染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP培訓課件

1、染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP目錄目錄一、簡介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNase 足紋法電泳遷移率變動分析生物信息學方法酵母單雜交系統(tǒng)ChIP一、簡介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNase 足紋法電泳遷一、簡介ChIP 是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關(guān)系。一、簡介ChIP二、原理 在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合物，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白

2、質(zhì)與DNA相互作用的信息。二、原理 在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復合物，三、技術(shù)流程 具體操作流程DNA分析三、技術(shù)流程 具體操作流程DNA分析1、甲醛交聯(lián)細胞具體步驟10 ml1PBS孵育8min棄上清4-5ml預冷1 PBS預冷1PBS洗滌兩次轉(zhuǎn)移4000rpm離心5min棄上清1ml預冷1PBS懸浮新離心管4000rpm離心5min1ml1.25mol/L甘氨酸室溫10-20min1、甲醛交聯(lián)細胞具10 ml1PBS孵育8min棄上清4-2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min.每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-1000bp，置于冰上。

3、不同樣本都進行超聲條件優(yōu)化實驗。3.14000rpm離心10min（4），轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10m3.免疫沉淀蛋白和DNA復合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液4搖床搖動一小時1000rmp離心2min（4）轉(zhuǎn)移上清液至新離心管ChIP稀釋液稀釋10倍加入20l蛋白A/G瓊脂糖珠1-4l免疫沉淀抗體取50l上清液作為對照？3.免疫沉淀蛋白和DNA復合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液4、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動1-2h，440lProtein A/G Agarose Beads每次洗時，在搖床上搖10min,4，

4、4000rpm離心5min棄上清4、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動1-2h，5、洗脫免疫復合物Beads200lChIP洗脫溶液洗脫取上清Beads取上清200l,ChIP洗脫溶液(3次)600l洗脫液5、洗脫免疫復合物Beads200lChIP洗脫溶液洗脫取6、去除甲醛交聯(lián)加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.2mol/l陰性對照+350lChIP洗脫溶液+16l 5mol/l NaCl。65,過夜,去交聯(lián)。6、去除甲醛交聯(lián)加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.27、DNA純化酚/氯仿抽提實驗樣本(600l)50l陰性對照10lRNase50l蛋白酶K等量酚/氯仿/異戊醇

5、（25:24:1）上清液上清液1/10體積3mol/l乙酸鈉2倍體積冰凍無水乙醇加入70%乙醇，懸浮沉淀，12000rpm離心10min，去上清，DNA干燥后，40lTE溶解硅膠柱純化7、DNA純化酚/氯仿抽提實驗樣本(600l)50l陰8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的鑒定(1)如果目的蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，則可選用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，則可采用ChIP克隆測序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的四、應用組蛋白修飾研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析藥物開發(fā)研究有絲分裂研究DNA損傷與凋亡分析四、應用組蛋白修飾研究五、優(yōu)缺點優(yōu)點：充分反映生理條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實情況，可以找出生理條件下某個DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點，從而反映體內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況。缺點：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難以獲得；為了獲得高等豐度的結(jié)合