雙重或多重免疫組化標(biāo)記培訓(xùn)課件

1、雙重或多重免疫組化標(biāo)記雙重或多重免疫組化標(biāo)記一、基本原理 雙重或多重標(biāo)記是利用免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)原理，在同一張切片上同時(shí)采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來(lái)原位示蹤組織或細(xì)胞內(nèi)不同抗原大分子物質(zhì)的一項(xiàng)標(biāo)記染色技術(shù)。雙重或多重免疫組化標(biāo)記2一、基本原理 雙重或多重標(biāo)記是利用免疫學(xué)和細(xì) 由于此項(xiàng)技術(shù)可在同一張切片上同時(shí)顯示兩種或兩種以上不同抗原成分(定性、定位、定量)，因而使組織內(nèi)不同抗原成分相互間功能關(guān)系的觀察更加直觀，操作需遵循的原則和要求基本上與單標(biāo)免疫組化方法雷同，但差異是流程長(zhǎng)，脫片機(jī)率更高，前后重染色試劑間有交叉干擾等。雙重或多重免疫組化標(biāo)記3 由于

2、此項(xiàng)技術(shù)可在同一張切片上同時(shí)顯示兩種或兩雙重或多重免疫組化標(biāo)記4雙重或多重免疫組化標(biāo)記4雙重或多重免疫組化標(biāo)記5雙重或多重免疫組化標(biāo)記5二、技術(shù)類(lèi)型（一）雙重或多重免疫熒光標(biāo)記染色 采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標(biāo)記不同的抗體，再通過(guò)各自與同一切片上的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而加以區(qū)別顯示所建立起來(lái)的雙重或多重免疫組化染色技術(shù)。雙重或多重免疫組化標(biāo)記6二、技術(shù)類(lèi)型雙重或多重免疫組化標(biāo)記6 熒光素配伍：異硫氰酸熒光素(FITC）翠綠色，常與羅丹明(RB200)或異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）配伍，后者呈紅色。 方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影，樣本不能長(zhǎng)期保存

3、，組織結(jié)構(gòu)背景不清晰。雙重或多重免疫組化標(biāo)記7 熒光素配伍：異硫氰酸熒光素(FITC）翠綠色， 技術(shù)類(lèi)型有直接法和間接法之分。前者特異、快速，后者敏感、多用。 所用抗體試劑可為異種動(dòng)物抗體，也可為同種動(dòng)物抗體。 異種動(dòng)物抗體常混合應(yīng)用，操作步驟少，脫片率相對(duì)較低。雙重或多重免疫組化標(biāo)記8 技術(shù)類(lèi)型有直接法和間接法之分。前者特異、快速 同種動(dòng)物抗體多分別應(yīng)用，操作步驟加倍，脫片機(jī)率相對(duì)較高，前后重免疫熒光標(biāo)記交叉重疊機(jī)會(huì)多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處理。雙重或多重免疫組化標(biāo)記9 同種動(dòng)物抗體多分別應(yīng)用，操作步驟加倍，脫片機(jī) 操作舉例：垂體腺瘤-ACTH與GH雙重免疫熒光標(biāo)記染色（間接法） (1

4、)石蠟切片，厚5 m，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)。雙重或多重免疫組化標(biāo)記10 操作舉例：垂體腺瘤-ACTH與GH雙重(2)1人血清白蛋白（HAS）孵育10min （亦可用10正常羊血清代之），不洗。(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育 30min 37，濕盒。(4)0.05mol/L TBS(pH7.4,內(nèi)含1 Triten 100,下同)洗，10min3。雙重或多重免疫組化標(biāo)記11(2)1人血清白蛋白（HAS）孵育10min雙重或多重免疫(5)羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，濕盒，室溫避光反應(yīng)1h。(6)0.05mol/L T

5、BS(pH7.4)洗，10min3，(第一重ACTH-TRITC標(biāo)記染色已完成)。雙重或多重免疫組化標(biāo)記12(5)羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，濕盒，室溫避光反(7)切片逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，放在80烤箱或溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定24h，使第一重染色中二抗的抗原結(jié)合部位失活。(8)切片以TBS洗，5min4雙重或多重免疫組化標(biāo)記13(7)切片逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚(9)1 HSA（或10正羊血清）孵育30min，室溫，濕盒，不洗。(10)抗GH血清(McAb) 1:400，孵育30min，37，濕盒。(11)0.

6、05mol/L TBS(pH7.4)洗，10min3雙重或多重免疫組化標(biāo)記14(9)1 HSA（或10正羊血清）孵育30min，室溫，(12)羊抗鼠IgG-FITC 1:100,濕盒，室溫避光反應(yīng)1h。(13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，10min3 (第二重GH-FITC標(biāo)記染色完成)。(14)緩沖甘油封片。雙重或多重免疫組化標(biāo)記15(12)羊抗鼠IgG-FITC 1:100,濕盒，室溫避光反(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光觀察切片組織內(nèi)TRITC及FITC所標(biāo)示的ACTH及GH抗原（TRITC陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，F(xiàn)ITC陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色）。雙重或多重免

7、疫組化標(biāo)記16(15)熒光顯微鏡下分別以546nm及490nm波長(zhǎng)的激發(fā)光(16)用彩色底片對(duì)切片同一部位用546nm及490nm波長(zhǎng)激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標(biāo)示的ACTH與GH兩種抗原。雙重或多重免疫組化標(biāo)記17(16)用彩色底片對(duì)切片同一部位用546nm及490nm波長(zhǎng)TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）TITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游離FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被滅活圖1 同種動(dòng)物抗體間接法（分步固定）雙重免疫熒光熒色原理雙重或多重免疫組化標(biāo)記18TRITC-GAM鼠抗人ACTHTITC-GAM鼠抗人GHT（二）雙重或

8、多重免疫酶標(biāo)記染色 以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標(biāo)示同一切片內(nèi)兩種或兩種以上抗原為理論基礎(chǔ)所建立起來(lái)的多重免疫標(biāo)記染色方法。特點(diǎn)是光鏡下可以同時(shí)觀察和對(duì)比，樣品保存時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，一次曝光即可成像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用。雙重或多重免疫組化標(biāo)記19（二）雙重或多重免疫酶標(biāo)記染色雙重或多重免疫組化標(biāo)記19 常用標(biāo)記酶與底物的配伍 單酶雙底物-HRP-DAB(棕色):4CN(藍(lán)色) AEC(紅色):4CN(藍(lán)色) AP-萘酚AS-MX-堅(jiān)固紅(fast red 紅色)-堅(jiān)固藍(lán)(fast blue 藍(lán)色)雙重或多重免疫組化標(biāo)記20 常用標(biāo)記酶與底物的配伍雙重或多重免疫組化標(biāo)記20雙酶雙底物

9、-HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅(jiān)固藍(lán)) HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-堅(jiān)固紅)（直接法、間接法、橋法均可使用，靈敏度以橋法中的復(fù)合物法最高，特異性則以直接法最佳）雙重或多重免疫組化標(biāo)記21雙酶雙底物-HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅(jiān)固藍(lán) 操作方法類(lèi)同單酶標(biāo)記，有直接法、間接法、復(fù)合物法之分。 間接法與復(fù)合物法較常采用。 操作舉例 淋巴瘤輕鏈、的雙重酶標(biāo)記（雙酶雙底物）雙重或多重免疫組化標(biāo)記22 操作方法類(lèi)同單酶標(biāo)記，有直接法、間接法、復(fù)合(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水（若用含汞固定液固定的組織則需用0.5%碘的乙醇溶液脫汞5min，乙醇濃度為70，經(jīng)自來(lái)水洗后，以2

10、.5%硫代硫到鈉浸洗1min，水洗)；(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片30min,自來(lái)水洗，蒸餾水洗,入PBS(0.01mol/L pH7.2);雙重或多重免疫組化標(biāo)記23(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水（若用含汞固定液固定的組織則需用0(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；(4)加一抗(抗人 PcAb與抗人McAb的混合液)1:200，濕盒，37，45min或更長(zhǎng)；(5)PBS液，5min3雙重或多重免疫組化標(biāo)記24(3)滴加正羊血清1:10，濕盒，室溫，10min，不洗；雙雙重或多重免疫組化標(biāo)記培訓(xùn)課件(10)過(guò)氧化物酶顯色反應(yīng)：以DAB- H2O2液顯色 710min

11、(鏡下控制顯色程度)，PBS洗，5min3；(11)鹼性磷酸酶顯色反應(yīng)：以萘酚AS.MX及堅(jiān)固藍(lán)(fast blue)顯色1015min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗、自來(lái)水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下觀察雙重或多重免疫組化標(biāo)記26(10)過(guò)氧化物酶顯色反應(yīng)：以DAB- H2O2液顯色 7PPPAAA 圖2 雙酶雙底物(復(fù)合物法)雙重酶標(biāo)染色原理兔PAPGAR IgG兔抗KAg鼠APAAPGAM. IgG鼠抗人雙重或多重免疫組化標(biāo)記27PPPAAA 注：若用同種動(dòng)物抗血清分別進(jìn)行標(biāo)記染色時(shí)，尚需考慮在前后重染色之間是否設(shè)置“多聚甲醛蒸氣處理2-4h（封閉固定）或用pH2.2的甘氨酸-鹽酸溶

12、液處理2h（酸洗脫）的操作步驟”，目的為了避免前后重免疫試劑間的交叉反應(yīng)?？梢曨A(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定。雙重或多重免疫組化標(biāo)記28注：若用同種動(dòng)物抗血清分別進(jìn)行標(biāo)記染色時(shí)，尚需考慮在前后重染（三）雙重及多重免疫金標(biāo)記(電鏡） 電鏡下的雙重免疫標(biāo)記染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標(biāo)記物的不同電子密度或顆粒的不同大小來(lái)區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標(biāo)記方法。雙重或多重免疫組化標(biāo)記29（三）雙重及多重免疫金標(biāo)記(電鏡）雙重或多重免疫組化標(biāo)記29 常用的方法多為雙重免疫金標(biāo)記 優(yōu)點(diǎn)：高電子密度，分辨率高，抗原定 位精確，顆粒大小可人工控制， 標(biāo)記試劑易制備。 缺點(diǎn)：試劑質(zhì)量要求高，非特異吸附干擾 大(背景)雙

13、重或多重免疫組化標(biāo)記30 常用的方法多為雙重免疫金標(biāo)記雙重或多重免疫組化標(biāo)記30 類(lèi)型有直接法、間接法（異種動(dòng)物抗體或同種動(dòng)物抗體）-雙面染色，分步固定。標(biāo)記用的膠體金顆粒，直徑多采用5nm, 15nm組合，標(biāo)記不同類(lèi)別抗體(特異性一抗-直接法，間接抗體-間接法)。雙重或多重免疫組化標(biāo)記31 類(lèi)型有直接法、間接法（異種動(dòng)物抗體或同種動(dòng)物 應(yīng)用直接法進(jìn)行多標(biāo)，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、效果佳，尤多用于細(xì)胞表面抗原的雙重或多重標(biāo)記。缺點(diǎn)：敏感性較低，金標(biāo)抗體純度要求高。雙重或多重免疫組化標(biāo)記32 應(yīng)用直接法進(jìn)行多標(biāo)，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、效果佳 金標(biāo)抗體雙重抗原標(biāo)記常用間接法顯示，且多采用異種動(dòng)物抗體混合同步

14、操作。優(yōu)點(diǎn)：敏感性提高，操作步驟減少缺點(diǎn)：標(biāo)記二抗質(zhì)量要求高，背景染色深。 可通過(guò)采用固相吸附或過(guò)量二抗封閉，或用多聚甲醛蒸氣處理，使二抗的游離抗原結(jié)合部位（Fab段）滅活加以克服。雙重或多重免疫組化標(biāo)記33 金標(biāo)抗體雙重抗原標(biāo)記常用間接法顯示，且多采用 *舉例：垂體組織生長(zhǎng)激素(GH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)雙重免疫電鏡染色(間接法)-分步固定。 (1)取新鮮垂體腺瘤組織1mm3，蒸餾水洗，不經(jīng)餓酸固定，常規(guī)酒精脫水，用Lowicryl k4M包埋，超薄切片厚40nm，置無(wú)支持膜的鎳網(wǎng)上；雙重或多重免疫組化標(biāo)記34 *舉例：垂體組織生長(zhǎng)激素(GH)和促腎上腺皮質(zhì) (2)以0.05mol

15、/L TBS(pH7.4含1Triton X-100，下同)，浸洗5min； (3)加入1HSA 5min；不洗； (4)以兔抗ACTH血清(1:200)孵育，4，20h，室溫下2h，TBS洗，用上述一抗重復(fù)孵育1次，TBS噴射沖洗，然后浸洗10min，3次，TBS (pH8.2)浸洗5min；雙重或多重免疫組化標(biāo)記35 (2)以0.05mol/L TBS(pH7.4含1 (5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗5min； (6)1 HSA孵育5min，不洗；再以5nm膠體金標(biāo)記的羊抗兔，IgG孵育10min；0.02mol/L TBS (pH8.2)噴射沖洗，0.05mol/L

16、TBS (pH7.4)沖洗及浸洗，時(shí)間同前；雙重或多重免疫組化標(biāo)記36 (5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗 (7)蒸餾水浸洗后，空氣中干燥； (8)置盛有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，80溫箱中以多聚甲醛蒸氣處理1h，冷卻取出，入蒸餾水，換洗2次。雙重或多重免疫組化標(biāo)記37 (7)蒸餾水浸洗后，空氣中干燥；雙重或多重免疫組化 (9)再按(4)-(8)步驟作第二重抗原染色，這次一抗用鼠抗GH單克隆抗體(1:400)；二抗用15nm膠體金標(biāo)記的羊抗鼠IgG，在二抗孵育并清洗后，入2的戊二醛及3多聚甲醛的TBS (pH7.4)溶液中固定30min，經(jīng)蒸餾水換洗3次，再以1醋酸鈾和構(gòu)櫞酸

17、鉛作常規(guī)電子密度的染色。雙重或多重免疫組化標(biāo)記38 (9)再按(4)-(8)步驟作第二重抗原染色，(10)電鏡觀察 結(jié)果：見(jiàn)ACTH細(xì)胞和GH細(xì)胞的分泌顆粒分別被5nm和15nm的膠體金顆粒所顯示，除很少量背景染色外，標(biāo)記位置精確，無(wú)交叉重疊與彌散現(xiàn)象。雙重或多重免疫組化標(biāo)記39(10)電鏡觀察雙重或多重免疫組化標(biāo)記39（四）其它雙重標(biāo)記法 1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(先酶標(biāo) 后熒光) ； 2.免疫熒光法與免疫金銀法聯(lián)合應(yīng)用(先免疫金銀標(biāo)記后熒光標(biāo)記) ；3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應(yīng)用(20nm,紅 色），此法忌用銀液放大，易吸附干擾；4.免疫金銀法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(對(duì)比明 顯)。 雙重或多重免疫組化標(biāo)記40（四）其它雙重標(biāo)記法 1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(先三、注意事項(xiàng) 1.標(biāo)記染色的順序確定需視組織標(biāo)記抗原的性質(zhì)，量少、脆弱先標(biāo)記，量多、耐受后標(biāo)記。 2.結(jié)構(gòu)保存與抗原保護(hù)并重，電鏡樣品一般忌用餓酸后固定，PG固定液中的