在待測(cè)樣品的不同位置中同時(shí)檢測(cè)。質(zhì)量控制樣品43質(zhì)控

15、圖44主要用于評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的免疫活性是否一致。用反應(yīng)緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品稀釋曲線(xiàn)，如果樣品與標(biāo)準(zhǔn)品免疫活性相同，得到的曲線(xiàn)應(yīng)該是一組平行的曲線(xiàn)，所以又稱(chēng)為平行性實(shí)驗(yàn)。 健全性45是指RIA方法剛能與不含有標(biāo)準(zhǔn)抗原的零標(biāo)準(zhǔn)管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上區(qū)別開(kāi)來(lái)的抗原最低劑量，即該RIA方法的最小可檢測(cè)量。確定靈敏度的方法主要有： 同一樣品10次測(cè)量結(jié)果的B/B090的劑量的平均值作為最小可測(cè)量。 以10次測(cè)量結(jié)果的B0管結(jié)合率均值減去2SD（標(biāo)準(zhǔn)差）的結(jié)合率的劑量對(duì)應(yīng)值為最小可測(cè)量。靈敏度46 方法的特異性主要取決于抗體的特異性。 用抗體的交叉反應(yīng)率來(lái)表示。特異性47穩(wěn)定性 測(cè)量結(jié)果的穩(wěn)

16、定性可以通過(guò)劑量反應(yīng)曲線(xiàn)的各個(gè)參數(shù)的穩(wěn)定性來(lái)間接反映。 如標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率和截距，非特異性結(jié)合率，零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率及其75%、50%、25%處的劑量值(ED75、ED50、ED25)。48操作基本步驟加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對(duì)象孵育的溫度和時(shí)間不同，一般是37。分離：選擇好的分離方法進(jìn)行分離。測(cè)量：測(cè)量游離或結(jié)合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和待測(cè)物濃度的計(jì)算。 49免疫放射分析immunoradiometric assay, IRMA50基本原理免疫放射分析是一種非競(jìng)爭(zhēng)性的抗原抗體反應(yīng)。 將放射性核素標(biāo)記在抗體上，用過(guò)量的抗體

17、與抗原結(jié)合，反應(yīng)平衡后，用分離方法除去多余的抗體，測(cè)量抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性。利用抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性活度與抗原劑量之間的函數(shù)關(guān)系來(lái)測(cè)定待測(cè)抗原的量。 51雙位點(diǎn)法(Ab2為McAb)具有代表性的固相免疫放射分析法：固相Ab1+Ag (固相)Ab1.Ag (過(guò)量) + 過(guò)量Ab*2(McAb) 固相Ab1.Ag.Ab*2 +剩余Ab*(洗去) sandwichAb1AgAb2*52B%B%擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的NSB擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的NSBIRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及非特異結(jié)合曲線(xiàn)RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及非特異結(jié)合曲線(xiàn)53RIA與IRMA區(qū)別RIA IRMA標(biāo)記抗原 標(biāo)記抗體定量抗體和標(biāo)記抗原

18、 過(guò)量抗體和標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原和標(biāo)記抗原抗體 抗原和標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物呈負(fù)相關(guān) 復(fù)合物呈正相關(guān) 靈敏度、特異性更高 標(biāo)記物的穩(wěn)定性好 待測(cè)抗原需有兩個(gè)抗原決定簇， 故不適于小分子多肽 54標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展方向放射免疫技術(shù) 免疫放射技術(shù)多克隆抗體 單克隆抗體放射性標(biāo)記免疫技術(shù) 非放射性標(biāo)記免疫技術(shù)55非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)Enzyme immunoassay,EIAChemiluminescence immunoassay,CLIATime-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA56酶標(biāo)記免疫技術(shù)EIA原理：酶標(biāo)記（HRP、AP、GO等）生成酶標(biāo)記抗

19、原抗體復(fù)合物相應(yīng)的酶的底物（如TMB、5-AS）生成有顏色的產(chǎn)物（如黃色、棕色）分光光度計(jì)測(cè)定顏色深淺（OD值）以決定待測(cè)含量57經(jīng)典ELISA雙抗法：測(cè)抗原固相載體Ab 固相AbAg 固相Ab-AgHRP-Ab 固相Ab-Ag-HRP-Ab 底物 顏色反應(yīng) 分光光度計(jì)測(cè)定OD間接法：測(cè)抗體固相載體Ag 固相AgAb 固相Ag-AbHRP-抗人IgG 固相Ag-Ab-HRP-抗人IgG底物 顏色反應(yīng) 分光光度計(jì)測(cè)定OD 58化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 經(jīng)典的CLIA是用發(fā)光化合物異魯米那和吖啶酯為標(biāo)記物，在堿性條件下遇過(guò)氧化物便能發(fā) 生單光子發(fā)射，光子數(shù)量和發(fā)光標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物呈正比59化學(xué)發(fā)光酶

20、免疫分析（CLEIA）標(biāo)記物：堿性磷酸酶（ALP）底物：金剛烷測(cè)定：發(fā)光強(qiáng)度60化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶 發(fā)光發(fā)光底物Dioxetane光電倍增管測(cè)量光強(qiáng)度ALP標(biāo)記Ag或Ab，形成Ag.Ab反應(yīng)去除游離部分溫育BECKMAN公司Access分析原理分為競(jìng)爭(zhēng)法與夾心法兩類(lèi)61電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA） 是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 激發(fā)物：三丙胺 發(fā)光底物：三聯(lián)吡啶釕 標(biāo)記物：三聯(lián)吡啶釕的衍生物N-羥基琥珀酰胺酯標(biāo)記抗體62ECLIA反應(yīng)過(guò)程在電陽(yáng)極上1.TPA失去電子氧化為陽(yáng)離子自由基TPA，二價(jià)（基態(tài)）三聯(lián)吡啶釕被氧化為三價(jià)的三聯(lián)吡啶釕2. 陽(yáng)離子自由基TPA性

21、質(zhì)不穩(wěn)定，自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子變成自由基TPA（還原劑）3. 自由基TPA將一個(gè)電子給三價(jià)的三聯(lián)吡啶釕，從而生成二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕（激發(fā)態(tài)），TPA則分解為二丙胺和丙醛4. 激發(fā)態(tài)二價(jià)三聯(lián)吡啶釕發(fā)射波長(zhǎng)620nm光子，重新生成基態(tài)的二價(jià)三聯(lián)吡啶釕5. 上述過(guò)程周而復(fù)始，只消耗TPA63時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）鑭系元素（如銪Eu）經(jīng)激發(fā)后能發(fā)出特征性熒光，其熒光壽命較一般干擾熒光長(zhǎng)數(shù)倍，故稱(chēng)時(shí)間分辨如：經(jīng)0.5s （340nm）脈沖光激發(fā)，延遲400 s ，用613nm檢測(cè)并記錄熒光強(qiáng)度400s ，間歇200 s 再次激發(fā)，每一工作周期僅1ms，每秒鐘可重復(fù)檢測(cè)1000次64時(shí)間分辨熒光檢測(cè)的基本原理示意圖熒光衰