封閉抗體與免疫治療的臨床意義及應用

1、封閉抗體與免疫治療的臨床意義及應用第1頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三封閉抗體與免疫治療的臨床意義及應用 深圳博愛醫(yī)院 婦科 鈄妙鶯第2頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三最新情況2010年6月12、13日中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院舉辦全國女性生殖免疫最新進展學習班，共有16個省100多家醫(yī)院派出醫(yī)生到場學習2012年12月1516日深圳市舉辦的婦科內(nèi)分泌學術會，張建平及劉慶芝分別對復發(fā)性流產(chǎn)的淋巴免疫治療進行了精彩的演講。生殖醫(yī)學及免疫治療已經(jīng)成為時下國內(nèi)醫(yī)療界最熱門的話題。深圳各大醫(yī)院及民營醫(yī)院在復發(fā)性自然流產(chǎn)的免疫治療（LIT）領域目前已逐漸開展，

2、其中包括深圳博愛醫(yī)院。第3頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三概 況RSA發(fā)病率： 自然流產(chǎn)率5% 2次自然流產(chǎn)率1%-5%，平均 2.3% 3次自然流產(chǎn)率0.34% 隱性流產(chǎn)30%40% 總的自然流產(chǎn)率為50%60% 50%原因不明，其中80%與免疫有關 復發(fā)率：隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加而上升第4頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三流產(chǎn)的病因遺傳因素內(nèi)分泌因素解剖因素感染因素血栓前狀態(tài)精神、心理因素免疫因素第5頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三遺傳因素流產(chǎn)胚胎絨毛染色體核型分析夫婦染色體核型分析夫婦雙方珠蛋白生成障礙性貧血G6PD缺乏的

3、篩查及基因檢測第6頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三內(nèi)分泌因素黃體功能不全多囊卵巢縮合征高泌乳血癥甲狀腺疾病糖尿病檢測項目有：性激素6項、甲狀腺功能、胰島素功能第7頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三解剖因素子宮畸形：縱膈子宮、單角子宮、鞍狀子宮、雙角子宮子宮動脈阻抗增高宮腔粘連子宮肌瘤、子宮腺肌病宮頸機能不全檢測方法：超聲波、造影、宮腔鏡、腹腔鏡檢查第8頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三感染因素女性生殖道局部感染包括解脲支原體（UU）、衣原體（CT)、加得納菌（BV）、梅毒螺旋體（TP）、外周血病毒感染等均可造成流產(chǎn)檢測項目：U

4、U、CT、BV、TORCH 、TP等等第9頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三血栓前狀態(tài)多種因素引起的凝血、抗凝和纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)或障礙的一種病理過程，有易導致血栓形成的多種血液學改變。常用檢沒項目有凝血常規(guī)四項：血檢前狀態(tài)分子標志物，凝血酶原片斷（F1+2），血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM），凝血酶抗凝血酶復合物（TAT）、抗凝血酶（AT）、血小板顆粒糖蛋白140（GMP140）、血栓烷B2（TXB2）、D二聚體（D）、纖溶酶原激活物抑制物（PAI）第10頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三精神心理因素焦慮、緊張、恐嚇等嚴重精神刺激均可導致流產(chǎn)。常期腦力勞動孕婦較

5、強烈的長期或反復的精神緊張、焦慮、煩躁等情緒變化，使大腦皮質(zhì)興奮抑制過程的平衡失衡，舒縮血管中樞受影響，子宮小動脈痙攣，絨毛缺血，胎兒發(fā)育障礙。第11頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫因素一、自身免疫型 1、抗心磷酯抗體（APL） 2、抗核抗體（ANA） 3、抗精子抗體（ASA） 4、抗子宮內(nèi)膜抗體（AEA） 5、抗卵巢抗體（AOA） 6、抗滋養(yǎng)細胞抗體（ATA） 7、 RH血型抗體第12頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫因素二、同種免疫型 1、保護性抗體缺陷（封閉抗體陰性） 2、淋巴細胞紊亂（NK細胞增多）第13頁，共38頁，2022年，5

6、月20日，2點38分，星期三封閉抗體的概念封閉抗體：在正常孕婦的血清中，存在一種抗配偶淋巴細胞的特異性IgG抗體，它可抑制淋巴細胞反應（MLR），封閉母體淋巴細胞對培養(yǎng)的滋養(yǎng)層的細胞毒作用，防止輔助T細胞識別胎兒抗原的抑制物，并可阻止母親免疫系統(tǒng)對胚胎的攻擊。封閉同種抗原刺激的淋巴細胞產(chǎn)生巨噬細胞移動抑制因子（MIF），故稱其為封閉抗體（blocking antibodies，BA），或稱為（Antipaternallymphocyte anti body，APLA)第14頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三淋巴細胞免疫治療的概念淋巴細胞免疫治療（LIT）： Beer和Ta

7、yor于二十世紀七十年代創(chuàng)立，并于1978年開始應用于RSA的一種免疫療法。對同種免疫型RSA患者彩用丈夫或他人淋巴細胞進行同種致敏治療，抑制母胎間的細胞性免疫性排斥反應，減少流產(chǎn)率。對于封閉抗體和抗獨特型抗體缺乏者，主要采用配偶淋巴細胞免疫療法，等到患者體內(nèi)抗體水平升高時進行受孕，妊娠的成功率可達到90%。第15頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫性自然流產(chǎn)分類類：同種免疫型HLA相容性升高，封閉抗體缺乏 1、正常妊娠：父源性HLA抗原刺激母體，產(chǎn)生封閉抗體。 母胎耐受，妊娠成功 2、復發(fā)性流產(chǎn) 夫婦HLADQA（DQAI）相容性過大，封閉抗體不產(chǎn)生。 免疫攻擊，自然

8、流產(chǎn) 3、特性：缺少封閉抗體，多次流產(chǎn)后可誘發(fā)、 類免疫異常的流產(chǎn) 4、淋巴細胞免疫治療（LIT）是最理想的治療方法第16頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫性自然流產(chǎn)分類類：抗磷脂抗體APL（+）抗磷脂自身抗體包括： 抗心磷脂抗體（ACL）、抗磷脂乙醇胺抗體（APEA）、狼瘡抗凝血因子（CAC）、抗磷脂酰肌醇抗體（APIL）、和抗磷酸抗體（APAA）。RSA患者APL（+）22%，每流產(chǎn)一次發(fā)生率增加15%。特征：強烈的凝血活性、直接造成血管內(nèi)皮細胞損傷、抑制滋養(yǎng)細胞的功能治療：阿司匹林+肝素治療第17頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫性自然

9、流產(chǎn)分類類：抗核抗體陽性ADA（+）和抗DNA抗體（+）。占RSA婦女的22%，在不孕或IVF失敗的婦女中占50%。有自身免疫性疾病的婦女關節(jié)炎和器管炎癥及無自身免疫性疾病的婦女種植時胚胎周圍發(fā)炎，種植后胎盤發(fā)炎。特征：對抗胎兒和胎盤DNA治療：強的松治療，繼發(fā)于關節(jié)炎或SLA者與風濕免疫科一起治療。第18頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫性自然流產(chǎn)分類類：抗精子抗體ASA和/或APL等組織特異性抗體陽性。不孕、種植失敗和RSA的病人約10%產(chǎn)生ASA。特征：受孕困難治療：肝素+阿斯匹林+強的松治療下列情況需要檢測ASA： 1、抗絲氨酸中抗乙醇胺抗體陽性的婦女 2、性

10、交后試驗不良的婦女（在宮頸粘液中精子死亡或 不活動） 3、配偶有ASA陽性第19頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫性自然流產(chǎn)分類類：NK細胞數(shù)量和功能紊亂特征：CD56+、CD19+5+細胞數(shù)量或/和活性升高，分泌TNF和抗神經(jīng)轉(zhuǎn)移因子抗體兩類NK細胞可損傷妊娠 CD56+產(chǎn)生TNF、損害蛻膜細胞和滋養(yǎng)細胞 CD19+5+產(chǎn)生抗神經(jīng)轉(zhuǎn)移因子抗體，破壞滋養(yǎng)細胞產(chǎn)生的激素（如雌激素、黃體酮和HCG）不良結(jié)果： 妨礙種植（多次種植失敗）、損傷胎盤細胞、損害孕囊（孕囊變形）、絨毛下出血（有時僅B起發(fā)現(xiàn)）、影響卵細胞DNA，致胚胎質(zhì)量不良治療 LIT、IVIg、代理妊娠第20頁

11、，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫治療淋巴細胞免疫治療（LIT）適應癥 1、類免疫紊亂（封閉抗體缺乏） 2、不明原因RSA 3、夫婦DQa相容性大，或夫婦間有2個或2個以上 相同的 HLA抗原 4、無抗父親淋巴細胞毒抗體 5、微細胞毒交叉試驗陰性 6、全身免疫狀態(tài)正常 7、夫妻雙方均愿意接受治療第21頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫治療淋巴細胞來源 1、丈夫淋巴細胞 2、 無關個體淋巴細胞 3、血緣親屬淋巴細胞 4、自身淋巴細胞第22頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三免疫治療治療方法 1、配制淋巴細胞濃縮液 2、淋巴細胞

12、計數(shù)為：3410 7/ml 3、雙側(cè)前臂皮內(nèi)或皮下多點注射（通常注射68針） 4、每24周一次，每療程4次 5、封閉抗體上升，或微細胞毒交叉試驗陽性即可受孕， 受孕后繼續(xù)LIT治療35周期 6、妊娠成功率達75%85%。第23頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三封閉抗體檢測方法：ELISA原理：用抗原包被微量板孔，制成固相載體，加患者血清到板空中其所含的抗體特異性地與固相載體中存在的抗原相結(jié)合，形成免疫復合物，除去多余的雜質(zhì)后，加入辣根過氧化物標記的IgG抗體，使之與上述免疫復合物反應。洗板，除去多余的結(jié)合物，加入底物，與其酶結(jié)合的免疫復合物反應，產(chǎn)生有顏色產(chǎn)物，顏色強度與

13、特異性抗體含量成正比。第24頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三封閉抗體檢測操作步驟： 1、實驗前準備 1.1 實驗記錄表上填寫待檢病人的詳細資料，包括姓 名和編號。 1.2 一塊干板可同時人測十個樣本，如不需檢測十個 樣本，可用封板膜將無需使和的實難孔及對照孔 封實 2、實驗操作 第25頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三封閉抗體檢測 2.1 90ulAntibody Diluent加入10Antibody Diluent, 搖勻，加入第一行CH孔，第二行以CE孔，每孔0ul. 2.2 每份待檢血清取20ul加入Antibody Diluent搖勻，

14、分別加入312行AD孔（每人一人）每孔10ul. 2.3 37孵育45分鐘。 2.4 配備1Wash buffer：取27ml蒸餾水加入 3ml10Wash buffer，搖勻。第26頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三封閉抗體檢測操作步聚： 2.5 孵育45分鐘后將反應板扣干，用1Wash buffer 洗板兩次，扣干。 2.6 稀釋酶標抗體：取594ul Antibody Diluent加入 6ul Alkaline Phosphatase Conjugated (此為10 人次所需試劑），搖勻。 2.7 實驗孔及對照孔均加入已稀釋本科標抗體10ul， 37孵育30分鐘

15、。第27頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三封閉抗體檢測 2.8 扣干，用1Wash buffer洗板三次，扣干。 2.9 各取Substrate A、B300ul，混勻，加入各孔10ul. 2.10 避光孵育10分鐘（37）。加入5ulStop Reagent 終止反應。 2.11 在已經(jīng)設置好的酶標儀上進行讀數(shù)，觀察記錄結(jié)果 蘭色為陽性，無色為陰性。（或都采用酶標儀讀板）。第28頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三小 結(jié)在反復性流產(chǎn)患者中，在排除如染色體遺傳、內(nèi)分泌、生理解剖、感染、血栓等多種因素外，免疫因素是反復流產(chǎn)發(fā)病的重要病因。免疫困素分為自身

16、免疫型和同種免疫型，封閉抗體缺乏是導致免疫性反復流產(chǎn)的主要原因。淋巴細胞免疫治療在臨床應用方面治療反復性流產(chǎn)取得顯著成效。第29頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三我院淋巴細胞主動免疫治療的介紹和體會信息資料：取我院2010年12月-2012年12月不明原因早期自然流產(chǎn)（包括生化妊娠，IVF-ET種植失敗）及胚胎停育2次或2次以上，且臨床篩查確診為封閉抗體缺乏所致的RSA患者共80例，愿意接受淋巴細胞免疫治療者40例列為治療組，采用淋巴細胞主動免疫進行治療(LIT)。另40例作為對照組，對照組采用傳統(tǒng)保胎治療（黃體酮加HCG）。 第30頁，共38頁，2022年，5月20日，

17、2點38分，星期三我院淋巴細胞主動免疫治療的介紹和體會本研究淋巴細胞免疫治療應符合下列條件：（1）封閉抗體檢查陰性；（2）生化妊娠及早期（12W前）自然流產(chǎn)史2次，或胚胎停育2次，或自然流產(chǎn)+胚胎停育2次；（3）夫婦雙方染色體檢查正常，無家族遺傳病史第31頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三我院淋巴細胞主動免疫治療的介紹和體會（4）雙方行TORCH（包括巨細胞病毒、風疹病毒、單純皰疹病毒和弓形體）、梅毒、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎檢查均為陰性；（5）生殖道衣原體、支原體、淋球菌等檢查均為陰性；（6）內(nèi)分泌檢查、甲狀腺功能及空腹血糖正常第32頁，共38頁，2022年，5月20

18、日，2點38分，星期三我院淋巴細胞主動免疫治療的介紹和體會（7）抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體、抗心磷脂抗體均為陰性；（8）排除生殖道畸形和形態(tài)學異常；（9）男方精液分析正常；（10）治療前3個月內(nèi)未使用過調(diào)節(jié)免疫功能藥物，未經(jīng)任何免疫治療。第33頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三我院淋巴細胞主動免疫治療的介紹和體會淋巴免疫的治療方法：無菌下抽取患者丈夫或血緣親屬或無關自愿健康個體靜脈血20ml，肝素抗凝；在無菌條件下分離淋巴細胞；將淋巴細胞懸液裝于注射器中，給予患者兩前臂內(nèi)側(cè)行多點皮下或皮內(nèi)注射，每側(cè)注射3-4點，共68點。第34頁，共38頁，2022年，5月20日，2點38分，星期三我院淋巴細胞主動免疫治療的介紹和體會每2-3周治療1次，4-6次為