第七章抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用-暨南大學(xué)抗體工程研究中心

1、第七章 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用 不論天然的還是人工合成的分子，只要能被機體的免疫系統(tǒng)識別的都可以誘導(dǎo)機體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。大多數(shù)抗體和抗原本身是既有免疫原性(誘發(fā)產(chǎn)生特異抗體)，又有反應(yīng)原性(與特異的抗體相結(jié)合)?？乖c抗體的特異性反應(yīng)不僅可以在體內(nèi)進行，而且可以在體外進行。一切利用血清學(xué)技術(shù)方法所進行的各種測試都是基于這一根本的特性。抗體反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用之廣泛已經(jīng)遠遠超出了免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、甚至生命科學(xué)的范圍，成為類微量，靈敏，快速的檢測分析方法。本章著重介紹抗體制備，抗體抗原反應(yīng)原理及技術(shù)方法的應(yīng)用。第一節(jié)抗體體的制備備 環(huán)環(huán)境中的的大部分分生物(包括病病原生物物)及其其產(chǎn)物分分子和一一些

2、化合合物對哺哺乳動物物的免疫疫系統(tǒng)而而言是外外源抗原原，這些些抗原能能通過侵侵染或其其他的途途徑刺激激免疫系系統(tǒng)，產(chǎn)產(chǎn)生以抗抗體為主主的體液液免疫應(yīng)應(yīng)答。同同樣用抗抗原人工工免疫實實驗動物物，可以以獲得含含有特異異性抗體體的血清清，稱為為抗血清清(anntisseruum)，因因血清中中抗體是是多個抗抗原決定定簇刺激激不同BB細胞克克隆而產(chǎn)產(chǎn)生的抗抗體，所所以稱多多克隆抗抗體(ppolyycloonall anntibbodyy)。一一個B細細胞克隆隆所分泌泌的抗體體即為單單克隆抗抗體。用用免疫動動物的BB細胞與與骨髓瘤瘤細胞融融合，在在體外可可以分離離出許多多單個BB細胞克克隆，以以此方法法

3、可制備備單克隆隆抗體(monnocllonaal aantiiboddy)。隨隨著分子子生物學(xué)學(xué)技術(shù)的的發(fā)展，已已經(jīng)可以以用抗體體基因文文庫(aantiiboddy ccombbinaatorriall liibraary)篩選制制備單克克隆抗體體。應(yīng)用用基因工工程技術(shù)術(shù)，根據(jù)據(jù)需要對對抗體進進行改造造，獲得得基因工工程抗體體(ennginneerringg anntibbodyy)，以以及催化化性抗體體(caatallytiic aantiiboddy 或或aboozymme)等等的全新新的抗體體。 一、抗抗血清的的制備 1免免疫動物物 (1)抗原：免疫動動物是制制備抗血血清的第第步。免免疫

4、所用用的抗原原可用病病毒、細細菌或者者其他蛋蛋白質(zhì)抗抗原，如如果使用用半抗原原如小分分子激素素等，必必須與大大分子載載體連接接，連接接劑見表表71。抗抗原的用用量視抗抗原種類類及動物物而異，次注射小鼠可以少至幾個微克，免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應(yīng)增加，從幾百g次至幾mg次。2)佐劑劑及乳化化：佐劑劑可以幫幫助抗原原在注射射部位緩緩慢釋放放，以增增加免疫疫刺激的的效果。佐佐劑有完完全和不不完全佐佐劑之分分。完全全佐劑加加有滅活活的分枝枝桿菌(如卡介介苗)或或棒狀桿桿菌。福福氏佐劑劑可從試試劑公司司購買，也也可用羊羊毛脂和和石蠟油油按1：24混合合自行制制備。佐佐劑與抗抗原按11：1的的

5、比例混混合乳化化為均勻勻的乳液液，放置置后不會會發(fā)生油油水分離離。 (3)免免疫動物物：常用用于制備備抗血清清的動物物打豚鼠鼠、家免免、小鼠鼠、大鼠鼠等，如如果大量量生產(chǎn)可可用動物物羊、馬馬等，動動物接受受免疫的的乳液量量小鼠為為100200 mLL，家兔兔為24mLL。抗原原免疫動動物的途途徑取決決于動物物種類、抗抗原特性性和是否否使用佐佐劑。腹腹腔注射射(ip)，肌肌肉注射射(im)，皮皮內(nèi)注射射(id)和皮下下注射(scc)適適合于任任何抗原原，這些些途徑主主要刺激激局部淋淋巴結(jié)發(fā)發(fā)生免疫疫應(yīng)答，初初次免疫疫和免疫疫加強注注射均可可使用。靜靜脈注射射(i.v.)則只適適合于可可溶性抗抗原

6、及分分散的單單細胞懸懸液，且且不能使使用佐劑劑，其誘誘發(fā)的免免疫應(yīng)答答主要發(fā)發(fā)生在脾脾臟。此此外，在在單克隆隆抗體制制備時，亦亦可用脾脾臟直接接注射或或體外免免疫方法法，尤其其對微量量抗原比比較實用用。體外外免疫方方法也常常用于人人源單克克隆抗體體的制備備。體外外免疫時時將脾細細胞或外外周血淋淋巴細胞胞(包括括B細胞胞，T細細胞及抗抗原遞呈呈細胞)與抗原原一起作作體外培培養(yǎng)，然然后再與與骨髓瘤瘤細胞融融合。初初次免疫疫后要經(jīng)經(jīng)過23次以以上的免免疫加強強以保證證能形成成較高水水平的IIgC抗抗體。兩兩次免疫疫注射之之間的時時間間隔隔，一般般34周比比較適合合大部分分動物，小小動物可可間隔110

7、14dd，大動動物則在在2月左左右。在在免疫加加強最后后一次注注射后的的一周內(nèi)內(nèi)采集抗抗血清，可可獲得高高水平的的抗體。 22抗血清清的純化化與保存存 （11）采血血：加強強免疫的的動物223次后后，可通通過耳靜靜脈或眼眼球(小小鼠)采采血，進進行抗血血清效價價測定。當(dāng)當(dāng)效價達達到理想想的高度度后，可可以采血血。采血血方式可可以從心心臟直接接取血，也也可通過過動脈放放血。待待血液凝凝固后用用針筒或或吸管吸吸取血清清。 (2)抗抗血清的的純化與與保存：除抗體體外血清清中含有有多種其其他蛋白白成分。為為了避免免這些蛋蛋白質(zhì)干干擾抗體體(免疫疫球蛋白白)標記記反應(yīng)和和抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)，抗血血清可經(jīng)經(jīng)

8、過純化化以獲得得單一的的機體(常為IIgG)組分。常常用的純純化IggG的方方法為飽飽和硫酸酸胺鹽析析和層析析法。蛋蛋白質(zhì)在在不同的的鹽濃度度的溶液液中，其其溶解度度不一樣樣，鹽離離子干擾擾蛋白質(zhì)質(zhì)和水分分子間氫氫鍵形成成，因為為水鹽結(jié)合合比水蛋白質(zhì)質(zhì)結(jié)合更更穩(wěn)定，蛋蛋白質(zhì)即即可從溶溶液中沉沉淀出來來。蛋白白質(zhì)分子子越大，沉沉淀時所所需鹽離離子濃度度越低。免免疫球蛋蛋白(MMr 11.5105)比血血清中主主要蛋白白質(zhì)白蛋蛋白(MM r 6.77104)的分分子大得得多，抗抗體在33050飽和度度的硫酸酸鹽中析析出，而而白蛋白白需在77080飽和度度才析出出，因此此常用333飽飽和度的的硫酸胺

9、胺純化血血清中的的IgGG。鹽析析時為了了減少抗抗體變性性，需在在4進行，同同時用ppH8.0緩沖沖液稀釋釋抗血清清，以減減少蛋白白濃度過過高而發(fā)發(fā)生共沉沉淀。銨銨鹽的溶溶解度不不隨溫度度變化而而明顯改改變，00和25僅差33，而而鈉鹽則則相差55倍，因因此常在在低溫沉沉淀時用用銨鹽，室室溫沉淀淀用鈉鹽鹽。銨鹽鹽對抗體體的標記記反應(yīng)(如FIITC和和biootinn標記時時)有一一定的干干擾作用用。 鹽鹽析法只只能部分分純化抗抗體，更更高純度度的抗體體制劑可可用層析析法制備備。 IIgM五五聚體相相對分子子質(zhì)量達達9.77105，比血血清中任任何其他他蛋白都都大，用用分子篩篩層析很很容易將將其

10、純化化。IggG在PPH 880時時帶負電電荷，能能與DEEAE纖纖維素上上的陽離離子結(jié)合合，因此此可用離離子交換換層析來來純化IIgG。IIgG純純化最常常用的方方法為親親和層析析。IggG與葡葡萄球菌菌A蛋白白和鏈球球菌G蛋蛋白具合合高度的的親和性性，可用用這兩種種蛋白質(zhì)質(zhì)交聯(lián)親親和層析析柱將IIgG純純化。大大部分IIgG與與蛋白AA結(jié)合PPH為889，洗洗脫PHH為24；而而與蛋白白G的結(jié)結(jié)合PHH為57，洗洗脫PHH為910。CC蛋白更更適合于于IgGG的純化化，不但但反應(yīng)條條件為溫溫和的弱弱酸性或或弱堿性性，并且且與IggG的結(jié)結(jié)合力高高于A蛋蛋白。GG蛋自能能與大部部分動物物種類

11、的的IgGG結(jié)合，而而A蛋白白對小鼠鼠IgGG1、大大鼠IggG2bb、人IIgG33、馬和和綿羊IIgG結(jié)結(jié)合力弱弱或不能能結(jié)合GG蛋白和和A蛋白白均不能能與雞IIgG結(jié)結(jié)合。 抗抗血清或或純化的的抗體在在低溫保保存可維維持活性性數(shù)年，反反復(fù)凍融融使抗體體很快失失活，被被細菌或或霉菌污污染的抗抗血清或或IgGG制品也也易失去去活性。稀稀釋的抗抗血清加加入防腐腐劑疊氮氮化鈉和和保護劑劑如BSSA等可可于4保存。長長期保存存常用等等量甘油油于20以下冷冷藏。也也可置于于 500飽和和硫酸銨銨中4保存，還還可以冷冷凍干燥燥保存。 33抗血清清的特性性鑒定 根根據(jù)不同同目的制制備的抗抗血清，對對其中

12、所所含抗體體的濃度度，特異異性及免免疫球蛋蛋白種類類的要求求也不一一樣。為為了獲得得質(zhì)量和和數(shù)量上上合符要要求的抗抗血清，在在收集動動物血清清前必須須對免疫疫效果進進行檢測測，對收收獲后的的抗血清清也必須須對些參數(shù)數(shù)進行分分析，如如效價、親親和力及及交叉反反應(yīng)等。 根據(jù)據(jù)不同的的抗原性性質(zhì)選用用合適的的檢測方方法。最最常用的的為免疫疫沉淀，EELISSA，放放射免疫疫等。 效效價又稱稱滴度(titter)，是常常用于表表達抗血血清中特特異性抗抗體相對對含量的的個半定定量指標標，即在在給定的的條件下下，結(jié)合合定量抗抗原的抗抗血清的的稀釋度度?？寡褰?jīng)一一系列稀稀釋后(如倍比比稀釋)與定量量的抗

13、原原反應(yīng)，以以能檢測測抗血清清最大稀稀釋倍數(shù)數(shù)即為該該抗血清清的效價價。不同同的檢測測方法測測定同一一種抗血血清的效效價，靈靈敏度不不一樣，抗抗血清的的效價也也不一樣樣，如沉沉淀反應(yīng)應(yīng)(瓊脂脂雙擴散散)與EELISSA二者者的效價價相差甚甚大，后后者遠高高于前者者。放射射免疫分分析(RRIA)常用于于標記小小分子抗抗原來檢檢測抗血血清的效效價。 親親和力(afffiniity)表示抗抗血清與與相應(yīng)抗抗原的結(jié)結(jié)合強度度，是描描述抗體體持異性性的重要要指標，常用親和常常數(shù)K表表示。親親和常數(shù)數(shù)K與抗抗原抗體體反應(yīng)的的平衡常常數(shù)有關(guān)關(guān)： K+ AgAbb AggAb KAgAbb K+ K= KK=

14、AgAb KK 式中K+為為結(jié)合速速度常數(shù)數(shù)，K為解離離速度常常數(shù)。親親和常數(shù)數(shù)K的測測定見第第二節(jié) 抗抗體特異異性與交交叉反應(yīng)應(yīng)：抗體體是特異異的。只只與相應(yīng)應(yīng)抗原反反應(yīng)。實實際制備備的抗體體卻常有有非特異異性反應(yīng)應(yīng)，這是是因為抗抗原不純純造成的的。多組組分抗原原之間存存在共同同的抗原原決定簇簇，或者者兩個抗抗原決定定簇結(jié)構(gòu)構(gòu)類似能能與同一一抗體結(jié)結(jié)合，均均可出現(xiàn)現(xiàn)抗體與與異源抗抗原的交交叉反應(yīng)應(yīng)。用瓊瓊脂雙擴擴散能簡簡便直觀觀地反映映不同抗抗原與同同一抗血血清，或或不同抗抗血清與與同一抗抗原的交交叉反應(yīng)應(yīng)。 二二、單克克隆抗體體的制備備 11制備原原理 單單克隆抗抗體(MMAb)與抗血血清

15、(又又稱多克克隆抗體體，PAAb)最最主要的的區(qū)別是是MAbb為單一一種B細細胞克隆隆所產(chǎn)生生的一種種均一的的免疫球球蛋白分分子。所所以MAAb是BB細胞克克隆的標標志，是是一種獨獨特型的的抗體，它它的特異異性是針針對一個個抗原決決定簇的的。制備備單克隆隆抗體不不能用化化學(xué)分離離的方法法從多克克隆抗體體中去分分離純化化得到它它，而是是用分離離產(chǎn)生抗抗體的BB細胞克克隆的方方法得到到它。為為了使BB細胞克克隆能在在體外人人工培養(yǎng)養(yǎng)下長期期存活并并產(chǎn)生完完全均一一的MAAb，GGKhleer合MMilssteiin于119755年創(chuàng)立立了雜交交瘤方法法。所以以制備單單克隆抗抗體的技技術(shù)又稱稱雜交瘤

16、瘤技術(shù)(hybbreddomaa teechnniquue)。 雜雜交瘤技技術(shù)的基基本原理理是用分分泌抗體體但不能能長期培培養(yǎng)的BB細胞與與能在體體外長期期培養(yǎng)并并可低溫溫保存的的腫瘤細細胞進行行雜交。篩篩選得到到的雜交交瘤細胞胞應(yīng)該是是既能分分泌抗體體又有瘤瘤細胞的的特性，可可長期傳傳代培養(yǎng)養(yǎng)，又可可在液氮氮中保存存的細胞胞。把這這些細胞胞單克隆隆化，用用單克隆隆化的雜雜交瘤細細胞進行行單克隆隆抗體的的生產(chǎn)（圖圖711）。 2BB細胞與與瘤細胞胞的來源源及雜交交瘤選擇擇原理 最最常用的的單克隆隆抗體是是小鼠的的單抗，此此外也有有大鼠的的和人源源的單抗抗。人源源單抗制制備比較較復(fù)雜。小小鼠單抗

17、抗的制備備通常是是使用BBalbbc小小鼠的BB細胞和和它的骨骨髓瘤細細胞。大大鼠的單單抗制備備通常用用Louuc大大鼠及其其骨髓瘤瘤和Y33AOO大鼠及及其骨髓髓瘤細胞胞(表772)。BB細胞是是從免疫疫動物的的脾臟中中分離出出來的。動動物免疫疫方法與與抗血清清制備相相同，只只是在制制備脾臟臟前3dd必須進進行一次次靜脈加加強注射射以保證證得到的的B細胞胞有旺盛盛的分泌泌抗體的的活性。骨骨髓瘤細細胞有許許多細胞胞株是經(jīng)經(jīng)過誘變變和篩選選得到的的缺陷型型。篩選選的標準準是瘤細胞胞本身不不產(chǎn)生抗抗體或者者產(chǎn)生抗抗體的某某種鏈，但但不能分分泌；是次黃黃嘌呤鳥鳥嘌呤核核苷酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶(HGPPRT)和

18、胸腺腺嘧啶激激酶(TTK)的的缺陷型型。因為為這種缺缺陷型的的瘤細胞胞正常的的核酸合合成途徑徑被氨基基喋吟(amiinoppterrin)阻斷后后，由于于缺失這這些酶，即即使補充充它的底底物次黃黃嘌呤(H)和和胸腺嘧嘧啶(TT)，核核酸合成成的旁路路也不能能起到救救援的作作用，結(jié)結(jié)果導(dǎo)致致瘤細胞胞死亡(圖72)。而而雜交瘤瘤細胞因因帶有BB細胞的的全套基基因，在在HATT存在的的條件下下借助于于HGPPRT和和TK的的作用通通過替代代的核酸酸合成途途徑能正正常合成成DNAA和RNNA。所所以雜交交瘤能正正常地生生長繁殖殖而被選選擇出來來。未被被融合的的游離的的B細胞胞只能存存活3dd而后自自行

19、死亡亡。這就就是用HHAT培培養(yǎng)基進進行選擇擇的原理理。 3細胞雜雜交與選選擇培養(yǎng)養(yǎng) (1)融融合：細細胞雜交交之前，要要分別準準備好脾脾臟的BB細胞懸懸液和小小鼠骨髓髓瘤細胞胞(如SSP20Agll4細胞胞株)。免免疫后的的小鼠脾脾臟在無無菌條件件下破碎碎，將BB細胞懸懸浮在沒沒有血清清的培養(yǎng)養(yǎng)液中(通常使使用RPPMIll6400商品配配制)，并并洗滌33次去掉掉小鼠的的血清。SSP20細胞胞是用加加有100胎牛?；蛐∨ＥＱ迮嗯囵B(yǎng)的，每每天更換換新鮮培培養(yǎng)液使使成為對對數(shù)分裂裂期生長長旺盛的的細胞。細細胞用RRPMIIl6440洗滌滌23次，把把兩種細細胞合并并在同試管中中，用550的的

20、聚乙二二醇(相相對分子子質(zhì)量為為1000015000)作作為融合合劑，在在37條件下下融合ll2miin。然然后用116400培養(yǎng)液液緩慢稀稀釋，然然后除去去PEGG，將細細胞分散散至HAAT選擇擇培養(yǎng)板板中。電電融合方方法也可可用于單單克隆抗抗體制備備，雖融融合率較較高，但但一次融融合的細細胞數(shù)少少，且需需專門設(shè)設(shè)備，故故限制了了其廣泛泛使用。融融合時脾脾細胞和和骨髓瘤瘤細胞的的比例在在5：1110：1均可可獲得滿滿意結(jié)果果，每次次融合細細胞數(shù)量量在1007108較為合合適。融融合后的的細胞在在40或或96孔孔板上的的HATT培養(yǎng)液液(RPPMIll6400含10020胎牛或或小牛血血清和H

21、HAT)中377，5CO22條件下下培養(yǎng)。融融合后的的細胞懸懸液中只只有脾細細胞和骨骨髓瘤細細胞形成成的雜交交瘤細胞胞能在HHAT培培養(yǎng)基中中生長，其其他形式式的融合合細胞均均不能生生長未未融合的的細胞也也不能在在HATT培養(yǎng)液液中生存存(表773)。 在在融合后后的細胞胞培養(yǎng)過過程中，飼飼養(yǎng)細胞胞(feeedeer ccelll)有助助于雜交交瘤細胞胞的生長長。飼養(yǎng)養(yǎng)細胞可可用同種種動物的的腹腔細細胞或胸胸腹細胞胞。腹腔腔細胞中中的吞噬噬細胞能能清除死死亡細胞胞碎片。使使背景更更為清潔潔“干凈”。同時時飼養(yǎng)細細胞分泌泌的細胞胞因子或或活性物物質(zhì)有助助于雜交交瘤細胞胞的生長長?，F(xiàn)有有商品“雜交

22、瘤瘤細胞生生長因子子”可用于于替代飼飼養(yǎng)細胞胞。 (2)陽陽性雜交交瘤細胞胞的篩選選與單克克降化：雜交細細胞經(jīng)約約1014dd培養(yǎng)后后，形成成可用的的細胞集集落(克克隆)。經(jīng)經(jīng)過幾次次更換培培養(yǎng)液(HT培培養(yǎng)液)后進行行抗體活活性檢測測。常用用的篩選選槍測方方法是EELISSA和凝凝集試驗驗，前者者常用于于可溶性性抗原，后后者適用用于細胞胞、細菌菌等表面面抗原。此此外，DDotELIISA、免免疫印跡跡及免疫疫熒光試試驗均可可用于雜雜交瘤細細胞的篩篩選。 使許許多細胞胞克隆混混合生長長的細胞胞分離為為單個的的細胞克克隆的過過程稱克克隆化(colloniizattionn)最常常用的單單克隆化化

23、方法是是有限稀稀釋法(limmiteed ddiluutioon)，即即將混合合細胞經(jīng)經(jīng)稀釋后后分裝于于培養(yǎng)板板上，使培養(yǎng)養(yǎng)板的大大部分孔孔中只出出現(xiàn)一個個細胞。為為了確保?？贵w分分泌細胞胞來源于于單個細細胞，克克隆化過過程可重重復(fù)進行行，稱為為亞克隆隆化(ssubcclonnizaatioon)。除除有限稀稀釋法外外，熒光光激活細細胞分揀揀法(FACSS)也用用于雜交交瘤細胞胞的克隆隆化過程程。 44單克克隆抗體體的擴大大生產(chǎn) 產(chǎn)產(chǎn)生特異異性抗體體的單克克隆雜交交瘤細胞胞株應(yīng)立立即擴大大培養(yǎng)，以以獲得足足夠的細細胞用于于保存和和生產(chǎn)可可供應(yīng)用用的抗體體。生產(chǎn)產(chǎn)大量單單克隆抗抗體的方方法目前前

24、常用的的有3種種：小鼠鼠腹水制制備，大大瓶培養(yǎng)養(yǎng)和中空空纖維反反應(yīng)器，前前者多用用于實驗驗室制備備，后二二者適應(yīng)應(yīng)于工廠廠化生產(chǎn)產(chǎn)。 腹腹水制備備：雜交交骨髓瘤瘤細胞在在腹腔中中定植，并并產(chǎn)生大大量腹水水。選用用與單克克隆抗體體制備所所用相同同的動物物品系或或者含有有相同基基因的FFl代雜雜交品系系。雜交交F1代代品系更更適合于于腹水制制備，如如果用異異源動物物制備腹腹水時可可選用無無MHCC限制性性的裸鼠鼠。用小小鼠制備備腹水時時，先用用礦物油油或Prristtanee致敏，以以抑制其其免疫功功能，利利于腹水水的形成成。腹腔腔注射1106107個雜交交瘤細胞胞，經(jīng)過過710 d后形形成腹水水

25、。每只只小鼠可可獲得335mLL腹水，每每mL含含IgGG抗體可可達510mmg。腹腹水中含含有較多多的雜蛋蛋白和非非特異性性IgGG，并且且含有許許多蛋白白酶，易易使抗體體失活，因因此腹水水收集后后應(yīng)盡快快純化，以以防止降降解。 大大瓶培養(yǎng)養(yǎng)：采用用10000mLL或更大大的搖瓶瓶培養(yǎng)。大大瓶培養(yǎng)養(yǎng)上清體體積大，但但抗體濃濃度低，給給抗體純純化帶來來很大困困難，消消耗人力力和培養(yǎng)養(yǎng)液，增增加生產(chǎn)產(chǎn)成本。 中中空纖維維反應(yīng)器器：是比比較經(jīng)濟濟的單克克隆抗體體生產(chǎn)方方法。該該裝置由由具有半半透膜性性質(zhì)的成成束的微微孔纖維維組成，雜雜交瘤細細胞位于于纖維外外部的小小量培養(yǎng)養(yǎng)液中，培培養(yǎng)液在在纖維的

26、的微孔中中循環(huán)，供供給營養(yǎng)養(yǎng)和帶走走廢物，抗抗體大分分子和小小分子化化合物被被隔開。高高密度的的雜交瘤瘤細胞能能在此系系統(tǒng)中維維持數(shù)月月，每天天可產(chǎn)生生數(shù)百毫毫克的抗抗體，抗抗體濃度度高，體體積小易易于純化化。 胎(小)牛血清清一直是是細胞培培養(yǎng)所必必須的，在在單克隆隆抗體生生產(chǎn)過程程中培養(yǎng)養(yǎng)液中的的血清蛋蛋白使抗抗體的純純化增加加了困難難，近年年開發(fā)的的無血清清培養(yǎng)技技術(shù)已逐逐漸用于于單克隆隆抗體的的生產(chǎn)中中。 55人單單克隆抗抗體的制制備 小小鼠的單單克隆抗抗體蛋白白應(yīng)用于于人體后后，作為為抗原能能引起人人的免疫疫應(yīng)答，大大大降低低其生物物活性，并并可能導(dǎo)導(dǎo)致變態(tài)態(tài)反應(yīng)。因因此人源源單克隆

27、隆抗體在在臨床治治療上有有廣泛應(yīng)應(yīng)用前景景，引起起人們的的普遍興興趣。但但是人單單克隆抗抗體制備備存在許許多技術(shù)術(shù)上和倫倫理上的的障礙，如如人雜交交瘤細胞胞系不穩(wěn)穩(wěn)定，有有些抗原原不能對對人進行行人工免免疫，人人B細胞胞只能從從外周血血中分離離而無法法從脾臟臟取得等等。盡管管如此，一一些人源源單克隆隆抗體已已經(jīng)獲得得，技術(shù)術(shù)上也在在逐步完完善起來來。 人人的瘤細細胞株UU2666常用來來與人外外周血BB細胞融融合以獲獲得人源源單克隆隆抗體。另另一些淋淋巴母細細胞抹(LCLL)則來來源于EEB病毒毒轉(zhuǎn)化的的淋巴細細胞，如如GMll5000，W11L2和和ARHH77等等也用于于雜交瘤瘤細胞的的制

28、備。這這些細胞胞系表現(xiàn)現(xiàn)ED病病毒核抗抗原(EEBNAA)陽性性，且形形成的雜雜交瘤細細胞抗體體的分泌泌水平不不高。 獲獲得人單單克隆抗抗體的另另一方法法是用EEBV直直接轉(zhuǎn)化化某些抗抗體分泌泌細胞，使使之成為為“不死”的細胞胞在體外外培養(yǎng)。EEBV感感染人BB細胞后后，病毒毒基因插插入人BB細胞基基因組中中，有11的細細胞轉(zhuǎn)化化為“不死”的細胞胞。B細細胞轉(zhuǎn)化化可通過過“病毒驅(qū)驅(qū)動”和“細胞驅(qū)驅(qū)動”兩種方方法獲得得。前者者是將BB細胞與與分泌EEBV的的B9558細胞胞系一同同培養(yǎng)，后后者則是是與EBBNA陽陽性的LLCL細細胞一同同培養(yǎng)。“細胞驅(qū)動”轉(zhuǎn)化的B細胞比較穩(wěn)定，抗體分泌能力也較強

29、。 人人淋巴母母細胞系系和人雜雜交瘤細細胞較難難獲得，人人單克隆隆抗體也也可以通通過異源源雜文的的辦法制制備，即即將EBBV轉(zhuǎn)化化的B細細胞與小小鼠骨髓髓瘤細胞胞融合，將將獲得的的異源雜雜交瘤細細胞再與與免疫后后的B細細胞融合合，得到到人單克克隆抗體體分泌細細胞，不不產(chǎn)生自自身免疫疫球蛋白白，EBBVA也也是陰性性。 三三、基因因工程抗抗體的制制備 11抗體體的化學(xué)學(xué)修飾 抗抗體Fcc段用雙雙功能連連接劑與與熒光素素，同位位素，酶酶，發(fā)光光化合物物，稀土土元素以以及藥物物，毒素素等連接接后，并并不影響響其Faab功能能區(qū)與特特異性抗抗原結(jié)合合。根據(jù)據(jù)交聯(lián)物物的性質(zhì)質(zhì)不同，標標記的抗抗體可用用作

30、診斷斷試劑，也也可作為為藥物的的定向載載體，引引導(dǎo)藥物物或毒素素到達抗抗原存在在部位使使藥物或或使毒素素發(fā)揮更更有效的的作用，即即俗稱“生物導(dǎo)導(dǎo)彈”。從而而減少藥藥物、毒毒素、同同位素、酶酶在腫瘤瘤治療過過程中引引起嚴重重的副作作用，大大大提高高治療腫腫瘤的效效果。 許許多毒素素如蓖麻麻毒素，白白喉毒素素，天花花粉，紅紅豆毒素素等均為為蛋白質(zhì)質(zhì)或糖蛋蛋白，可可用雙功功能劑與與抗體相相連；嗎嗎啡，前前列腺素素，氨甲甲喋吟，磷磷酸酯酶酶C等含含有羧基基能用碳碳二亞胺胺(EDDC)，混混合酸酐酐法與抗抗體的氨氨基形成成酰胺鍵鍵；同樣樣，含脂脂肪胺的的藥物如如慶大雷雷素，阿阿霉素在在水溶性性EDCC的

31、作用用下與抗抗體的羧羧基連接接；而含含芳香胺胺的藥物物則先在在低溫下下與亞硝硝酸作用用形成重重氮化合合物，再再與抗體體分子上上的酪氨氨酸或組組氨酸殘殘基形成成偶氮鍵鍵?？傊ㄟ^抗抗體的化化學(xué)修飾飾把抗體體的特異異性用到到定向給給藥和定定位檢測測上。 22抗體體基因文文庫 抗抗體基因因文庫(anttiboody reccombbinaatioon llibrraryy)是將將不同的的重鏈和和輕鏈基基因隨機機組合，克克隆到合合適的表表達載體體中，在在原核細細胞表達達不同的的抗體，形形成一個個抗體庫庫，從這這個抗體體庫中，用用抗原可可以篩選選到相應(yīng)應(yīng)的抗體體基因(圖73)。抗抗體基因因來源于于雜交

32、瘤瘤細胞或或動物BB細胞(免疫或或未免疫疫)的DDNA和和mRNNA 。用質(zhì)粒作為為抗體文文庫的載載體，雖雖然也可可能表達達有活性性的抗體體分子或或片段，但但由線狀狀噬菌體體表達更更為方便便有效。MM13、ffd、FF1等噬噬菌體的的外殼蛋蛋白由55種蛋白白組成：p、p、p、p和p。每種種含量不不一，其其中p含量最最多，每每個噬菌菌體有227000個p亞基，其其余4種種蛋白僅僅5個拷拷貝。增增加噬菌菌體外殼殼蛋白的的長度并并不影響響噬菌體體的裝配配，抗體體以融合合蛋白的的形式表表達于噬噬菌體表表面。噬噬菌體表表達質(zhì)粒粒常用的的有fddCAAT1、ffdttetDOGG1、PPHENN1、ppC

33、ommb3和和pCoomb33H等?？箍贵w融合合蛋白構(gòu)構(gòu)建多用用p和p，p拷貝數(shù)數(shù)高，低低親和力力的抗體體蛋白容容易篩選選出來。在噬菌體表表達抗體體時，常常常不表表達完整整的抗體體分子，（因因為CHH2上不不能進行行糖基化化）。根根據(jù)不同同的引物物得到重重鏈的VVH或VHCH1區(qū)，輕輕鏈的VVL或VLCL區(qū)。VVL和VH兩個片片段用一一短肽作作連接片片段，形形成單鏈鏈可變區(qū)區(qū)（siingllecchaiin ffraggmennt vvariiablle，sscFvv）；VVHCH1和VVLCL兩片段段則形成成Fabb片段。另另外，單單獨的VVH和VL也能結(jié)結(jié)合抗原原，如果果二者形形成同源源或

34、異源源二聚體(ddAb)，則穩(wěn)穩(wěn)定性和和親和性性明顯提提高(圖圖74)。此此外在抗抗體片段段DNAA末端加加上一些些功能蛋蛋白(如如堿性磷磷酸酶和和蛋白毒毒素)的的基因，則則表達的的抗體就就帶有一一定生物物活性功功能片段段，可用用于檢測測或治療療。如果果在抗體體基因末末端加上上終止子子(TAAG)則則表達的的抗體片片段是可可溶性的的，而不不是結(jié)合合在噬菌菌體表面面。 用特異異性抗原原免疫的的動物BB細胞構(gòu)構(gòu)建抗體體的噬菌菌體文庫庫，抗體體親和性性高，用用與免疫疫抗原不不同的抗抗原篩選選得到的的抗體親親和性普普遍較低低?？捎糜媚M天天然體細細胞突變變的方法法來提高高親和力力。如混混雜重組組法，即

35、即將己獲獲得的輕輕鏈或重重鏈的VV片段切切下，再再克隆至至隨機的的文庫中中的V區(qū)區(qū)構(gòu)成二二級文庫庫，使HH鏈和LL鏈混雜雜，可以以使抗體體片段的的親和性性提高。利利用PCCR錯配配將隨機機突變引引人至抗抗體的抗抗原結(jié)合合區(qū)，也也能提高高對抗原原的親和和力。先先用低親親和力的的載體在在噬菌體體的P表達，篩篩選后、將將抗體基基因片段段PCRR擴增轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至P上表達達，可獲獲得高親親和力的的抗體片片段。 抗抗體基因因文庫有有兩個優(yōu)優(yōu)點，一一是從不不適合進進行人工工免疫的的物種獲獲得單克克隆抗體體，如人人源單克克隆抗體體；二是是可快速速方便獲獲得單克克隆抗體體。 33抗體體基因的的改造 將將鼠源抗抗體的V

36、V區(qū)基因因與人源源抗體CC區(qū)基因因重組，獲獲得的嵌嵌合抗體體(chhimeericcal anttiboody)，可保保留鼠抗抗體對抗抗原的高高親和性性，又減減弱鼠源源抗體對對人的免免疫原性性，提高高治療性性抗體的的效果。重組的嵌合合抗體基基因轉(zhuǎn)化化骨髓瘤瘤細胞或或中國地地鼠卵細細胞(CCH0)，可在在其中表表達。為為了進一一步地消消除鼠抗抗體V區(qū)區(qū)框架區(qū)區(qū)(FWW)的異異源性，可可實行CCDR移移植(CCDR graaftiing)，以獲獲得與鼠鼠FW類類似的人人FW結(jié)結(jié)構(gòu)的嵌嵌合抗體體。 噬噬菌體表表達的抗抗體僅含含V區(qū)(scFFv)或或Fabb片段，缺缺乏Fcc區(qū)，使使抗體的的穩(wěn)定性性下

37、降，半半衰期縮縮短，與與Fc受受體結(jié)合合功能也也消失。因因此在抗抗體功能能片段的的末端連連接A蛋蛋白、酶酶、細胞胞因子、CCD4和和毒素等等分子，既既可增加加抗體片片段的穩(wěn)穩(wěn)定性，又又可發(fā)揮揮某些生生物學(xué)活活性功能能。 用用抗體基基因工程程方法獲獲得的抗抗體與效效應(yīng)分子子交聯(lián)物物比用化化學(xué)交聯(lián)聯(lián)法具有有優(yōu)點：可以大大量生產(chǎn)產(chǎn)，不會會因修飾飾作用影影響抗體體及效應(yīng)應(yīng)分子的的活性，效效應(yīng)分子子還可根根據(jù)需要要進行改改造。 此此外在抗抗體片段段的末端端連接一一段特異異的雙親親性螺旋旋(ammphiiphiilicc heelixxes)結(jié)構(gòu)，如如亮氨酸酸拉鏈結(jié)結(jié)構(gòu)(lleuccinee ziippe

38、er)，可可使單價價的sccFv或或Fabb片段在在體內(nèi)或或體外形形成穩(wěn)定定的雙分分子聚合合體，從從而提高高抗體片片段的親親和力。此此法也可可用于制制備雙特特異性抗抗體。 44基因因工程抗抗體在真真核細胞胞中的表表達 噬菌體表表達的抗抗體片段段常常是是在原核核細胞(E.ccolii)中完完成。原原核系統(tǒng)統(tǒng)表達抗抗體片段段產(chǎn)量高，成本低低，快速速易于操操作。但但抗體片片段在原原核表達達系統(tǒng)中中不能進進行CHH2糖基基化，從從而影響響抗體的的活性。因因此重組組抗體基基因片段段可轉(zhuǎn)移移至適合合的骨髓髓瘤細胞胞系或哺哺乳動物物細胞系系(如CCHO)，甚至至于植物物細胞中中表達，可可以得到到與淋巴巴細胞

39、表表達相同同的抗體體分子。免免疫球蛋蛋白IggA的重鏈和輕輕鏈及分分泌片基基因可以以分別轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化不同同的植株株，將表表達這些些蛋白的的植株進進行有性性雜交，在在雜交后后代中可可以裝配配成完整整的IggA雙分分子。以以植物作作為生物物反應(yīng)器器進行抗抗體的表表達已有有許多成成功的研研究報道道，與動動物細胞胞相比更更為經(jīng)濟濟，具有有廣泛的的應(yīng)用前前景。 四四、催化化性抗體體的制備備 11抗體體催化的的原理 119866年，由由PGGscchulltz和和RAALeerneer分別別領(lǐng)導(dǎo)的的兩個小小組同時時證明抗抗體具有有催化活活性。針針對一個個四面體體帶電荷荷的磷酸酸酯半抗抗原產(chǎn)生生的抗體體，能有有選

40、擇性性地催化化相應(yīng)的的碳酸脂脂和羧酸酸脂的水水解反應(yīng)應(yīng)。他們們將這種種有催化化活性的的抗體稱稱為催化化性抗體體(caatallytiic aantiiboddy)，又又稱抗體體酶(aabozzymee)。催催化抗體體的作用用取決于于底物分分子水解解時的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)(traansiitioon sstatte)(圖75)。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)的的分子結(jié)結(jié)構(gòu)是分分子活化化后的一一種結(jié)構(gòu)構(gòu)狀態(tài)，處處于轉(zhuǎn)換換態(tài)的分分子具有有最高的的活化能能，分子子表現(xiàn)極極性。處處于這種種狀態(tài)的的分子也也是最不不穩(wěn)定的的，能與與這種分分子結(jié)合合的酶或或者抗體體會使某某些化學(xué)學(xué)鍵發(fā)生生斷裂(如酯鍵鍵，碳鍵鍵，胺鍵鍵等)起起到酶解解作用。

41、可可見抗體體酶的作作用與天天然的蛋蛋白質(zhì)酶酶非常相相似?？箍贵w酶也也表現(xiàn)出出對底物物的專一一性，對對立體結(jié)結(jié)構(gòu)的專專一性。在在飽和動動力學(xué)與與競爭性性抑制方方面都與與常規(guī)酶酶相似。所所以抗體體酶的發(fā)發(fā)現(xiàn)打破破了只有有常規(guī)酶酶才有的的分子識識別和加加速催化化反應(yīng)的的傳統(tǒng)概概念，為為酶工程程學(xué)開創(chuàng)創(chuàng)了新的的領(lǐng)域。 22抗體體催化的的化學(xué)反反應(yīng) 由由抗體催催化的化化學(xué)反應(yīng)應(yīng)特異性性高于酶酶，但催催化速率率低于常常規(guī)的酶酶，只有有l(wèi)033106倍。但但有一些些未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)催化劑劑的反應(yīng)應(yīng)，如DDiellsAldder反反應(yīng)也能能被抗體體催化。常常規(guī)酶一一般不能能催化胺胺鍵水解解，抗體體酶能使使胺鍵水水解的

42、速速度增加加25萬萬倍。訖訖今為止止，已發(fā)發(fā)現(xiàn)和證證明的由由抗體催催化的化化學(xué)反應(yīng)應(yīng)不下440種。 33催化化性抗體體的制備備 抗抗體酶是是抗原決決定簇處處于轉(zhuǎn)換換態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)的抗體體。因為為轉(zhuǎn)換態(tài)態(tài)分子極極不穩(wěn)定定無法制制備抗體體，所以以催化性性抗體的的獲得主主要是通通過設(shè)計計穩(wěn)定的的轉(zhuǎn)換態(tài)態(tài)的類似似物作為為半抗原原，與載載體蛋白白交聯(lián)后后，免疫疫動物，獲獲得針對對半抗原原的抗體體，從中中篩選具具有催化化活性的的抗體。篩篩選催化化性單克克隆抗體體所用的的ELIISA與與篩選一一般抗體體的方法法不完全全一樣，應(yīng)應(yīng)根據(jù)催催化反應(yīng)應(yīng)的特點點而進行行適當(dāng)?shù)牡男薷?。?jīng)經(jīng)典的方方法是先先篩選出出與底物物或半

43、抗抗原結(jié)合合的抗體體，然后后從中再再篩選出出有催化化活力的的抗體，這這種方法法費時費費力。利利用催化化性抗體體對底物物的催化化活性，對對底物進進行適當(dāng)當(dāng)修飾，使使催化反反應(yīng)的產(chǎn)產(chǎn)物可直直接表現(xiàn)現(xiàn)抗體的的催化活活性，這這樣可以以簡化檢檢測步驟驟。 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)類類似物半半抗原的的設(shè)計，必必須了解解催化反反應(yīng)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)模模型的結(jié)結(jié)構(gòu)特點點。催化化抗體的的抗原結(jié)結(jié)合位點點上與轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)互互補的某某些催化化基團的的形成，能能穩(wěn)定轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換態(tài)分分子。此此外有人人把單克克隆抗體體分子用用化學(xué)修修飾方法法引入一一些活性性基團，提提高催化化性抗體體的催化化與親和和效率。應(yīng)應(yīng)用噬菌菌體抗體體文庫也也可以篩篩選催化化性抗體

44、體，可省省去制備備轉(zhuǎn)換態(tài)態(tài)類似物物的復(fù)雜雜過程，直直接用底底物從文文庫中篩篩選有催催化活性性的抗體體片段。如如用半抗抗原免疫疫后制備備的文庫庫或文庫庫經(jīng)過多多次混雜雜重組，則則可以得得到更高高的親和和力的催催化性抗抗體?？箍躬毺匦托涂贵w也也用于催催化性抗抗體的制制備，用用酶作為為抗原免免疫小鼠鼠獲得能能夠封閉閉酶活性性位點的的單克隆隆抗體，將將這個抗抗體用蛋蛋白酶除除去Fcc片段，用用Fabb免疫其其他品系系的小鼠鼠或家兔兔，得到到的抗體體具有相相應(yīng)的酶酶催化活活性。 從從理論上上看，BB細胞具具有全套套免疫球球蛋白的的多樣性性的胚系系基因，當(dāng)當(dāng)然也包包括有催催化作用用的自身身抗體在在內(nèi)。然然

45、而19989年年P(guān)auul WW.首次次報道了了人體的的一種能能催化蛋蛋白質(zhì)水水解的免免疫球蛋蛋白。它它是種自身身抗體，能能水解血血管活性性腸肽(vassoacctivve iinteensttinaal ppepttidee，VIIP)的的Glnnl6Mett17鍵鍵。用VVIP作作為抗原原能得到到有催化化作用的的單克隆隆抗體，也也能催化化Glnnl6Mett17鍵鍵。大約約有177的人人有這種種自身抗抗體酶，但但患有氣氣喘的病病人中該該抗體與與VIPP的親和和力比健健康人高高50倍倍。由于于VIPP是一種種氣管松松弛劑，因因此有人人認為這這種VIIP自身身抗體的的長期作作用可能能與氣喘喘的

46、過敏敏應(yīng)答有有一定關(guān)關(guān)系。由由此推測測除了人人工設(shè)計計催化抗抗體以及及發(fā)現(xiàn)的的自身催催化抗體體外，用用篩選單單抗的方方法，也也有可能能找到所所需要的的催化抗抗體。第二節(jié) 抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)原理 抗抗體能特特異性地地識別相相應(yīng)的抗抗原，并并與之結(jié)結(jié)合。這這種結(jié)合合在體外外也能發(fā)發(fā)生，這這種特性性就是許許多免疫疫檢測方方法的基基礎(chǔ)?？箍乖c抗抗體相互互作用是是非共價價的，可可逆的，其其特性符符合許多多化學(xué)反反應(yīng)的基基本原理理。但因因為抗體體分子的的結(jié)構(gòu)特特點，以以及抗原原分子結(jié)結(jié)構(gòu)的多多樣性，使使抗原抗抗體結(jié)合合反應(yīng)表表現(xiàn)出復(fù)復(fù)雜性。 一、抗抗原抗體體作用的的熱力學(xué)學(xué)與動力力學(xué) 11溶液液中抗原原抗

47、體的的化學(xué)平平衡 抗抗體與抗抗原的結(jié)結(jié)合是非非共價結(jié)結(jié)合，二二者在結(jié)結(jié)構(gòu)互補補適應(yīng)的的基礎(chǔ)上上通過范范德華力力(vaan dder Waaals forrce)、靜電電引力、氫氫鍵和疏疏水作用用等次級級鍵相互互作用。因因為結(jié)合合是可逆逆的，結(jié)結(jié)合與解解離的強強度在定條件件下取決決于抗原原與抗體體的親和和力。如如果以SS代表抗抗體結(jié)合合位，即即互補位位(paarattopee)；以以L代表表抗原決決定簇；以SLL代表抗抗原與抗抗體的復(fù)復(fù)合物，則則抗原(Ag)與抗體體(Abb)在溶溶液中的的反應(yīng)如如下： K+ K+AgAbb AggAb 即SL SL K KKSSL/SLK+/ KK 抗原抗體結(jié)結(jié)

48、合形成成的復(fù)合合物的濃濃度為SL，游離離的抗體體結(jié)合位位的濃度度為SS，抗抗原決定定簇的濃濃度為L。在在反應(yīng)早早期復(fù)合合物形成成很快，一一定時間間后逐漸漸慢下來來，直至至復(fù)合物物的形成成與解離離達到平平衡(圖圖76)。此此時抗原原抗體復(fù)復(fù)合物的的濃度SL與游離離抗原表表位的濃濃度SS和游游離抗體體結(jié)合位位的濃度度L之比KK是平衡衡常數(shù)，又又稱為內(nèi)內(nèi)在結(jié)合合常數(shù)，或或稱內(nèi)在在親和力力(inntriinsiic aaffiinitty)。K+和K分別為結(jié)合和解離反應(yīng)速度常數(shù)。 在在恒定的的條件下下，如溫溫度、ppH、離離子強度度等一定定時，KK是一個個常數(shù)。改改變抗原原或抗體的濃度，復(fù)復(fù)合物的的濃

49、度也也相應(yīng)改改變以達達到新的的平衡，在在一定范范圍內(nèi)如如果SS與L增增加2倍倍，則SL應(yīng)該增增加4倍倍，但實實際上會會少于44倍，因因為AggAb復(fù)復(fù)合物的的濃度SL是抗原原抗體的的一部分分。如果果上述濃濃度都以以摩爾濃濃度moolLL表示，則則是K的單位位為濃度度的倒數(shù)數(shù)(Lmoll)。如如抗體的的K在100710122 Lmool為高高親和力力抗體，K低于107 Lmol為低親和力抗體。 如如果以解解離常數(shù)數(shù)(K)描述述抗體的的親和力力，比KK更簡單單方便，KKd為KK的倒數(shù)數(shù)，即KKd11/K，單位位為mool/LL。Kd值越越大親和和力越小小，Kdd越小親親和力越越大。 22抗原原抗體

50、反反應(yīng)的自自由能變變化 抗抗原抗體體反應(yīng)的的自由能能改變與與K相關(guān)：F0RTlnn K，KeF/RT，這這里R摩爾氣氣體常數(shù)數(shù)8.31JJ(mmolK)；T絕對溫溫度；lln自自然對數(shù)數(shù)；e自然對對數(shù)的底底數(shù)；F0標準準的自由由能變化化，規(guī)定定F01mmolSS與1mmol L形成成1mool SSL時自自由能的的變化。負負號表示示自由能能為負的的變化。 從從上式可可以估計計：當(dāng)抗抗原抗體體結(jié)合親親和力增增加l00倍，則則1n110223003，337(3l015KK)時的的F05.94KKJmmol，溫溫度低于于37時F0更小。這這種自由由能變化化還不足足單個氫氫鍵的能能量(約約1881KK

51、Jmmol的的133。即使使親和力力非常高高，K10100Lmool，F(xiàn)0只有55944KJmoll，僅相相當(dāng)于33個氫鍵鍵的結(jié)合合能。當(dāng)當(dāng)抗原與與抗體間間形成氫氫鍵時，水水的氫鍵鍵被破壞壞，因此此每個氫氫鍵的凈凈能接近近于4.18KKJmmol。由由此可見見抗體與與抗原結(jié)結(jié)合時，吸吸力與斥斥力幾乎乎相等，即即使在很很高親和和力下，也也只有幾幾個千卡卡的微小小差別。因因而F的輕微微增加會會導(dǎo)致抗抗原抗體體結(jié)合的的親和力力增高，這這就不難難理解當(dāng)當(dāng)抗原結(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生生某些微微小改變變(如化化學(xué)修飾飾)時，會會引起抗抗原抗體體的親和和力的很很大變化化。自由能對KK的影響響取決于于溫度，然然而自由由能本

52、身身也受溫溫度的影影響： FF 0H 0TS 00H 0 為焓變變，S 00為熵變變，T為絕對對溫度。K隨溫度的變化如下: dlnK /dTT=H 0 / RT2 或ddlnKK/d(1/TT)= H 0 /R 當(dāng)當(dāng)氫鍵和和極性鍵鍵形成時時，較大大的負焓焓變驅(qū)動動放熱，親親和力會會隨溫度度的增加加而下降降。因此此抗原抗抗體相互互作用在在4比在255或37有更高高的親和和力，可可見在給給定的濃濃度下，最最大眼度度的結(jié)合合在較低低溫度下下達到的的。相反反，非極極性或者者疏水的的相互作作用受到到熵的影影響，TTS 00和H 0接近于于零，所所以這時時溫度對對親和力力影響較較小。 33.抗原原抗體反反

53、應(yīng)的動動力學(xué) 抗抗原抗體體反應(yīng)達達到平衡衡時的參參數(shù)測定定在實際際操作時時是困堆堆的。反反應(yīng)完成成90，只需需幾分鐘鐘或幾小小時，而而從900至999則則需幾倍倍的時間間，而欲欲達到99999完成成時所費費時則更更長，因因為此時時的AAg和和Abb已減減少到極極低的水水平。測測定一些些參數(shù)在在反應(yīng)的的早期或或者未到到平衡時時是可行行的，利利用動力力學(xué)可以以計算出出抗原抗抗體反應(yīng)應(yīng)的特征征性參數(shù)數(shù)，用以以描述抗抗原抗體體反應(yīng)的的規(guī)律： K+ Ag（S）Ab(L) AgAAb （SL） K 結(jié)合反應(yīng)速速度KKSLM-1S-1 解解離反應(yīng)應(yīng)速度=K-SLLS-1達到平衡時時，則KK+SLK-SLL

54、KKK+K- KK+K-表明相相同親和和力的抗抗體，其其結(jié)合速速度常數(shù)數(shù)和解高高速率常常數(shù)并不不一致。如如果K+和K-均很大大則抗原原抗體復(fù)復(fù)合物形形成很快快，但不不穩(wěn)定；而K+和K-均小時時抗原抗抗體復(fù)合合物形成較慢，但但很穩(wěn)定定。前者者適合于于親和層層析，后后者適合合于標記記分析。 抗抗原抗體體結(jié)合成成復(fù)合物物后解離離的速度度常數(shù)(K-)取決決于結(jié)合合鍵的強強度。已已知抗體體的親和和力和結(jié)合速速度常數(shù)數(shù)K+，根據(jù)據(jù)動力學(xué)學(xué)基本公公式KK+K-可以計計算解離離常速度度數(shù)K-。例如抗葡萄萄球菌核核酸酶的的抗體對對酶蛋白白抗原的的親和力力是8.3l08Lmool，結(jié)結(jié)合速度度常數(shù)KK+41l05

55、 L(molls)，比比對半抗抗原的結(jié)結(jié)合常數(shù)數(shù)低。由由公式KKK+K-計算得得到K-4.910-44 L(molls)。然然后根據(jù)據(jù)公式tt1/221nn2KK-，計算算半解離離期(hhalfftiime forr diissoociaatioon)，得得到該抗抗體與抗抗原復(fù)合合物的半半解離期期為233minn。了解解抗原抗抗體復(fù)合合物的半半解離期期便可知知道結(jié)合合物在多多大的時時間范圍圍內(nèi)稀釋釋而不影影響結(jié)合合物的解解離，這這對在免免疫親和和層析等等許多其其他免疫疫方法的的應(yīng)用中中有重要要意義。 抗抗原抗體體反應(yīng)的的速度在在很大程程度上取取決于抗抗原分子子和抗體體分子的的擴散速速率及碰碰撞

56、的機機率。擴散速速度常數(shù)數(shù)用下式式表示： Kdll4D(610200) 為抗原原和抗體體分子半半經(jīng)之和和(單位位為cmm)；DD為反應(yīng)應(yīng)系統(tǒng)中中抗原和和抗體分分子的擴擴散常數(shù)數(shù)之和(單位位為cmm2s)；610200為轉(zhuǎn)換換函數(shù)，為為了把單單位轉(zhuǎn)換換為L(mools)。例例如100-6cmm，D107cm2s，KKdl=7.55108L(mmols)。通通常大的的蛋白抗抗原比半半抗原與與抗體結(jié)結(jié)合的速速率要慢慢，大部部分蛋白白質(zhì)的結(jié)結(jié)合速度度在1005106L(mmols)，而而理論上上限為1109 L(molls)。 二二、抗體體與單價價抗原的的作用 11抗體體親和力力的測定定 抗抗體親和和

57、力的測測定的方方法常采采用作圖圖法?？箍乖贵w體反應(yīng)最最簡單的的情況是是單克隆隆抗體與與單價抗原的反反應(yīng)，如如半抗原原與單克克隆抗體體或單克克隆抗體體與大分分子抗原原上單一一的非重重復(fù)的位位點(抗抗原決定定簇)的的作用。以以最簡單單的單克克隆抗體體與半抗抗原反應(yīng)應(yīng)為例的的作圖法法，首先先用平衡衡透析(equiilibbriuum ddiallysiis)(圖77A)來來測定系列游游離抗原原及結(jié)合合抗原的的濃度。根根據(jù)不向向抗原濃濃度進行平衡衡透析所所獲得的的結(jié)合抗抗原，游游離抗原原?？贵w體濃度是是已知的的。根據(jù)據(jù)這些數(shù)數(shù)據(jù)，進進行Scatccharrd分析析，即可可計算出出Ka的的值(圖圖77

58、B)。 SScattchaart分分析方法法是將KKaSL/SSLL分子子和分母母都除以以抗體的的濃度，SL/AAh=r,rr代表每個抗抗體分子子結(jié)合的的抗原(單價)分子數(shù)數(shù)SL/AAb=S/AAb.L(nnr)CC，SS/Ab;表示示每個抗抗體分子子上未被被抗原占占有的游游離抗體體結(jié)合位位的濃度度。這濃度實實際上是是抗體分分子上等等于全部部抗體結(jié)結(jié)合位(n)減減去以被被抗原占占據(jù)了的的結(jié)合位位數(shù)。因因為用的的是單價價抗原，因因此也就就是減去去結(jié)合的的抗原分分子數(shù)rr，即(nr)。這這里的nn實際上上代表抗抗體的價價數(shù)。CC在這里里代表抗抗原的濃濃度LL。由由此得到到公式： 當(dāng)固定抗體體的濃度

59、度用不同同濃度的的抗原進進行一系系列的平平衡透析析實驗，得得到一系系列相應(yīng)應(yīng)的r數(shù)數(shù)據(jù)，然然后根據(jù)據(jù)以r/C對rr作圖。如如果所用用抗體是是均質(zhì)的的（單克克隆抗體體），rr/C與與r的關(guān)關(guān)系為線線性關(guān)系系，它的的斜率即即為親和和力Kaa（圖777BB）。從從公式可可見，當(dāng)當(dāng)抗原的的濃度很很大的rr/C0，所以Ka（nnr）0或KKan=KKar,由由圖77B可可見橫坐坐標r的的截距就就等于抗抗體價nn。2親和力力的異質(zhì)質(zhì)性 當(dāng)當(dāng)與單價價抗原結(jié)結(jié)合的抗抗體是多多克隆抗抗體時，其其Scaatchhardd圖呈非非線性關(guān)關(guān)系(圖圖77B)。由于多克隆抗抗體來源源于多個個細胞克克隆，其其內(nèi)在親親和力不

60、不同。內(nèi)內(nèi)在親和和力的平平均值KKo常用用于表示異質(zhì)的多多克隆抗抗體的親親和力，KKo為抗抗體結(jié)合合位點112被被占據(jù)時時的游離離抗原濃濃度。 33抗體體結(jié)合抗抗原的特特異性半抗抗原反應(yīng)應(yīng)抗體與單價價半抗原原反應(yīng)的的特異性性極強，半半抗原上上化學(xué)基基團的細細小差別別或位置置的改變變，則與與抗體的的反應(yīng)性性會表現(xiàn)現(xiàn)明顯的的差別(圖78)?？箍贵w與同同源抗原原(hoomollogoous anttigeen)反反應(yīng)最強強，與異異源抗原原(heeterroloogouus aantiigenn)反應(yīng)應(yīng)相對較較弱。有有些抗體體與異源源抗原的的反應(yīng)比比同源強強，稱為為變態(tài)抗抗體(hheteeroccli