細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cell Transfection課件

1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cell Transfection陳亞玉 細(xì)胞轉(zhuǎn)染隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中，其應(yīng)用越來越廣泛。轉(zhuǎn)染(transfection)：真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttransfection)外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴

2、于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑物理介導(dǎo)：電穿孔法、顯微注射、基因槍化學(xué)介導(dǎo)：.DEAE-葡聚

3、糖法、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、 多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo) 生物介導(dǎo)：原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染效率的因素影響 轉(zhuǎn)染試劑 細(xì)胞狀態(tài) 轉(zhuǎn)染方法 載體構(gòu)建 細(xì)胞培養(yǎng)物 細(xì)胞密度 血清 抗生素 氮磷比 DNA質(zhì)量2 細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（50） 能確保基因型不變。 最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞， 細(xì)胞生長旺盛， 最容易轉(zhuǎn)染。 同一種系的細(xì)胞株， 在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下， 其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變， 導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。 因此， 如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低， 可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。3 轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法， 但大多大

4、同小異。 應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。（1） 細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。 不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基， 血清和添加物。 高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度。 推薦在轉(zhuǎn)染前 24 小時(shí)分細(xì)胞， 這將提供正常細(xì)胞代謝， 增加對(duì)外源 DNA 攝入的可能。 一定要避免細(xì)菌， 支原體或真菌的污染。（2） 細(xì)胞密度細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。 轉(zhuǎn)染時(shí)過高或者過低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低， 乃至表達(dá)水平偏低。 因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法， 包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等， 總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，

5、以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。 （4） 抗生素細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來防止污染， 但是這些添加劑可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成麻煩。 比如青霉素和鏈霉素， 就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。 這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒， 但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性， 使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。 這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡， 造成轉(zhuǎn)染效率低。 目 前轉(zhuǎn)染試劑因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來操作， 非常方便， 省去了污染等麻煩（5） 氮磷（N/P） 比N/P 比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便， 一般以 DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示） ， 在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨 N/P 比成比例增高， 之后達(dá)到平值， 但毒性也隨之

6、而增加， 因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例， 確定本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)染比例。4 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體， 質(zhì)粒 DNA， RNA， PCR 產(chǎn)物， 寡核苷酸等） 也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。 病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高， 但不同病毒載體有其特定的宿主， 有的還要求特定的細(xì)胞周期 。 除載體構(gòu)建外， 載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響， 如超螺旋及線性 DNA 對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。 如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用， 轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行， 因此選擇組成或可調(diào)控， 強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要， 同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的材料真核表達(dá)質(zhì) 粒 P

7、EGFP-N 帶有表達(dá)綠色熒光蛋白 的 EGFP 基因，用 于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后衡量轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平， 打靶載體（ Target Vector， 如圖 2 所示） 在靶基因的同源序列之間插入新霉素抗性基因（ NEO）作為正篩選的標(biāo)志， 在同源序列的 3端插有皰疹病毒胸苷激酶（ HSV-tk）基因作為負(fù)選擇， 反復(fù)篩選后得到的細(xì)胞克隆數(shù)用 于衡量轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平 . 細(xì)胞培養(yǎng)HeLa， HepG-2， NIH /3T3 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 新生小牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)液， 37 C ， 5% CO2， 90% 相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中 . 在解凍小鼠 ES 細(xì)胞前， 先培養(yǎng)飼養(yǎng)層細(xì)胞 C57BL， 待長

8、滿后， 用 含 10 ug /mL 的mitomycin C處理 2 2. 51h， 用 37 C 預(yù)熱的 PBS 漂洗兩次， 加普通培養(yǎng)液過夜培養(yǎng) . 第二天， 解凍小鼠 ES 細(xì)胞， 在含 10% 胎牛血清7 . 175 X 109 pmoI /L LIF飼養(yǎng)層上培養(yǎng) .細(xì)胞電穿孔法轉(zhuǎn)染收獲處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞， 用 冰預(yù)冷的 PBS 將細(xì)胞重懸為 4 X 106個(gè) /mL， 細(xì)胞懸液中 加入 PEGFP-N3 至終濃度 10 ug /mL. 取 0. 5 mL DNA 與細(xì)胞混合液加到 4mm 電擊池， 冰上放置 5 min （對(duì)照組室溫放置）電擊參數(shù)如下： 電容 950 uF,電阻 ,

9、電壓 250 500 V 間 隔50 V 取值,以取得最佳轉(zhuǎn)染率.電擊后冰上放置 5 min（ 對(duì)照組室溫放置）,向電擊池中 加入 1 mL 預(yù)熱的 培養(yǎng)液， 輕輕吸打， 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 已裝有預(yù)熱培養(yǎng)液的 皿中 ,搖勻,培養(yǎng) 24 h 后換新鮮培養(yǎng)液小鼠 ES 細(xì)胞， 用 冰預(yù)冷的 PBS 將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞重懸為 1 X 107個(gè) /mL， 取 0. 8 mL 細(xì)胞懸液與 25 ug 線性化的 Target Vector 混合， 加到 4 mm 電擊池， 冰上放置 5 min (對(duì)照組室溫放置）用 電壓 240 V,電阻 ,電容 500 uF 和 950 uF 分別進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染， 電擊

10、后冰上放置 5 mi n (對(duì)照組室溫放置）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)熱培養(yǎng)液的 15 mL 離心管中 ， 輕輕吸打均勻后， 將細(xì)胞懸液平均分到 6 個(gè)裝有預(yù)熱培養(yǎng)液（ 含 7 . 175 X109 pmoI /L LIF）鋪好飼養(yǎng)層的 10 cm 培養(yǎng)皿中 ， 搖勻， 常規(guī)條件培養(yǎng)24 h后換新鮮培養(yǎng)液， 電擊后 48 h,加250ug /mL G418 及 2 umoI /L gancycIovir 進(jìn)行選擇， 每天更換選擇培養(yǎng)液 磷酸鈣法轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分皿， 轉(zhuǎn)染的當(dāng) 天， 細(xì)胞應(yīng)均勻 分布 . 細(xì)胞密度約 50% 70%,轉(zhuǎn)染前 3 h換新鮮培養(yǎng)液（ 對(duì)照組培養(yǎng)液中 含 50 mmoI

11、 /L HEPES pH 7 . 2）所有轉(zhuǎn)染試劑須預(yù)熱至室溫， 取 5ug DNA（ pEGFP-N3）用 0. 2 moI /L CaCI2稀釋到 167 uL， 混勻后， 邊輕輕震蕩邊滴加到 167 uL 2 X HBS 中,室溫靜置 15 20 min.將 DNA /磷酸鈣復(fù)合物輕輕混勻， 滴加入 6 cm 培養(yǎng)皿的細(xì)胞中 ， 輕輕晃勻， 常規(guī)條件下培養(yǎng) 18h.吸去培養(yǎng)液， 用 3 mL 37 C 預(yù)熱的 PBS 漂洗兩次， 換新鮮培養(yǎng)液 轉(zhuǎn)染率及死亡率的檢測(cè)轉(zhuǎn)染 PEGFP-N3 的 HeLa， HepG-2， NIH /3T3 細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染 24 1 后， 在 100 倍熒光顯微鏡下對(duì)表達(dá)綠色熒光蛋白 的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù) . 轉(zhuǎn)染了