植物基因工程原理和安全性概要(柴友榮,)

1、現(xiàn)代生命科學(xué)進(jìn)展專選柴友榮 博士西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院研究員、博導(dǎo)重慶市巴渝學(xué)者特聘教授重慶市作物品質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任重慶市油菜工程技術(shù)研究中心基因工程室主任2013-10-12本報(bào)告的部分圖片和數(shù)據(jù)來自網(wǎng)絡(luò)或?qū)W術(shù)論文，在此一并致謝！植物基因工程原理和安全性概要一 從現(xiàn)代農(nóng)業(yè)到基因工程二 植物基因工程原理簡介三 轉(zhuǎn)基因植物安全性等的釋疑四 我國轉(zhuǎn)基因生物安全性法規(guī)和管理五 轉(zhuǎn)基因作物的成就和明天一 從現(xiàn)代農(nóng)業(yè)到基因工程(一)糧食安全現(xiàn)狀1、食物總量供給已成為全球的焦點(diǎn)之一：2000年來，全球出現(xiàn)了當(dāng)年糧食生產(chǎn)量比消費(fèi)量低的情況，10年來世界糧食消費(fèi)需求增加2200億公斤，年均增長1.1%

2、，而產(chǎn)量僅增加1000億公斤，年均增長0.5%，全球糧食儲備減少。到2050年全球人口將增加23億，糧食需求將增長70%，供需缺口更大。人口增長、生活水平提高、搶購現(xiàn)象、用糧食生產(chǎn)生物燃料助推糧價(jià)上漲，引發(fā)惡性循環(huán)，但根源是供需關(guān)系的不平衡。2011年2月全球糧價(jià)指數(shù)攀升至237點(diǎn)，小麥、大豆、玉米和大米的價(jià)格比2009年上升137.5%、79.2%、34.6%和66.6%。自2000年以來，我國糧食年消費(fèi)需求大致在4.8-4.9億噸之間，產(chǎn)需缺口約400億公斤。到2030年，我國人口的持續(xù)增長將要達(dá)到高峰期，預(yù)計(jì)達(dá)到16億人口，解決這個(gè)龐大人口的口糧是一個(gè)新的挑戰(zhàn)。隨著人民生活水平的提高，肉

3、蛋奶和水產(chǎn)品的消費(fèi)不斷增加，糧食作為飼料的比重將越來越大，人均糧食占有量的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)有所提高。中國國內(nèi)消費(fèi)大豆和油菜籽的60%以上依靠進(jìn)口，玉米、小麥、優(yōu)質(zhì)棉等的進(jìn)口量也很大，預(yù)測2020年中國將成為世界最大糧食進(jìn)口國。2、食品安全性也成為全球的焦點(diǎn)之一：農(nóng)藥污染與殘毒、非法食品添加劑、轉(zhuǎn)基因食品安全性是當(dāng)前人們最為關(guān)心的食品安全性的三個(gè)主題。(二)農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要矛盾科技支撐能力不強(qiáng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的規(guī)?；?、專業(yè)化和多樣化對科技提出了更高的要求，大幅度提高農(nóng)業(yè)勞動(dòng)生產(chǎn)率需要通過先進(jìn)適用技術(shù)的廣泛應(yīng)用，而目前我國科技進(jìn)步貢獻(xiàn)率只有45%左右，與發(fā)達(dá)國家的70-80%有很大的差距。一個(gè)農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力養(yǎng)活的人口

4、數(shù)：美國：70人；日本：約25人；中國：4-5人。農(nóng)業(yè)發(fā)展的根本出路是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，而其核心支撐條件是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的進(jìn)步。(三)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的內(nèi)涵現(xiàn)代農(nóng)業(yè)是以現(xiàn)代工業(yè)和科學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，重視加強(qiáng)農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，充分汲取中國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的精華，根據(jù)國內(nèi)外市場需要和WTO規(guī)則，建立起采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)、運(yùn)用現(xiàn)代工業(yè)裝備、推行現(xiàn)代管理理念和方法的農(nóng)業(yè)綜合體系(引自盧良恕院士)。(四)建設(shè)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新體系是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一個(gè)根本任務(wù)國家級農(nóng)業(yè)科研工作應(yīng)具有較強(qiáng)的關(guān)鍵性、全局性、基礎(chǔ)性、戰(zhàn)略性和前瞻性的特點(diǎn)，為加快現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè)提供科技支撐。省級有關(guān)農(nóng)業(yè)的科研機(jī)構(gòu)應(yīng)逐步實(shí)行聯(lián)合，重點(diǎn)開展應(yīng)用研究和開發(fā)研究(也可根據(jù)需要適當(dāng)

5、開展應(yīng)用基礎(chǔ)研究)，重視科技成果轉(zhuǎn)化，更好地為發(fā)展生產(chǎn)服務(wù)(引自盧良恕院士)。(五)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新的一個(gè)核心內(nèi)容：良種創(chuàng)新農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新的核心：良種+良法。良種對增產(chǎn)的作用所占的比重越來越大，良種是一個(gè)先進(jìn)技術(shù)的集合體。良種創(chuàng)新：植物良種創(chuàng)新、動(dòng)物良種創(chuàng)新。植物食品占總食品的93%，動(dòng)物食品占7%，但也間接來自植物食品，所以良種創(chuàng)新的首要任務(wù)是植物良種創(chuàng)新。(六)傳統(tǒng)育種面臨的挑戰(zhàn)以雜交育種為核心的傳統(tǒng)育種技術(shù)取得了豐碩的成果，目前仍然是主要作物的主要育種手段。目前傳統(tǒng)育種技術(shù)在改良作物性狀方面遇到了一些挑戰(zhàn)，如缺乏特別性狀的種質(zhì)資源，育種周期長，難以克服不良性狀的連鎖或負(fù)相關(guān)，易受雜交不親和及雜

6、種不育的限制，遠(yuǎn)緣物種間不能進(jìn)行遺傳物質(zhì)交流和性狀轉(zhuǎn)移。(七)基因工程帶來的機(jī)遇與競爭 20世紀(jì)50年代以來，DNA雙螺旋模型和基因操縱子學(xué)說的提出，以及DNA限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致了DNA體外重組技術(shù)基因工程技術(shù)的發(fā)展，推動(dòng)了分子生物學(xué)和基因工程本身在廣度和深度方面以空前的速度蓬勃發(fā)展，生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)已經(jīng)出現(xiàn)劃時(shí)代的突破?；蚬こ淌且蕾囉诰茉O(shè)計(jì)的分子育種，是對傳統(tǒng)育種的升華和補(bǔ)充。2l世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，生物技術(shù)可能會(huì)對世界的重大問題饑餓、疾病、能源、污染等提供切實(shí)的解決辦法。生物技術(shù)正成為國際競爭的主要領(lǐng)域，其核心是基因工程，是強(qiáng)國之策。二 植物基因工程原理簡介1 基因工

7、程的理論基礎(chǔ)2 植物基因工程的概念和目標(biāo)3 植物基因工程的性狀和基因4 植物基因工程的載體和其它DNA元件5 植物基因工程的基本路線1.1 生物界的所有生物由一個(gè)共同祖先衍生而來，互為親緣關(guān)系137億年前宇宙大爆炸，46億年前太陽系形成，38-44億年前誕生了最早的生命。1 基因工程的理論基礎(chǔ)圖1 生物進(jìn)化樹圖2 生物起源和進(jìn)化的地質(zhì)年代史1.2 生物界的不同基因之間具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)所有基因均是(或可轉(zhuǎn)化為)具有特定核苷酸序列和遺傳功能的DNA片段，因此所有基因均可以DNA片段作為材料進(jìn)行加工或工程處理。1 基因工程的理論基礎(chǔ)圖3 DNA雙螺旋和四種堿基的結(jié)構(gòu)1.3 所有生物享有相同的遺傳密

8、碼規(guī)則所有生物都由一個(gè)共同的祖先沿不同的分支進(jìn)化而來，但他們都遵循中心法則(central dogma)，遺傳編碼規(guī)則沒有改變。圖4 遺傳密碼表圖5 中心法則1.4 基因作為DNA片段，可在體外進(jìn)行人工裁剪、修飾和連接有許多類型的工具酶可以完成這些操作：限制酶：超過300多種，比如EcoRI、HindIII等等。PCR相關(guān)的酶：如非校正性的Taq DNA聚合酶，校正性的pfu DNA聚合酶等等。核酸修飾及其它酶類：比如Klenow大片斷酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)、DNase、RNase A、堿性磷酸酶、甲基化酶、多核苷酸激酶等等。通過使用這些酶，我們可以對核酸分子進(jìn)行剪切

9、、消化、連接、末端修飾、磷酸基團(tuán)處理、反轉(zhuǎn)錄等操作，以便于克隆目標(biāo)基因或形成重組DNA分子。請注意分子克隆中所使用的幾乎所有的限制酶(II型限制酶)均識別回文結(jié)構(gòu)(palindrome structure)圖6 限制酶工作原理和酶切末端類型1.5 基因作為DNA片段，可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)從任一生物向目標(biāo)生物的轉(zhuǎn)化基因操作中，基因可通過質(zhì)?；虿《据d體或不需要載體，導(dǎo)入目標(biāo)生物，現(xiàn)在外源DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染已經(jīng)比較成熟。被轉(zhuǎn)入來自水母的綠色熒光蛋白(acaleph green fluorescence protein)基因該項(xiàng)工作由法國科學(xué)家于2000年完成。 外源基因與載體一道被采用受精卵微注射

10、法導(dǎo)入并整合到兔子基因組中。圖7 轉(zhuǎn)基因熒光兔子中科院昆明動(dòng)物研究所，2010/news/tech/2010-11-11/106755.html圖8 轉(zhuǎn)基因熒光猴子1.6 轉(zhuǎn)基因遵循同內(nèi)源基因一樣的遺傳規(guī)律，可通過DNA復(fù)制將其遺傳信息傳遞給子代基因工程的外源基因可整合進(jìn)目標(biāo)生物的基因組中穩(wěn)定遺傳。DNA的半保留復(fù)制模式是高保真的。圖9 DNA復(fù)制和細(xì)胞遺傳原理1.7 轉(zhuǎn)基因遵循同內(nèi)源基因一樣的表達(dá)規(guī)則，其表達(dá)可賦予特定的生物學(xué)功能傳統(tǒng)概念： 一個(gè)基因，一個(gè)酶； 一個(gè)基因，一個(gè)蛋白； 一個(gè)基因，一個(gè)多肽鏈。現(xiàn)代概念： 一個(gè)基因，一個(gè)性狀； 一個(gè)基因，多個(gè)性狀； 多個(gè)基因，一個(gè)性狀。圖10 單堿

11、基突變引起蛋白功能和性狀改變：以鐮刀型貧血為例狹義概念：現(xiàn)在遺傳工程的概念主要是指基因工程或基因操作，是指將供體生物的目標(biāo)基因與載體進(jìn)行重組，重組DNA分子導(dǎo)入受體生物體，通過表達(dá)外源基因而使受體生物產(chǎn)生新型遺傳性狀?；蚬こ痰娜兀汗w，受體和載體。對于受體物種而言，來自供體的基因被稱為“外源基因”?；蚬こ痰母炯夹g(shù)是DNA重組技術(shù)。這是因?yàn)槌贁?shù)RNA病毒外，所有基因均是以DNA分子的形式存在的，載體也是DNA分子，基因?qū)爰夹g(shù)一般已程序化，但目標(biāo)性狀根本地是由各種外源基因和DNA重組技術(shù)而決定的。轉(zhuǎn)基因：作動(dòng)詞時(shí)表示將人工構(gòu)建的外源基因轉(zhuǎn)化到生物體的過程，作名詞時(shí)表示被轉(zhuǎn)化到生物體中

12、的外源基因。外源基因：指基因工程中被轉(zhuǎn)入到生物體中的基因構(gòu)建物，可以是其它生物的基因，也可以是受體生物本身的基因?！巴庠础敝饕侵皋D(zhuǎn)入的過程，被轉(zhuǎn)入的基因不一定非得來自不同的物種。2 植物基因工程的概念和目標(biāo)廣義概念：指DNA重組技術(shù)，以及相關(guān)的基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的開發(fā)，典型而言包括“上游技術(shù)”、“中游技術(shù)”和“下游技術(shù)”。上游技術(shù)：包括目標(biāo)基因和其它DNA元件的鑒定、定位、克隆和功能驗(yàn)證。上游是獲得知識產(chǎn)權(quán)的制高點(diǎn)。中游技術(shù)：包括載體構(gòu)建、工程菌株的獲得、轉(zhuǎn)化操作、轉(zhuǎn)化后的組織培養(yǎng)、再生個(gè)體的分子鑒定、轉(zhuǎn)化子的遺傳及繁殖、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)性狀檢測等。中游是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的核心步驟。下游技術(shù)：包括轉(zhuǎn)

13、基因產(chǎn)品的中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)和產(chǎn)業(yè)化，如從轉(zhuǎn)化體內(nèi)純化外源基因產(chǎn)物、推廣種植或養(yǎng)殖具有新型性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等。下游是轉(zhuǎn)基因的價(jià)值的體現(xiàn)。在現(xiàn)代，基因工程與細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和酶工程可以實(shí)現(xiàn)聯(lián)合和互相促進(jìn)。3.1 抗蟲基因 1)Bt基因：來自于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的一大類，均編碼殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，又稱為內(nèi)毒素(-endotoxin)，能特異性殺死鱗翅目(Lepidoptera，蝶蛾類)昆蟲，少數(shù)能殺死雙翅目(Diptera，蠅蚊類)和鞘翅目(Coleoptera，甲蟲類)

14、。人工培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌制備的Bt制劑在植保上用于作物蟲害防治已有近百年的時(shí)間，實(shí)踐證明Bt蛋白對人畜無害。Bt基因已廣泛應(yīng)用于多種作物的抗蟲轉(zhuǎn)基因，防治棉鈴蟲、紅鈴蟲、玉米螟、水稻螟蟲、菜青蟲等，但須注意它也能殺死鱗翅目的益蟲如家蠶。3 植物基因工程的性狀和基因圖11 轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的抗棉鈴蟲效果 棉鈴蟲 轉(zhuǎn)基因棉花 非轉(zhuǎn)基因棉花2)PI基因：來自于各種植物本身，編碼蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor)，對許多昆蟲具有廣譜抗性， 可分為絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitor)、巰基蛋白酶抑制劑(sulfhydryl proteinas

15、e inhibitor)和金屬蛋白酶抑制劑(metal proteinase inhibitor)這三類。代表性的有豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CPTI，未發(fā)現(xiàn)對人畜有害。3)凝集素(Lectin)基因：來自于各種植物，編碼凝集素，主要用于防治同翅目(Homoptera)害蟲如蚜蟲、飛虱等。有的凝集素對人畜有毒，但目前使用的來自5個(gè)單子葉植物科的甘露糖結(jié)合型凝集素等被證明對人畜無毒。4)-AI基因：來自于植物，編碼-淀粉酶抑制劑，可防治鞘翅目(Coleoptera)害蟲，但許多也能抑制哺乳動(dòng)物的-淀粉酶。5)其它基因：如幾丁質(zhì)酶、蝎毒素(scorpion toxin)、苦楝素(azedarachin

16、)、魚藤酮(rotenone) 等基因，有的有前景，有的則存在安全性問題。3.2 抗病基因 1)抗病毒?。河胁《就鈿さ鞍?coat protein，CP)基因、病毒復(fù)制酶(replicase)基因、病毒衛(wèi)星RNA基因、植物或真菌核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)基因、動(dòng)物干擾素基因、病毒缺陷干擾(defective interfering，DI)基因等。一些轉(zhuǎn)CP基因的作物已開始推廣應(yīng)用。 圖12 轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白基因提高了木瓜抗環(huán)斑病毒的能力轉(zhuǎn)基因非轉(zhuǎn)基因2)抗真菌?。河锌共』?resistance genes，R基因)、多聚半乳糖醛酸酶抑制

17、蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP)基因、抗病信號傳導(dǎo)基因、防衛(wèi)基因如病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein，PR)、葡萄糖氧化酶基因等。一些轉(zhuǎn)基因抗真菌病作物在西方國家已經(jīng)開始推廣種植。3)抗細(xì)菌?。河锌共』?resistance genes，R基因)、抗病信號傳導(dǎo)基因、防衛(wèi)基因如病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein，PR)、昆蟲抗菌肽基因、溶菌酶基因等。一些轉(zhuǎn)基因抗細(xì)菌病作物也在西方國家已經(jīng)開始推廣種植。4)抗線蟲?。嚎共』?resistance genes，R基因)

18、、抗病信號傳導(dǎo)基因、防衛(wèi)基因如病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein，PR)基因等。轉(zhuǎn)基因抗病農(nóng)作物幾乎不存在食品安全性問題。3.3 耐非生物性脅迫的基因1)耐高溫和干旱：主要為滲透調(diào)節(jié)基因，如脯氨酸合成酶、甜菜堿合成酶等基因，還有熱休克蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。2)耐冷耐凍：一類是保持低溫下生物膜流動(dòng)性，如脂肪酸脫飽和酶；另一類是抗胞內(nèi)結(jié)冰，如深海鰈魚和胡蘿卜的抗冷蛋白。 3)耐鹽：如藻類和高等植物的液泡Na+/H+反向泵基因等。 4)耐缺素：對于缺氮、缺磷、缺鉀、缺硼、缺鉬、缺鋅等，可以利用這些元素的高效吸收或高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。5)耐土壤毒害：與重金屬(如汞、鎘、鉛

19、等)、輕元素毒素(如鋁、砷)及其它毒素(如硫化氫等)結(jié)合使之無效化的基因，如金屬硫蛋白。6)耐氧化還原電位脅迫：耐缺氧基因、耐自由基脅迫基因、耐pH值脅迫基因等。27圖13 上?？萍拣^展示的轉(zhuǎn)基因耐鹽植物，用海水澆灌/blog-293156-467960.html3.4 品質(zhì)改良基因 1)貯藏蛋白基因：來自大豆、巴西堅(jiān)果等植物的種子貯藏蛋白。2)氨基酸改良基因：如富賴氨酸蛋白，主要用于禾谷類作物如玉米等蛋白中氨基酸比例的改良，還有富甲硫氨酸蛋白等。 3)維生素改良基因：如將細(xì)菌的3個(gè)關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入水稻，創(chuàng)造了胚乳中富含-胡蘿卜素的“金色稻”。維生素E合成途徑的基因可用于提高植物油中的VE。4)

20、脂肪酸改良基因：一類是關(guān)于脂肪酸合成，另一類是關(guān)于脂肪酸脫飽和，用于增加含油量，增加或減少某種脂肪酸，增加或減少脂肪酸的飽和度，甚至生產(chǎn)極具醫(yī)療保健價(jià)值的特殊脂肪酸，如GLA、ALA、DHA、EPA等PUFA。5)其它品質(zhì)改良基因：比如棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因、植物淀粉合成酶/分支酶基因、植物香氣物質(zhì)合成途徑的基因、植物單寧合成途徑的基因等。 圖14 富含-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因“金色稻”三個(gè)基因分別是：八氫番茄紅素合成酶基因(psy, phytoene synthase)、八氫番茄紅素脫飽和酶基因(crtI, bacterial phytoene desaturase)和番茄紅素-環(huán)化酶基因(lcy

21、, lycopene -cyclase)。 非轉(zhuǎn)基因米 第一代轉(zhuǎn)基因金色米 非轉(zhuǎn)基因米 第二代轉(zhuǎn)基因金色米3.5 作物產(chǎn)量改良基因1)“開源”基因：增強(qiáng)植物葉片的光合作用效率的基因、根瘤菌基因工程。2)“擴(kuò)庫”基因：植物果實(shí)、種子等經(jīng)濟(jì)器官發(fā)育相關(guān)的基因。 3)“暢流”基因：植物維管束發(fā)育及維管裝載相關(guān)的基因。作物的產(chǎn)量是最重要的性狀，卻是一個(gè)典型的多基因性狀，基因工程操作的難度最大，目前研究得并不多，有待于突破。3.6 抗除草劑基因1)修飾除草劑靶蛋白的基因：EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)

22、基因：超表達(dá)或突變型能抗草甘膦(glyphosate)類除草劑如農(nóng)達(dá)等，這是抗除草劑基因工程應(yīng)用最廣泛的。ALS(Acetolactate synthase，乙酰乳酸合成酶)基因：該基因點(diǎn)突變后可抗甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)和氯磺隆(chlorsulfuron)。psbA基因：屬于光系統(tǒng)II，點(diǎn)突變后可抗阿特拉津(atrazine)。2)除草劑解毒的基因：乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Acetyl CoA transferase)基因：可使膦絲菌素(phosphinothricin, PPT，草丁膦Basta的有效成分)失活。羥化酶：是一些腈水解酶，可抗溴苯腈(bromoxyril

23、)。SOD (superoxide dismutase, 超氧化物歧化酶)基因：過量表達(dá)可抗百草枯(paraquat)。圖15 轉(zhuǎn)基因抗除草劑小麥的田間試驗(yàn)非轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因3.7 用于醫(yī)療保健生物活性物質(zhì)基因工程的基因1)用于超量表達(dá)植物藥化成分的基因：主要是與植物藥化成分合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因或調(diào)控基因，涉及各種植物中的各種各樣的次生代謝途徑，比如：皂甙（人參、三七）、紫杉醇（紅豆杉）、長春新堿（長春花）、喜樹堿（喜樹）、丹酚酸（丹參）、東莨菪堿（莨菪）、類黃酮（超級大類物質(zhì)，包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、花青素苷、原花青素等類型，植物界廣泛存在，但異黃酮主存于豆科）、蘿卜硫素（十字花科，特別是椰菜

24、）等。2)基于植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白的基因：如可以將人的干擾素、胰島素、疾病抗體及其它藥物蛋白基因，在植物中表達(dá)和生產(chǎn)藥用蛋白。3)其它生物活性物質(zhì)相關(guān)的基因：如用于生產(chǎn)化妝品原料的保健蛋白或酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、金屬硫蛋白基因等。圖16 操作花青素苷代謝途徑的轉(zhuǎn)基因保健食品番茄花青素苷具有抗氧化及清除自由基的生物活性/bioindustry/agriculture/447936.shtml圖17 操作類胡蘿卜途徑的產(chǎn)蝦青素轉(zhuǎn)基因番茄，可作保健食品或用于提取蝦青素蝦青素是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化生物活性物質(zhì)，其抗氧化活性是番茄紅素的500倍/eng/newsletters/2012/

25、201204/t20120423_93829.htm3.8 用于改良植物其它性狀的基因1)改良作物成熟期的基因：比如對CCC等基因進(jìn)行超表達(dá)或沉默，可以調(diào)控植物的成熟激素乙烯的合成，進(jìn)而調(diào)控成熟期。 2)調(diào)節(jié)作物株型的基因：如調(diào)控側(cè)向生長、決定分蘗發(fā)生、葉生長速度等的基因。3)作物貯藏品質(zhì)相關(guān)的基因：如轉(zhuǎn)化PGIP基因或反義PG基因的番茄等可以使果實(shí)熟而不爛，延長貨架期，1994年美國已開始上市。4)植物花色修飾基因：主要為類黃酮、類胡蘿卜素代謝途徑的基因，最典型的成就是近年來通過基因工程將紅色的玫瑰變?yōu)榱怂{(lán)色的玫瑰。5)植物種子、果實(shí)或其它器官形態(tài)發(fā)育相關(guān)的基因：如番茄的大小果發(fā)育基因、花形

26、態(tài)發(fā)育基因等。圖18 轉(zhuǎn)反義果膠酶基因等策略可大大延長果實(shí)的貨架期，最早于1994年在美國上市圖19 番茄的果實(shí)大小由幾個(gè)關(guān)鍵基因共同決定圖20 轉(zhuǎn)F35H基因創(chuàng)造藍(lán)色玫瑰非轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)基因 上市轉(zhuǎn)基因4 植物基因工程的載體和其它DNA元件4.1 根據(jù)載體生物特性的載體分類1)Ti質(zhì)粒：來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。2)Ri質(zhì)粒：來自發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。3)病毒：植物病毒。4.2 根據(jù)功能進(jìn)行的載體分類1)克隆載體：用于克隆目標(biāo)基因進(jìn)行測序等。2)中間載體：用于裝載T-DNA區(qū)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、標(biāo)記基因等

27、元件。3)卸甲載體：將誘導(dǎo)植物長瘤或長發(fā)狀根的基因去除以后的Ti或Ri質(zhì)粒。4)轉(zhuǎn)化/工程載體：用于直接轉(zhuǎn)化植物，分為共整合載體和二元載體兩類。4.3 啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子1)組成型表達(dá)啟動(dòng)子：最典型的如蕪菁花葉病毒的CaMV 35S。2)器官/組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子：只在特定的目標(biāo)器官/組織中表達(dá)外源基因，如棉花纖維發(fā)育的E6啟動(dòng)子、番茄果實(shí)特異表達(dá)的E8啟動(dòng)子、油菜種籽特異表達(dá)的Napin啟動(dòng)子等。3)發(fā)育階段調(diào)控型啟動(dòng)子：只在一些特定器官/組織分化發(fā)育的特定階段表達(dá)，比如PG啟動(dòng)子只在植物果實(shí)成熟階段表達(dá)。4)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：在適當(dāng)劑量的外源物質(zhì)的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因才表達(dá)。5)終止子：有NOS、

28、OCS、35S等。6)增強(qiáng)子：比如元件等，可以增加外源基因的表達(dá)強(qiáng)度。4.4 標(biāo)記基因和報(bào)告基因1)標(biāo)記基因：抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于具有抗性而繼續(xù)生長和分裂，達(dá)到篩選轉(zhuǎn)化子的效果。典型的有：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NptII：抗卡那霉素、新霉素等，用于雙葉子葉植物比單子葉植物多。潮霉素基因Hyg：抗潮霉素，用于單子葉植物比雙子葉植物多。草丁膦抗性基因bar：抗除草劑草丁膦、草銨膦等，單、雙子葉植物均可用。新型標(biāo)記基因：已新開發(fā)出了磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因pmi、甜菜堿乙醛脫氫酶基因badh等多種，但商品轉(zhuǎn)基因食品中尚不含有。2)報(bào)告基因：用于對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行肉眼可見的表型鑒定，最典型的有：-

29、葡萄糖苷酸酶基因(-glucuronidase, gus) 基因：加底物X-gluc后，轉(zhuǎn)基因組織產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, gfp)基因：在紫外光下，轉(zhuǎn)基因組織發(fā)出綠色熒光。5 植物基因工程的基本路線5.1 從供體生物分離克隆目標(biāo)基因 1) 目標(biāo)基因的遺傳學(xué)研究、分子標(biāo)記定位，或目標(biāo)基因編碼蛋白的純化與測序；2) 構(gòu)建基因組或cDNA文庫；3) 獲得目標(biāo)基因的探針或引物信息；4) 標(biāo)記探針，篩選文庫獲得目標(biāo)基因，或直接通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因；5) 目標(biāo)基因克隆到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，目標(biāo)基因的測序和分析；6) 目標(biāo)基因及其編碼蛋白的進(jìn)

30、一步功能驗(yàn)證和分子鑒定。圖21 基因測序圖譜5.2 構(gòu)建工程載體1) 采用特定的限制酶切割，從克隆載體上切下并回收目標(biāo)基因；2) 選取合適的轉(zhuǎn)基因骨架載體，并完成啟動(dòng)子、終止子等元件的亞克隆裝載； 3) 采用相同的限制酶切割骨架載體，使其末端與目標(biāo)基因的末端相匹配；4) 將目標(biāo)基因與骨架載體進(jìn)行連接，形成重組表達(dá)載體。圖22 郭三堆等人構(gòu)建的Bt+CpTI雙價(jià)殺蟲基因植物表達(dá)載體5.3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌和重組載體的分子鑒定1) 制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；2) 將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；3) 通過抗生素篩選獲得大腸桿菌的轉(zhuǎn)化子菌落；4) 通過藍(lán)白斑篩選初步獲得重組載體而非空載體的克隆子；5) 通過PCR

31、、限制酶切圖譜分析、測序驗(yàn)證等，確認(rèn)重組載體克隆子。圖23 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.4 獲得農(nóng)桿菌工程菌株及植物轉(zhuǎn)化圖24 農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化植物的原理1) 從大腸桿菌中抽提工程載體的質(zhì)?；虿《綝NA；2) 將工程載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌或病毒外殼蛋白中；3) 一般采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的二元載體轉(zhuǎn)化法，將含有目標(biāo)基因的T-DNA片段導(dǎo)入受體植物細(xì)胞中，并整合到其染色體上。4) 或采用基因槍微粒轟擊法，直接將含有目標(biāo)基因的DNA轉(zhuǎn)化受體植物的器官。5) 或采用病毒接種侵染方式，將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化受體植物的活體植株。6) 針對標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，通過組織培養(yǎng)獲得再生植株，或收獲活體轉(zhuǎn)化母株上的種子。圖25 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化油菜下胚

32、軸圖26 油菜轉(zhuǎn)化后再生出小芽圖27 誘導(dǎo)油菜再生苗生根5.5 鑒定和篩選轉(zhuǎn)基因植株1) 對再生植株進(jìn)行分子鑒定，如PCR擴(kuò)增、GUS染色或GFP熒光檢測和Southern雜交檢測，得到確認(rèn)外源基因轉(zhuǎn)入并整合的陽性植株；2) 對陽性植株進(jìn)行RT-PCR、Northern雜交、Western雜交等檢測，得到外源基因高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株；2) 對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生物學(xué)鑒定與檢測，確認(rèn)背景性狀是否改變和目標(biāo)性狀的改良程度，選擇和保留最符合要求的轉(zhuǎn)基因植株；4) 繁殖轉(zhuǎn)基因植株，并跟蹤進(jìn)行分子檢測和生物學(xué)檢測，獲得目標(biāo)性狀和背景性狀均穩(wěn)定遺傳的株系。圖28 轉(zhuǎn)基因油菜的GUS染色 轉(zhuǎn)基因 非轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)

33、基因 非轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)基因圖29 轉(zhuǎn)基因油菜的PCR檢測圖30 轉(zhuǎn)基因改良油菜種皮色澤5.6 轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價(jià)和產(chǎn)業(yè)化1) 中間試驗(yàn)：向國家申請，在控制系統(tǒng)內(nèi)或者控制條件下進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)，并取得合格。2) 環(huán)境釋放：向國家申請，在自然條件下采取相應(yīng)安全措施進(jìn)行中規(guī)模的試驗(yàn)，并取得合格。3) 生產(chǎn)性試驗(yàn)：向國家申請，在生產(chǎn)和應(yīng)用前進(jìn)行較大規(guī)模的試驗(yàn)，最終取得安全證書。4) 大規(guī)模推廣種植轉(zhuǎn)基因植物。圖31 轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜的化學(xué)除草三 轉(zhuǎn)基因植物安全性等的釋疑(一)食品安全性問題1、外源基因DNA作為食品成分的安全性問題：不存在所有生物的DNA分子具有相同的化學(xué)屬性，我們每天都隨食物吃進(jìn)各種

34、基因的DNA。外源DNA在人的唾液中只能存活20分鐘，在人的胃里只能存活8秒鐘，在進(jìn)入人體消化道后DNA就被降解成無遺傳活性的單個(gè)堿基、磷酸和戊糖，它們是人的營養(yǎng)素而無害。2、目標(biāo)基因表達(dá)蛋白本身的安全性問題：視具體基因而論研究表明，目前已商業(yè)化的Bt等基因編碼的蛋白本身對人畜安全，生食、熟食都無害。有些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品要正確食用，比如轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因的食品熟食無害，但不宜大量生食。如果一個(gè)基因編碼的蛋白的確對人有害，則不會(huì)通過安全性評價(jià)，也不會(huì)走向市場。3、外源基因是否會(huì)干擾轉(zhuǎn)基因植物的代謝：具體分析如果外源基因使植物本身的成分含量上升或下降，可能表現(xiàn)為內(nèi)在品質(zhì)的變好或變差。如

35、果由于外源基因的引入而新產(chǎn)生對人體有益的成分，則是好事。如果由于外源基因的引入而新產(chǎn)生對人體有害的成分，則不安全。如果由于外源基因的引入而新產(chǎn)生對人體中性的成分，不存在食品安全性問題，但要考慮是否會(huì)降低產(chǎn)量或其它品質(zhì)成分。目前已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因尚未發(fā)現(xiàn)因干擾植物代謝而產(chǎn)生安全性問題。4、標(biāo)記基因和報(bào)告基因的食品安全性問題：放心食用，未來更放心研究表明，目前商業(yè)化的標(biāo)記基因(如Npt)和報(bào)告基因(如gus)等編碼的蛋白及其在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的代謝產(chǎn)物對人是無害的。還沒有被充分研究肯定的標(biāo)記基因和報(bào)告基因沒有機(jī)會(huì)走向市場。目前世界上及我國已經(jīng)成功開發(fā)了多種確定無害的標(biāo)記基因和報(bào)告基因，以及標(biāo)記基因和報(bào)

36、告基因在植物體內(nèi)自動(dòng)刪除的技術(shù)系統(tǒng)，為新一代轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性提供了保障。(二)其它健康安全性問題抗生素抗性基因是否會(huì)形成人體的抗藥性：風(fēng)險(xiǎn)基本不存在一是轉(zhuǎn)基因食物在消化時(shí)，這些基因的核酸鏈會(huì)被消化分解。二是即使有完整基因進(jìn)入吸收道，人體也沒有吸收DNA大分子的機(jī)理，因此不可能進(jìn)入人體細(xì)胞，更不可能整合到我們的染色體中。三是轉(zhuǎn)到植物中的抗生素抗性基因是受植物啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，即使它們完整地進(jìn)入腸道細(xì)菌中也不會(huì)表達(dá)，就不會(huì)使人產(chǎn)生抗藥性。 唯一的可能性是進(jìn)入腸道的完整基因與腸道細(xì)菌體內(nèi)的相似基因發(fā)生同源交換，交換后要保證抗生素抗性基因仍然具有完整編碼蛋白的能力，同時(shí)又要將它的植物啟動(dòng)子交換掉，而在距

37、離上恰到好處地接上一個(gè)完整的細(xì)菌啟動(dòng)子，這幾乎不可能，迄今未見報(bào)道。(三)環(huán)境安全性問題1、是否會(huì)形成抗除草劑雜草：有可能，需嚴(yán)格管理轉(zhuǎn)基因植物1)如果轉(zhuǎn)基因作物有性繁殖，且附近存在可有性雜交的近緣作物和近緣雜草：則抗除草劑基因可能會(huì)通過花粉傳播途徑從目標(biāo)作物(近緣作物)近緣雜草，因?yàn)榛蚱贫a(chǎn)生抗除草劑雜草，用該除草劑就不能殺死該雜草。2)如果轉(zhuǎn)基因作物有性繁殖，但本地沒有可雜交的近緣物種：不存在基因漂移，如在我國種植轉(zhuǎn)基因棉花。3)如果轉(zhuǎn)基因作物為純營養(yǎng)繁殖且基本不開花：不存在基因漂移，如種植轉(zhuǎn)基因甘薯。4)美國等國完全依賴于化學(xué)除草，大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物，則可能會(huì)產(chǎn)生抗除草劑雜

38、草，但換一種其它原理的除草劑就以輕松將其殺死。2、是否會(huì)形成超級細(xì)菌：幾乎不可能，但取決于科學(xué)家的道德除非科學(xué)家喪失道德，故意通過DNA重組技術(shù)制造超級細(xì)菌，否則在自然界不太可能產(chǎn)生對人威脅極大的超級細(xì)菌?；蚬こ趟玫募?xì)菌和載體都是人工改造了的，已經(jīng)把它們可能的風(fēng)險(xiǎn)降到了最低。比如，基因工程所用的大腸桿菌是限制修飾缺陷型和重組缺陷型，并且在非實(shí)驗(yàn)環(huán)境下很快死亡。3、是否會(huì)打破生態(tài)鏈的自然平衡：有可能改變一些小食物鏈，應(yīng)認(rèn)真研究，但也不必過于擔(dān)心種植轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗病作物，可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)的病蟲害種群密度改變，無法估計(jì)是好還是壞、對生態(tài)平衡的影響是大還是小，需要追蹤研究。自然界本來就是動(dòng)態(tài)演化的，

39、從來都不是靜止的，每年要滅絕上千種生物，也有新的物種產(chǎn)生，古之滄海，今之桑田，所以食物鏈變化不一定就必然帶來災(zāi)難，需要實(shí)事求是地評價(jià)。大斑蝶事件 Bt基因可以針對性地殺死害蟲，而不會(huì)影響其他昆蟲和哺乳動(dòng)物，但有人擔(dān)心轉(zhuǎn)基因花粉飄落到周圍的雜草上后，會(huì)不會(huì)殺死其他昆蟲，如大斑蝶。從1999年起連續(xù)3年，美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)組織昆蟲專家在美國和加拿大對大斑蝶進(jìn)行了跟蹤研究，結(jié)論是轉(zhuǎn)基因植物的花粉在田間對大斑蝶沒有威脅。美國環(huán)境保護(hù)局指出，評價(jià)轉(zhuǎn)基因植物對非目的昆蟲(非靶昆蟲)的影響，應(yīng)該以野外實(shí)驗(yàn)為主，而不能僅僅依靠實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)。加拿大“超級雜草”事件由于基因漂移，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油

40、菜植株可抗1種、2種甚至于3種除草劑，因而有人驚呼出現(xiàn)了“超級雜草”。事實(shí)上，這種油菜可被2,4-D除草劑全部殺死。精確地講，“超級雜草”并非科學(xué)術(shù)語，目前也并無證據(jù)證明存在所謂的“超級雜草”。同時(shí)，基因漂移有生命以來就存在于自然界，而并非始于轉(zhuǎn)基因植物，如果沒有基因漂移，就不會(huì)有進(jìn)化，世界上也不會(huì)有這么豐富的物種和作物品種。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營養(yǎng)工程學(xué)院院長羅云波教授說：“轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)雜交育種技術(shù)雖然方法不同，但本質(zhì)是一樣的，都是在原有物種的基礎(chǔ)上對遺傳基因進(jìn)行改造，只不過基因工程改造更為精確、更有預(yù)見性、效率更高，在嚴(yán)格控制下，好的、有用的基因被植入，壞的、無用的基因被刪除，來源清楚、

41、結(jié)構(gòu)明確、數(shù)量有限，可以監(jiān)控，比常規(guī)雜交育種更能保證安全性?！?四)倫理道德問題跨越物種的基因交換與倫理道德問題：不是問題的問題1)自然界本來就廣泛發(fā)生著跨越物種的基因交換，比如馬與驢雜交，白菜與與甘藍(lán)雜交等。現(xiàn)在的常規(guī)育種經(jīng)常采用種間甚至屬間雜交來交換遺傳物質(zhì)和有用基因，達(dá)到育成新品種的目的，如海島棉與陸地棉的雜交、水稻與野生稻的雜交等。2)基因工程與雜交育種一樣，只是實(shí)現(xiàn)了跨越物種間的遺傳物質(zhì)交換，只不過傳統(tǒng)育種是同時(shí)交換整個(gè)基因組，一次交換的是成千上萬的基因，而基因工程一次交換的只是一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)特定基因而已，但它們遵循的生物學(xué)法則是一樣的。3)在植物中表達(dá)微生物或動(dòng)物的單個(gè)基因，并沒有

42、改變種性，只是改良了單個(gè)性狀，并沒有人們大塊吃動(dòng)物的肉這樣殘忍。(五)生物技術(shù)的國際競爭問題1)科學(xué)無國界，但技術(shù)有國界、科學(xué)家有國界：科學(xué)家所做的一切研究直接或間接地與所在國家的命運(yùn)聯(lián)系在一起，當(dāng)前的國際競爭激烈，國際間的技術(shù)封鎖也很激烈。2)生物技術(shù)是國際競爭與封鎖的焦點(diǎn)領(lǐng)域之一：生物技術(shù)是國家賴以發(fā)展的尖端技術(shù)之一，發(fā)達(dá)國家對發(fā)展中國家采取了封閉態(tài)度，發(fā)展中國家只有靠自己的力量來發(fā)展生物技術(shù)，必須加快速度，主動(dòng)參與國際競爭，避免受制于人。3)基因?qū)＠夯蚬こ痰暮诵闹R產(chǎn)權(quán)在于基因本身，有用的基因和DNA元件是有限的，美國等發(fā)達(dá)國家率先將重要的功能基因和基因操作技術(shù)研發(fā)并專利化，后來者將

43、十分不利。4)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的反思：我國每年進(jìn)口大量的轉(zhuǎn)基因油菜、大豆、玉米、棉花，國人在不知不覺中消費(fèi)大量轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的同時(shí)，卻對轉(zhuǎn)基因不能正確地理解，甚至對國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)業(yè)化采取過嚴(yán)的限制。這種諷刺性現(xiàn)象不利于我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的成長。(六)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的貿(mào)易壁壘問題政治、經(jīng)濟(jì)、文化、技術(shù)都可以作為貿(mào)易壁壘：通過限制轉(zhuǎn)基因出口，可限制技術(shù)的輸出與流失。通過限制轉(zhuǎn)基因進(jìn)口，可限制國內(nèi)市場被國外公司所占領(lǐng)，這時(shí)就可以給外國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貼上一個(gè)“有害”的標(biāo)簽，即技術(shù)標(biāo)簽是經(jīng)濟(jì)行為的借口。90年代末美歐轉(zhuǎn)基因作物貿(mào)易摩擦：安全性借口后面的市場壁壘。(七)來自競爭性產(chǎn)業(yè)和社會(huì)人士的反對原因產(chǎn)業(yè)競爭：與轉(zhuǎn)基

44、因產(chǎn)業(yè)存在競爭或?qū)?huì)被轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)所取代的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)從業(yè)人員，出于商業(yè)利益競爭的驅(qū)動(dòng)，會(huì)惡意污蔑和攻擊轉(zhuǎn)基因這一新生產(chǎn)業(yè)。保守派反對轉(zhuǎn)基因的原因：對上帝造物意志的改變。極端環(huán)境主義者反對轉(zhuǎn)基因的原因：環(huán)境“科學(xué)家”的誤導(dǎo)。老百姓對轉(zhuǎn)基因的擔(dān)心：來自于不了解。(八)國際上對轉(zhuǎn)基因食品的認(rèn)定辦法：實(shí)質(zhì)等同性原則實(shí)質(zhì)等同性原則是目前評價(jià)轉(zhuǎn)基因食品安全性最基本的原則。 在1996年FAO/WHO召開的第二次生物技術(shù)安全性評價(jià)專家咨詢會(huì)議，將轉(zhuǎn)基因植物、動(dòng)物、微生物產(chǎn)生的食品分為3類：A.與現(xiàn)有食品及食品成分具有完全實(shí)質(zhì)等同性，等同對待。 B.與現(xiàn)有食品及成分具有實(shí)質(zhì)等同性，但存在某些特定差異。這種差異包括

45、：引入的遺傳物質(zhì)是編碼一種蛋白質(zhì)還是多種蛋白質(zhì)，是否產(chǎn)生其他物質(zhì)。是否改變內(nèi)源成分或產(chǎn)生新的化合物。新食品的安全性評價(jià)主要考慮外源基因的產(chǎn)物與功能，包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、特異性食用歷史等。主要針對一些可能存在的差異和主要營養(yǎng)成分進(jìn)行比較分析。目前，經(jīng)過比較的轉(zhuǎn)基因食品大多屬于這種情況。C.與現(xiàn)有食品無實(shí)質(zhì)等同性。這并不意味著它一定不安全，但必須客觀評價(jià)和明確這種食品的安全性和營養(yǎng)性營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子是轉(zhuǎn)基因食品安全性評價(jià)的重要部分。轉(zhuǎn)基因食品的過敏性評價(jià)是安全評價(jià)的另一個(gè)重要方面。在對轉(zhuǎn)基因食品安全性進(jìn)行評價(jià)時(shí)，還要考慮抗生素抗性標(biāo)記基因的安全性、外源基因插入而導(dǎo)致的非期望效應(yīng)、加工過程對

46、食品營養(yǎng)和安全性的影響等方面。 進(jìn)行轉(zhuǎn)基因食品安全性評價(jià)時(shí)遵循以下原則：實(shí)質(zhì)等同性原則、預(yù)先防范原則、個(gè)案評估原則、逐步評估的原則、風(fēng)險(xiǎn)效益平衡的原則、熟悉性原則。包括中國在內(nèi)的許多國家設(shè)立了專門的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性檢測中心，按上述原則對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行逐個(gè)檢測和授證釋放。(九)新型安全標(biāo)記基因和無標(biāo)記技術(shù)提供了更好的安全保障1、新型安全標(biāo)記基因：有很多，下面介紹幾種典型原理和基因：1)解毒存活篩選，標(biāo)記基因編碼解毒酶(如甜菜堿乙醛脫氫酶BADH)：badh基因來自藜科植物。轉(zhuǎn)化篩選中，培養(yǎng)基中加入甜菜堿醛，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞被殺死，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞中產(chǎn)生的BADH能催化甜菜堿醛轉(zhuǎn)化為甜菜堿，它不但無害，而且有

47、助于提高作物的耐旱性。2)營養(yǎng)限制篩選，標(biāo)記基因編碼營養(yǎng)代謝關(guān)鍵酶(如磷酸甘露糖異構(gòu)酶PMI)：pmi基因來自大腸桿菌。正常的植物細(xì)胞不能利用甘露糖。轉(zhuǎn)化篩選中，培養(yǎng)基中加入甘露糖而限制其它糖源，轉(zhuǎn)化細(xì)胞因能將甘露糖轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸作為糖源而正常生長，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞受糖源限制而受到抑制。3)葉綠素合成篩選，標(biāo)記基因編碼突變型的葉綠素合成關(guān)鍵酶(如谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶GSAAT)：突變型GSAAT基因來自植物，通過篩選獲得。轉(zhuǎn)化篩選中，培養(yǎng)基中加入正常型GSAAT的抑制劑Gabaculine，轉(zhuǎn)化細(xì)胞因不受它的抑制而正常生長，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞受抑制。4)氨基酸限制篩選，標(biāo)記基因編碼特殊的氨基酸合

48、成關(guān)鍵酶(如天冬氨酸激酶AK)：AK基因來自細(xì)菌。轉(zhuǎn)化篩選中，培養(yǎng)基中加入賴氨酸，轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有細(xì)菌型AK，它不受賴氨酸的反饋抑制，正常合成支鏈氨基酸，細(xì)胞生長正常，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞只具有植物型AK，它受賴氨酸的反饋抑制而不能合成重要的支鏈氨基酸，細(xì)胞死亡。5)形態(tài)篩選，標(biāo)記基因控制植物形態(tài)發(fā)育(如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶IPT)：ipt基因來自根癌農(nóng)桿菌。轉(zhuǎn)化篩選中，培養(yǎng)基中限制細(xì)胞分裂素，轉(zhuǎn)化細(xì)胞合成細(xì)胞分裂素并表現(xiàn)一定的形態(tài)特征，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分裂受阻。該法由于干擾植物生長發(fā)育，前景不理想。 2、無標(biāo)記基因技術(shù)：有很多，下面介紹幾種典型：1)分離刪除策略，利用共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，如雙T-DNA/單質(zhì)粒系統(tǒng)：在轉(zhuǎn)化

49、載體中構(gòu)建2個(gè)獨(dú)立的T-DNA區(qū)，一個(gè)T-DNA區(qū)裝載目標(biāo)基因，另一個(gè)T-DNA區(qū)裝載篩選/報(bào)告基因。轉(zhuǎn)化過程中，兩個(gè)T-DNA區(qū)可以同時(shí)轉(zhuǎn)化到一個(gè)細(xì)胞中，但多數(shù)情況下各自整合到不同的染色體。篩選得到的共轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行自交，目標(biāo)基因和標(biāo)記/報(bào)告基因遵循孟德爾的獨(dú)立分配規(guī)律，很容易得到只含目標(biāo)基因而不含標(biāo)記/報(bào)告基因的植株。圖32 雙T-DNA/單質(zhì)粒系統(tǒng)產(chǎn)生無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的原理轉(zhuǎn)化自交、鑒定載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株目標(biāo)后代：保留非目標(biāo)后代：淘汰目標(biāo)基因標(biāo)記基因目標(biāo)基因標(biāo)記基因目標(biāo)基因標(biāo)記基因2)重組刪除策略位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)：已開發(fā)的有來源于噬菌體P1的Cre-loxP系統(tǒng)、接合酵母SR質(zhì)粒的R/

50、RS系統(tǒng)、釀酒酵母質(zhì)粒的FLP-FRTs系統(tǒng)和噬菌體Mu的Gin-Gix系統(tǒng)，其中以Cre-loxP系統(tǒng)應(yīng)用最廣。每個(gè)系統(tǒng)均包含一個(gè)重組酶基因和一套特異性識別位點(diǎn)。經(jīng)典Cre-loxP系統(tǒng)：構(gòu)建兩個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體。第一個(gè)載體的T-DNA區(qū)中，標(biāo)記/報(bào)告基因被構(gòu)建到loxP位點(diǎn)的兩段正向重復(fù)序列之間，目的基因位于loxP的外側(cè)。第二個(gè)載體上構(gòu)建有Cre基因。兩個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植株，將兩種轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行雜交，雜交植株中Cre基因表達(dá)并合成重組酶，將標(biāo)記/報(bào)告基因刪除，只保留目標(biāo)基因。 由于組成型表達(dá)Cre酶對植物生長發(fā)育不利，后來采用誘導(dǎo)型或器官/組織特異型啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)Cre基因的表達(dá)?；?/p>

51、Cre-loxP，還可以產(chǎn)生一些更高級的構(gòu)建形式。比如，將目標(biāo)基因、標(biāo)記/報(bào)告基因、誘導(dǎo)型Cre表達(dá)盒均構(gòu)建到同一個(gè)T-DNA區(qū)內(nèi)的loxP位點(diǎn)中，則會(huì)在誘導(dǎo)條件下使所有外源基因全部刪除，類似于后面要講的“外源基因清除”技術(shù)。圖33 經(jīng)典Cre-loxP系統(tǒng)產(chǎn)生無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的原理轉(zhuǎn)化雜交載體質(zhì)粒A轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株A目標(biāo)基因標(biāo)記基因loxPloxP轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株BCre標(biāo)記基因雜交當(dāng)代自交、鑒定自交后代被切下并降解外源基因清除系統(tǒng)(Gene Deletor)：由美國康涅狄格大學(xué)的華裔科學(xué)家李義教授發(fā)明。它利用了Cre-LoxP和FLP-FRT這兩套位點(diǎn)特異重組酶系統(tǒng)，創(chuàng)造了一個(gè)lox

52、P和FRT的融合識別位點(diǎn)LF (LoxP-FRT)，將目標(biāo)基因、標(biāo)記/報(bào)告基因以及Cre/FLP基因本身均構(gòu)建到兩個(gè)LF之間，轉(zhuǎn)基因植株中的特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)FLP或者Cre在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和部位表達(dá)，重組酶識別LF并將所有外源基因按誘導(dǎo)性、器官/組織特異性或發(fā)育階段性方式從基因組中全部清除，僅殘留單側(cè)LF和T-DNA邊界等非基因序列。Cre/FLP基因的啟動(dòng)子類型是關(guān)鍵，要根據(jù)具體研究目標(biāo)來的選擇：如果采用器官/組織特異型啟動(dòng)子，如花藥、果實(shí)或種子特異型，則會(huì)在這些器官/組織中清除外源基因，其它器官/組織中得以保留。如果采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如化學(xué)誘導(dǎo)、熱誘導(dǎo)、冷誘導(dǎo)等，則可以在特定時(shí)間誘導(dǎo)處理后將所有

53、細(xì)胞中的外源基因清除。如果將目標(biāo)基因置于LF之外，僅將標(biāo)記/報(bào)告基因和Cre/FLP基因置于LF之中，則在清除標(biāo)記/報(bào)告基因和Cre/FLP基因之后，仍然會(huì)保留目標(biāo)轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)清除載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞目標(biāo)基因標(biāo)記基因LFLF被切下并降解FLP轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株：清除轉(zhuǎn)基因后發(fā)育清除圖34 外源基因清除系統(tǒng)(Gene Deletor)的原理3)其它標(biāo)記基因安全性技術(shù)：相當(dāng)多，不過均有一些缺點(diǎn)。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)：將外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體中，遵循母體遺傳，不會(huì)發(fā)生隨花粉的基因漂移事件。雄性不育技術(shù)：將雄性不育基因與目標(biāo)基因、標(biāo)記基因一道構(gòu)建到載體中并轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植株是雄性不育的，不會(huì)發(fā)生隨花粉的基因漂移事

54、件。終結(jié)者技術(shù)：將致死基因隨目標(biāo)基因、標(biāo)記基因一道構(gòu)建到載體中并轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因種子是不育的，防止外源基因隨種子傳播。同源重組去除標(biāo)記基因技術(shù)：將標(biāo)記基因構(gòu)建到重復(fù)序列之間，轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)生同源重組，將標(biāo)記基因去除。轉(zhuǎn)座子及MAT載體：利用了玉米轉(zhuǎn)座子AC-DS系統(tǒng)。將標(biāo)記基因構(gòu)建到DS元件中，AC基因采用誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，也構(gòu)建到同一T-DNA邊界中，轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行誘導(dǎo)處理，表達(dá)的AC轉(zhuǎn)座酶激活DS的轉(zhuǎn)座活性，一些植株中的DS元件及其上的標(biāo)記基因轉(zhuǎn)座到其它位置，少部分植株中則發(fā)生了DS元件及其上的標(biāo)記基因的丟失，只保留了外源目標(biāo)基因，通過鑒定而選擇出來。四 我國轉(zhuǎn)基因生物安全性法規(guī)和管理(一)、

55、我國轉(zhuǎn)基因安全性法規(guī)1、1993年12月原國家科委頒布基因工程安全管理辦法。2、1996年7月農(nóng)業(yè)部發(fā)布農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實(shí)施辦法。3、2001年5月23日國務(wù)院頒布農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例。4、2002年1月5日農(nóng)業(yè)部發(fā)布農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法。5、2004年5月24日國家質(zhì)檢總局發(fā)布進(jìn)出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法。6、2004年6月1日國家衛(wèi)生部發(fā)布轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法。7、2005年7月18日農(nóng)業(yè)部發(fā)布農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)考核管理辦法(征求意見稿)和轉(zhuǎn)基因植物種子廣告審查辦法(征求意見稿)。8、2006年1

56、月27日農(nóng)業(yè)部發(fā)布農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法。9、2006年5月12日農(nóng)業(yè)部發(fā)布轉(zhuǎn)基因作物田間試驗(yàn)安全檢查指南。 10、2008年1月25日國家發(fā)展改革委、財(cái)政部發(fā)布關(guān)于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)費(fèi)和檢測費(fèi)收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)問題的通知。(二)、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例1、基本信息：條例共計(jì)八章五十六條，分別為總則、研究與試驗(yàn)、生產(chǎn)與加工、經(jīng)營、進(jìn)口與出口、監(jiān)督檢查、罰則、附則。2、立法目的：加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理，保障人體健康和動(dòng)植物、微生物安全，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)研究。3、管理范圍：在中華人民共和國境內(nèi)從事農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的研究、試驗(yàn)、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營和進(jìn)口、出口活動(dòng)，必須遵守

57、本條例。4、管理對象： 1）轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物(含種子、種畜禽、水產(chǎn)苗種)和微生物， 2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、微生物產(chǎn)品， 3）轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的直接加工品， 4）含有轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、微生物或者其產(chǎn)品成分的種子、種畜禽、水產(chǎn)苗種、農(nóng)藥、獸藥、肥料和添加劑等產(chǎn)品。5、基本制度： 1）農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)制度； 2）生產(chǎn)許可證制度； 3）經(jīng)營許可證制度； 4）農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識制度； 5）農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因進(jìn)口安全管理制度。6、管理部門： 1）國務(wù)院農(nóng)業(yè)行政主管部門負(fù)責(zé)全國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全的監(jiān)督管理工作。 2）縣級以上農(nóng)業(yè)行政主管部門負(fù)責(zé)本行政區(qū)域內(nèi)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全的監(jiān)督管理工作?？h級以上衛(wèi)生行政主管部門依照負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)

58、基因食品衛(wèi)生安全的監(jiān)督管理工作。 3）國務(wù)院建立農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理部際聯(lián)席會(huì)議制度，由農(nóng)業(yè)、發(fā)改委、科技、環(huán)保、衛(wèi)生、商務(wù)、檢驗(yàn)檢疫等部門負(fù)責(zé)人組成，負(fù)責(zé)研究、協(xié)調(diào)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理工作中的重大問題。(三)、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法1、評價(jià)制度：安全等級為、的實(shí)驗(yàn)研究和所有安全等級的中間試驗(yàn)實(shí)行報(bào)告制管理，環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)和申請領(lǐng)取安全證書實(shí)行審批制管理。2、評價(jià)內(nèi)容：農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物對人類、動(dòng)植物、微生物和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成的危險(xiǎn)或潛在風(fēng)險(xiǎn)，主要包括環(huán)境安全和食品安全。3、安全等級：按照對人類、動(dòng)植物、微生物和生態(tài)環(huán)境的危險(xiǎn)程度，將農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物分為4個(gè)等級。 安全等級I：尚不存在

59、危險(xiǎn)； 安全等級：具有低度危險(xiǎn)； 安全等級：具有中度危險(xiǎn)； 安全等級：具有高度危險(xiǎn)。4、評價(jià)步驟： 1）確定受體生物的安全等級； 2）確定基因操作對受體生物安全等級影響的類型； 3）確定轉(zhuǎn)基因生物的安全等級； 4）確定生產(chǎn)、加工活動(dòng)對轉(zhuǎn)基因生物安全性的影響； 5）確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全等級。5、評估原則：通用原則：科學(xué)透明原則、預(yù)防原則、個(gè)案分析原則、漸進(jìn)原則、熟悉原則、實(shí)質(zhì)等同性等原則。重點(diǎn)把握： 1）我國為該物種起源中心或基因多樣性中心的轉(zhuǎn)基因生物； 2）其種植區(qū)是否有該物種近緣野生種的轉(zhuǎn)基因生物； 3）異源還是同源的轉(zhuǎn)基因生物； 4）帶有抗生素等標(biāo)記的食用轉(zhuǎn)基因生物； 5）直接食用的或用于

60、食品加工和食物類的轉(zhuǎn)基因生物； 6）新研發(fā)的、具有新性狀、新用途（如用作醫(yī)藥、保健和工業(yè)原料）轉(zhuǎn)基因生物的安全性情況； 7）提供盡可能詳盡的國內(nèi)外生物安全研究及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。6、管理機(jī)構(gòu)：主管部門：國務(wù)院農(nóng)業(yè)行政主管部門負(fù)責(zé)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全評價(jià)管理工作。評價(jià)機(jī)構(gòu)：設(shè)立國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)，負(fù)責(zé)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全評價(jià)。安委會(huì)由部際聯(lián)席會(huì)議成員部門及科研教學(xué)單位推薦的，從事農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究、生產(chǎn)、加工、檢疫檢疫以及衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等方面的專家組成。安委會(huì)分為轉(zhuǎn)基因植物與 植物用微生物（2個(gè)組）、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物用微生物組、食用安全組。組織實(shí)施：由農(nóng)業(yè)部每年組織農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)對在