DNA片段的PCR擴(kuò)增及電泳檢測課件

1、實(shí)驗(yàn)三 DNA片段的PCR擴(kuò)增及電泳檢測海南大學(xué)海洋學(xué)院本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過PCR擴(kuò)增方法檢測pCT74中的綠色熒光蛋白質(zhì)基因。培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力和創(chuàng)新能力【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA的方法，其基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。 它包括: 變性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三個(gè)基本步驟。這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)2535輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)10

2、6 倍。主要試劑ExTaq PCR Mix; 引物對：1mol/L; ddH2O;模板DNAPCR擴(kuò)增引物：p74GFPs: 5 GGTATCGATTGGAATGCATGGAGGA 3p74GFPa: 5 GCTGAATTCTTGTACAGCTCGTCCATG 3PCR主要操作步驟 標(biāo)記試管 加入各種試劑、混勻、最后加ExTaq PCR Mix（因?yàn)槔锩婧忻福?設(shè)立PCR循環(huán)程序，進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記PCR反應(yīng)管【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 在0.2 mL Eppendorff管內(nèi)調(diào)制25L反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積（L）dd H2O 8.92 ExTaq PCR mix12.5引物1 1.3引物2 1.3模板DNA

3、 1反應(yīng)管放入PCR儀編輯程序進(jìn)行擴(kuò)增2. 按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 1） 94 預(yù)變性 4 min； 2） 94 變性 30sec； 3） 56 退火 30 sec； 4） 72 延伸 2 min； 5） 重復(fù)步驟24, 30次； 6） 72 延伸 10 min； 7） 16 保存.3. 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果1瓊脂糖凝膠的配制： 1）、稱取0.5g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入50mL 1TAE緩沖液，瓶口用稱量紙封好，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。2）、將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至60左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴Gold View，小心混勻，倒到制膠槽上，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層，不要產(chǎn)生氣泡（厚度約為34mm）； 3）、 室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子。 4）、制好膠后將凝膠連