食品中化學(xué)物致突變作用及其評(píng)價(jià)市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、第六章 食品中化學(xué)物質(zhì)突變作用及其評(píng)價(jià)第1頁(yè)第1頁(yè)2遺傳毒理學(xué)第一節(jié) 基本概念第二節(jié) 化學(xué)毒物致突變類型第三節(jié) 致突變作用機(jī)制和后果第四節(jié) 機(jī)體對(duì)致突變作用影響第五節(jié) 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用 基本辦法第2頁(yè)第2頁(yè)3基本概念遺傳毒理學(xué)(Genetic Toxicology)是毒理學(xué)一個(gè)分支，研究外源化學(xué)物及其它環(huán)境原因?qū)ι矬w遺傳機(jī)構(gòu)損害作用及其規(guī)律。其主要目的是檢測(cè)那些能引起DNA損傷環(huán)境原因，研究其遺傳毒作用特點(diǎn)及對(duì)人類潛在危害。第3頁(yè)第3頁(yè)4基本概念突變(mutation) 遺傳結(jié)構(gòu)本身改變及其引起變異稱為突變，突變事實(shí)上是遺傳物質(zhì)一個(gè)可遺傳變異。 自發(fā)突變(spontaneous mut

2、ation) 由于自然界中誘變劑作用或由于偶然自制、 轉(zhuǎn)錄、修復(fù)時(shí)堿基配對(duì)錯(cuò)誤所產(chǎn)生突變。 誘發(fā)突變(induced mutation) 誘變劑誘發(fā)突變。 第4頁(yè)第4頁(yè)5致突變作用或誘變作用(mutagenesis) 廣義概念是外來(lái)原因，尤其是化學(xué)因子引起細(xì)胞核中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變能力，并且此種改變可隨同細(xì)胞分裂過(guò)程而傳遞。簡(jiǎn)樸地說(shuō)，突變發(fā)生及其過(guò)程即為致突變作用。 化學(xué)誘變劑(chemical mutagen)基因突變(gene mutation) 一個(gè)或幾種DNA堿基正確改變 染色體畸變(chromosome aberration) 染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變 基本概念第5頁(yè)第5頁(yè)6DNA與基因:

3、 基因(gene) 基因組(genosome) 染色質(zhì)(chromatin)與染色體(chromosome) 體細(xì)胞(somatic cell)和生殖細(xì)胞(germ cell) 基因型(genotype)與表型(pheotype)細(xì)胞周期(cell cycle)、有絲分裂(mitosis)與減數(shù)分裂(meiosis) 基本概念第6頁(yè)第6頁(yè)7基本概念第7頁(yè)第7頁(yè)8基本概念第8頁(yè)第8頁(yè)9基本概念第9頁(yè)第9頁(yè)10基本概念第10頁(yè)第10頁(yè)11基因突變（gene mutation）染色體畸變（chromosome aberration）非整倍體和多倍體 (aneuploidy and polyloid)

4、化學(xué)毒物致突變類型第11頁(yè)第11頁(yè)12化學(xué)毒物致突變類型一、基因突變(gene mutation) 1堿基置換(basepair substitution) 指某一堿基配對(duì)性能改變或脫落所致突變。 轉(zhuǎn)換(transition) 顛換(transvertion) 2移碼突變 (frameshift mutation) 指發(fā)生一對(duì)或幾對(duì)（三對(duì)除外）堿基減少或增長(zhǎng)，以致從受損點(diǎn)開始?jí)A基序列完全改變，形成錯(cuò)誤密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常氨基酸。 第12頁(yè)第12頁(yè)13一、基因突變(gene mutation)化學(xué)毒物致突變類型第13頁(yè)第13頁(yè)14化學(xué)毒物致突變類型一、基因突變(gene mutation)第1

5、4頁(yè)第14頁(yè)15二、染色體畸變(chromosome aberration) 指染色體結(jié)構(gòu)改變 染色單體型畸變(chromatid-type aberration)染色體型畸變(chromosome aberration) 染色體畸變裂隙(gap) 斷裂(break) 斷片(fragment)和缺失(deletion) 微小體(minute body) 無(wú)著絲點(diǎn)環(huán)環(huán)狀染色體 雙著絲點(diǎn)染色體 倒位(inversion) 易位(translocation) 插入(insertion)和重復(fù)(duplication) 輻射體 化學(xué)毒物致突變類型第15頁(yè)第15頁(yè)16 染色體缺失及環(huán)狀染色體形成圖 染色

6、體插入和重復(fù)示意圖 第16頁(yè)第16頁(yè)17 染色體臂間倒位 染色體互相易位示意圖 第17頁(yè)第17頁(yè)18二、染色體畸變(chromosome aberration)化學(xué)毒物致突變類型第18頁(yè)第18頁(yè)19三、基因組突變 1非整倍體 非整倍體(aneuploid)指細(xì)胞丟失或增長(zhǎng)一條或幾條染色體。缺失一條染色體時(shí)稱為單體(monosome)，增長(zhǎng)一條染色體時(shí)稱為三體(trisome)。染色體數(shù)目的改變會(huì)造成基因平衡失調(diào)，也許影響細(xì)胞生存或造成形態(tài)及功效上異常。如21三體造成先天愚型(Down氏綜合征)。2整倍體 整倍體(euploid)指染色體數(shù)目的異常是以染色體組為單位增減，如形成三倍體(tripl

7、oid)、四倍體(tetroploid)等。在人體，3n為69條染色體，4n為92條染色體。在腫瘤細(xì)胞及人類自然流產(chǎn)胎兒細(xì)胞中可有三倍體細(xì)胞存在。發(fā)生于生殖細(xì)胞整倍體改變，幾乎都是致死性?；瘜W(xué)毒物致突變類型第19頁(yè)第19頁(yè)20致突變作用機(jī)制一、DNA損傷與突變(一)堿基損傷1. 堿基錯(cuò)配2. 嵌入DNA鏈3. 堿基類似物取代4. 堿基化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞 第20頁(yè)第20頁(yè)21一、DNA損傷與突變（二）DNA鏈?zhǔn)軗p 1. 二聚體形成 2. DNA加合物（DNA adducts）形成 3. DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物(DNA-Protein crosslinks，DPC)形成 二、引起突變細(xì)胞分裂過(guò)程改變

8、三、其它改變 對(duì)DNA合成和修復(fù)相關(guān)酶系統(tǒng)作用可間接造成 DNA損傷，誘發(fā)基因突變或染色體畸變。 致突變作用機(jī)制第21頁(yè)第21頁(yè)22突變不良后果突變不良后果 體細(xì)胞突變 生殖細(xì)胞突變 癌變致畸衰老配子死亡死胎自發(fā)流產(chǎn)先天畸形第22頁(yè)第22頁(yè)23一、機(jī)體修復(fù)DNA損傷機(jī)制可分為兩大類： 1.損傷耐受機(jī)制：指DNA遺傳可繞過(guò)那些制止DNA 復(fù)制DNA損傷。 2. 修復(fù)機(jī)制：DNA修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)O6甲基鳥嘌呤修復(fù)光修復(fù)錯(cuò)配堿基修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)機(jī)體對(duì)致突變作用影響復(fù)制后修復(fù)呼救性修復(fù)第23頁(yè)第23頁(yè)24機(jī)體對(duì)致突變作用影響二、遺傳原因?qū)χ峦蛔冏饔糜绊懀?(一)代謝酶遺傳多態(tài)性 (二

9、)修復(fù)功效個(gè)體差別 第24頁(yè)第24頁(yè)25觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法一、觀測(cè)項(xiàng)目的選擇 1觀測(cè)效應(yīng)終點(diǎn)類型基因突變和染色體畸變檢測(cè)可直接反應(yīng)化學(xué)毒物致突變性，是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物致突變性唯一可靠辦法。尚有許多試驗(yàn)所觀測(cè)到現(xiàn)象并不反應(yīng)基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，而僅反應(yīng)致突變過(guò)程中發(fā)生其它事件。因此，將試驗(yàn)觀測(cè)到現(xiàn)象所反應(yīng)各種事件統(tǒng)稱為遺傳學(xué)終點(diǎn)(genetic endpoint)。 第25頁(yè)第25頁(yè)26觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法一、觀測(cè)項(xiàng)目的選擇遺傳學(xué)終點(diǎn)分為5類：DNA完整性改變(形成加合物，斷裂，交聯(lián))；DNA重排或互換；DNA堿基序列改變；染色體完整性改變；染色體分離改變。其中

10、事實(shí)上指基因突變，指染色體畸變。 第26頁(yè)第26頁(yè)27觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法2成套觀測(cè)項(xiàng)目遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序通常為一組體內(nèi)、外遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)。因?yàn)椋夯瘜W(xué)毒物種類和結(jié)構(gòu)各種多樣，其致突變機(jī)制不盡相同，作用靶細(xì)胞也不同，有是體細(xì)胞，或生殖細(xì)胞，或二者兼而有之，故在成套觀測(cè)項(xiàng)目中既要用體細(xì)胞檢測(cè)又要用生殖細(xì)胞；除了從分子水平還要從細(xì)胞水平來(lái)檢測(cè)化學(xué)毒物遺傳毒性。致突變物中僅少數(shù)含有直接致突變作用，大多數(shù)為間接致突變作用，即需要在體內(nèi)代謝活化后，才含有致突變作用。體內(nèi)試驗(yàn)含有完整活化系統(tǒng)，而體外試驗(yàn)則經(jīng)過(guò)加入模擬代謝系統(tǒng)，如S9來(lái)填補(bǔ)缺乏活化系統(tǒng)不足。這是體內(nèi)與體外試驗(yàn)主要差異?；瘜W(xué)毒物致突變

11、性有強(qiáng)，也有弱；有在某一檢測(cè)系統(tǒng)中是強(qiáng)致突變物，而在另一系統(tǒng)中可能是弱致突變物。對(duì)于弱致突變物在一些系統(tǒng)中比較容易漏檢，即出現(xiàn)假陰性。 對(duì)藥物代謝酶系統(tǒng)誘導(dǎo) 處理動(dòng)物肝臟均漿9000克、 10分鐘離心沉淀上澄液（S9），含輔酶，能增進(jìn)致癌物質(zhì)代謝活化S9第27頁(yè)第27頁(yè)282成套觀測(cè)項(xiàng)目關(guān)于遺傳毒理學(xué)成套觀測(cè)項(xiàng)目中那些試驗(yàn)可入選原則有：選擇遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)包括5種類型遺傳學(xué)終點(diǎn)。通常試驗(yàn)材料有病毒、細(xì)菌、真菌、培養(yǎng)哺乳細(xì)胞、植物、昆蟲及哺乳動(dòng)物等。體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)配合。應(yīng)包括生殖細(xì)胞和體細(xì)胞。通常，對(duì)于一個(gè)受試物應(yīng)當(dāng)先用原核細(xì)胞或體細(xì)胞體外試驗(yàn)按遺傳學(xué)終點(diǎn)合理配套進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)有陽(yáng)性結(jié)果遺傳學(xué)

12、終點(diǎn)驗(yàn)證其在體內(nèi)真實(shí)性，再行選取生殖細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行遺傳危害評(píng)價(jià)。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法 DNA完整性 改變DNA重排或互換DNA堿基序列改變，染色體完整性改變，染色體分離改變遺傳學(xué)終點(diǎn)。第28頁(yè)第28頁(yè)29二、慣用致突變?cè)囼?yàn) (一)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn)) 鼠傷寒沙門氏菌原養(yǎng)型(his+)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株。(his-)正向突變回復(fù)突變代謝活化系統(tǒng)受試物觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第29頁(yè)第29頁(yè)30二、慣用致突變?cè)囼?yàn)(二)微核試驗(yàn) 微核(Micronucleus)產(chǎn)生與染色體損傷相關(guān)，是染色體或染色單體無(wú)著絲點(diǎn)斷片或紡錘絲受損傷而丟失整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留

13、在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾種規(guī)則次核，包括在子細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱微核。在細(xì)胞質(zhì)中微核起源有二：斷片或無(wú)著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動(dòng)，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；有絲分裂毒物作用使個(gè)別染色體或帶苔絲粒染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中。微核試驗(yàn)(Micronucleus test，MNT)是觀測(cè)受試物能否產(chǎn)生微核試驗(yàn)。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第30頁(yè)第30頁(yè)31觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法(二)微核試驗(yàn)第31頁(yè)第31頁(yè)32MNNCE觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第32頁(yè)第32頁(yè)33二、慣用致突變?cè)囼?yàn)(三)染色體畸變

14、分析 (四)姐妹染色單體互換試驗(yàn)（SCE） 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第33頁(yè)第33頁(yè)34二、慣用致突變?cè)囼?yàn)(五)果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)(六)顯性致死試驗(yàn)(七)程序外DNA臺(tái)成試驗(yàn) (八)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變?cè)囼?yàn)(九)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第34頁(yè)第34頁(yè)35三、致突變?cè)囼?yàn)中一些問(wèn)題 (一)陰性和陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置 1陰性對(duì)照 它是空白對(duì)照，即不加任何處理?；蛘呤侨軇?duì)照。陰性對(duì)照除了無(wú)處理原因外，與試驗(yàn)組完全相同。其目的是取得試驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。比如，Ames試驗(yàn)陰性對(duì)照可理解所用細(xì)菌自發(fā)回復(fù)突變率；證實(shí)除處理原因外無(wú)任何使回復(fù)突變率增長(zhǎng)或減少原因。 2陽(yáng)性對(duì)照 是用某種已

15、知能產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)作為對(duì)照。其目的是通過(guò)對(duì)陽(yáng)性物質(zhì)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)辦法可靠；驗(yàn)證試驗(yàn)者在本試驗(yàn)條件下，完畢技術(shù)和鑒定致突變物能力；證實(shí)經(jīng)一段時(shí)間后，本試驗(yàn)重復(fù)性。比如，Ames試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)考慮突變菌株也許發(fā)生問(wèn)題，另一個(gè)也許是代謝活化能力不足。因此，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果未呈陽(yáng)性，其試驗(yàn)組試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性亦大大減少。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第35頁(yè)第35頁(yè)36三、致突變?cè)囼?yàn)中一些問(wèn)題(二)體外試驗(yàn)活化系統(tǒng) 1哺乳動(dòng)物細(xì)胞介導(dǎo) 使用完整細(xì)胞，尤其是大鼠肝原代細(xì)胞，與測(cè)試細(xì)菌或細(xì)胞一起培養(yǎng)。這也是一個(gè)活化系統(tǒng)。它有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種酶及內(nèi)源性輔助因子，代謝能力優(yōu)于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)如S9，

16、但不如體內(nèi)活化系統(tǒng)。 2S9 S9指經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理后制備肝勻漿，再經(jīng)9000g離心分離所得上清液，加上適當(dāng)緩沖液和輔助因子。它主要含有混合功效氧化酶(MFO)，是國(guó)內(nèi)常規(guī)應(yīng)用于體外致突變?cè)囼?yàn)代謝活化系統(tǒng)，其缺點(diǎn)是S9隨試驗(yàn)動(dòng)物種屬或器官不同而有差異；S9含有大量親核物質(zhì)有可能影響試驗(yàn)敏感性。 3純化酶和基因工程 應(yīng)用純化細(xì)胞色素P-450、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶及過(guò)氧化物水解酶，可嚴(yán)格控制代謝產(chǎn)物誘發(fā)突變條件，但技術(shù)難度大。利用基因工程，將人細(xì)胞色素P-450基因，插入組合細(xì)胞內(nèi)，用上述細(xì)胞進(jìn)行致突變?cè)囼?yàn)，使細(xì)胞含有代謝活化系統(tǒng)。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第36頁(yè)第36頁(yè)37三、致突變?cè)囼?yàn)中一些

17、問(wèn)題(三)致突變?cè)囼?yàn)與致癌試驗(yàn)關(guān)系 已知大多數(shù)化學(xué)致癌物含有致突變作用，遺傳學(xué)改變?cè)谠┗蚣せ詈鸵职┗蚴Щ钌掀鹬饕饔?，致癌物誘致關(guān)鍵靶基因遺傳改變直接作用等在哺乳動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)。發(fā)覺人類接觸致癌物與DNA加合物，同其腫瘤中癌基因和抑癌基因特異堿基對(duì)突變之間含有相關(guān)性。老式長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)，花費(fèi)大，周期長(zhǎng)，不能適應(yīng)化學(xué)物質(zhì)快速增長(zhǎng)需要。另外，致癌試驗(yàn)所用動(dòng)物數(shù)量有限，難以檢出弱致癌物。需要發(fā)展各種體內(nèi)和體外短期試驗(yàn)，用于對(duì)化學(xué)物質(zhì)致癌性進(jìn)行篩檢。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第37頁(yè)第37頁(yè)38三、致突變?cè)囼?yàn)中一些問(wèn)題(四)試驗(yàn)結(jié)果在毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)中作用 陰性結(jié)果鑒定條件：最高劑量應(yīng)包括受

18、試物溶解度許可或灌胃量許可最大劑量。如該劑量毒性很大，則體內(nèi)試驗(yàn)和細(xì)菌試驗(yàn)應(yīng)為最大耐受量。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，常選LD50或LD80為最大劑量。溶解度大、毒性低化學(xué)物，在細(xì)菌試驗(yàn)中能夠5000g皿作為最高劑量。各劑量組組間差距不應(yīng)過(guò)大，以防漏檢僅在非常狹窄范圍內(nèi)才有突變能力一些化學(xué)毒物。滿足上述條件，仍為陰性，才謹(jǐn)慎下結(jié)論。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第38頁(yè)第38頁(yè)39三、致突變?cè)囼?yàn)中一些問(wèn)題(四)試驗(yàn)結(jié)果在毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)中作用陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)含有劑量反應(yīng)關(guān)系，即隨劑量增加，致突變作用增加；和在一組或多組觀測(cè)值與陰性對(duì)照比較有顯著性差異。陽(yáng)性結(jié)論，即表明受試物含有致突變性，而不同致

19、突變?cè)囼?yàn)遺傳學(xué)終點(diǎn)不同，其所表示含義不一。如基因突變是含有造成遺傳性疾病突變，DNA修復(fù)實(shí)際后果尚不明確。 觀測(cè)化學(xué)毒物致突變作用基本辦法第39頁(yè)第39頁(yè)40致突變?cè)囼?yàn)舉例美國(guó)EPA毒物處(1936)提出了一個(gè)三階段試驗(yàn)方案，把遺傳毒性檢測(cè)和生殖細(xì)胞致突變性驗(yàn)證分階段進(jìn)行。第一階段測(cè)試化學(xué)物遺傳毒性，包括Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)、體內(nèi)骨髓染色體損傷試驗(yàn)(微核試驗(yàn)或染色體畸變?cè)囼?yàn))；第二階段測(cè)試對(duì)生殖細(xì)胞致突變作用；第三階段為哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞致突變性原則試驗(yàn)。在遺傳危害性評(píng)價(jià)時(shí)，在體外基因突變?cè)囼?yàn)中呈陽(yáng)性化學(xué)物應(yīng)進(jìn)行與哺乳類性腺DNA互相作用試驗(yàn)，包括睪丸細(xì)胞SCE、UDS、染色體畸變及堿性洗脫試驗(yàn)等，也可進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)，在第二階段中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，需進(jìn)行小鼠特異座位試驗(yàn)，可觀測(cè)形態(tài)改變或生化改變；在體內(nèi)骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或微核試驗(yàn)中呈陽(yáng)性化學(xué)物需進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)，在第二階段中出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，再進(jìn)行小鼠可遺傳易位試驗(yàn)。 第40頁(yè)第40頁(yè)41致突變?cè)囼?yàn)舉例國(guó)際協(xié)調(diào)組織(1CH)(1997)對(duì)于藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)提議檢測(cè)試驗(yàn)組合為細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)；體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞比試驗(yàn)；體內(nèi)嚙齒類造血細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)(骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或骨髓或外周血多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn))。在對(duì)經(jīng)原則試驗(yàn)組合得到致突變作用結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步研究時(shí)，其它試驗(yàn)